革兰氏染色标准操作程序

革兰氏染色标准操作规程

1 目的

确保革兰氏染色的正确操作，使革兰氏染色的操作得到有效控制，以提供稳定的实验结果。

2 适用范围

适用于本公司微生物实验室革兰氏染色实验。

3 职责

实验室技术人员应遵循此程序，确保按标准操作规程进行革兰氏染色。

4 程序

4.1革兰氏染色原理

通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层较多且交联致密，故遇丙酮脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故丙酮处理不会出现缝隙，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过丙酮脱色后仍呈无色，再经番红等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。

4.2实验物品

灭菌玻片、接种环、移液器、酒精灯、计时器、显微镜、香柏油、革兰氏染色液等。

4.3实验步骤

4.3.1涂片：取灭过菌的载玻片于实验台上，用移液器吸取10ul待检样品滴在载玻片的中央，用移液器分别吸取10ul金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌位于待检品的两侧（中间要有足够的空间），分别作为阴阳性对照。用无菌接种环将液滴涂布成均匀的薄层，涂布面不宜过大。

4.3.2干燥：将标本面向上，手持载玻片一端的两侧，小心地在酒精灯火焰高处微微加热，使水分蒸发，但切勿紧靠火焰或加热时间过长，以防标本烤枯而变形。

4.3.3固定：固定常常利用高温，手持载玻片的一端，标本向上，在酒精灯火焰处尽快的来回通过2-3次，共约2-3秒种，并不时以载玻片背面加热触及皮肤，不觉得烫为宜（不超过60℃），放置待冷后，进行染色。

4.3.4初染：在涂片薄膜上滴加革兰氏结晶紫试剂1-2滴，使染色液覆盖涂片，染色约1min。

4.3.5水洗：斜置载玻片，用洗瓶小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。

4.3.6媒染：取1-2滴革兰氏碘液滴在涂片薄膜上，使染色液覆盖涂片，染色约1min。

4.3.7水洗：斜置载玻片，用洗瓶小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。

4.3.8脱色：斜置载玻片，滴加革兰氏脱色剂脱色，至流出的脱色剂不现紫色为止，大约需时20-30S，随即水洗。

4.3.9复染：在涂片薄膜上滴加革兰氏番红精复染剂1-2滴，使染色液覆盖涂片，染色约1min。

4.3.10水洗：斜置载玻片，用洗瓶小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。

4.3.11干燥：用吸水纸吸掉水滴，待标本片干后置显微镜下观察。

4.3.12观察：待标本片干后置显微镜下观察，用低倍镜观察，发现目标物后滴一滴香柏油在玻片上，用油镜观察细菌的形态及颜色。

4.4结果判定

显微镜观察由金黄色葡萄球菌制成的标本显示葡萄球状蓝紫色，大肠埃希菌制成的标本显示杆状红色，则实验过程有效。一方不成立则实验结果无效。

此时，如果样品在显微镜下呈蓝紫色，则判定样品菌株为革兰氏阳性菌；如果样品在显微镜下呈红色，则判定样品菌株为革兰氏阴性菌。

4.5实验结束

4.5.1实验结束后，按显微镜使用、维护和保养规程的要求，关闭和清洁显微镜。

4.5.2实验过程中用到的带菌工具，根据工具的不同选择不同的灭菌方式，确保物品丢弃前均已灭菌。

4.5.3实验中用到的载玻片和盖玻片一次性应用，使用前用75%酒精浸泡，清洗干净风干灭菌后应用；使用后灭菌，按废弃物处理程序处理。

5相关文件

5.1 《微生物学教程》第三版周德庆著高等教育出版社

6修订内容