环介导等温扩增技术
第8章环介导等温扩增
扩增分两个阶段
第1阶段为起始阶段，任何一个引物向双链 DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另 一条链就会解离，变成单链。
扩增分两个阶段
上游内部引物FIP的F2 序列首先与模板F2c结合 （如图B所示），在链置 换型DNA聚合酶的作用下 向前延伸启动链置换合成 。
扩增分两个阶段
外部引物F3与模板F3c结 合并延伸，置换出完整的 FIP连接的互补单链（如图 C所示）。FIP上的F1c与 此单链上的Fl为互补结构 。自我碱基配对形成环状 结构（如图C所示）。
F3引物：上游外部引 物(Forward Outer Primer)，由F3区组 成，并与靶基因的 F3c区域互补。
BIP引物：下游内部引物 (Backward Inner Primer )，由B1C和B2区域 组成，B2区与靶基因3’ 端的 B2c区域互补，B1C域与靶 基因5’端的Blc区域序列相同。
B3引物：下游外部引物 (Backward Outer Primer )，由B3区域组成， 和靶基因的B3c区域互补。
2．扩增原理
60—65℃是双链DNA复性及延伸的中间温 度，DNA在65℃左右处于动态平衡状态。 因此，DNA在此温度下合成是可能的。利 用4种特异引物依靠一种高活性链置换DNA 聚合酶。使得链置换DNA合成在不停地自 我循环。
结合。开始链置换合成，解离出的单链核 酸上也会形成环状结构。迅速以3’末端的 B1区段为起点，以自身为模板。进行DNA 合成延伸及链置换．
扩增分两个阶段
第2阶段是扩增循环阶段。 形成长短不一的2条新茎环状结构的DNA，BIP
引物上的B2与其杂交。启动新一轮扩增。且产物 DNA长度增加一倍。在反应体系中添加2条环状 引物LF和LB，它们也分别与茎环状结构结合启动 链置换合成，周而复始。
环介导等温扩增技术在兽医中的应用
提高 疾 病检 测 的效 率和 有效 地控 制疾病 的传 播 。
５ 胚 胎 的性 别 鉴 定
基 于 Ｙ染 色体 上 特 异序 列 的检 测 ， Ｈｉ ｒ ａ ｙ ａ ｍａ等
利用 Ｌ Ａ ＭＰ检 测 牛胚 胎 的性 别 ，显微 切 割 胚胎 活 检
４ 在寄 生虫检测 中的应 用
Ｌ ｉ ａ ｎ ｇ 等同 建立 了溶组 织 内 阿米 巴 Ｌ Ａ ＭＰ检 测法 ，
检 出 限达 到每 个 反 应 管 １ 个 寄生 虫 ，与传 统 的 巢 式 Ｐ Ｃ Ｒ 比较 ，该 Ｌ Ａ ＭＰ法灵 敏度 ９ ２ ％ ，特异 性 １ ０ ０ ％。 Ｐ ｏ ｏ ｎ等［ ８ １ 建立 了恶性 疟 原虫 的 Ｌ Ａ ＭＰ检测 方 法 ， 相 比
［ １ １ Ｎ ｏ ｔ ｏ ｍ ｉ Ｔ ， Ｏ ｋ ａ ｙ ａ ｍａ Ｈ ， Ｍ ａ ｓ ｕ ｂ ｕ ｃ ｈ ｉ Ｈ， ｅ ｔ １． ａ Ｌ ｏ ｏ ｐ － ｍｅ ｄ ｉ ａ ｔ ｅ ｄ ｉ ｓ ｏ ｔ ｈ ｅ ｒ ｍ ａ ｌ ａ ｎ ＇ ｌ — ｐ ｌ ｆｅ ｉ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ Ｄ Ｎ Ａ［ Ｊ 】 ． Ｎ ｕ ｃ ｌ ｅ ｉ ｃ ａ ｃ ｉ ｄ ｓ ｒ ｅ ｓ ｅ ａ ｒ ｃ ｈ ， ２ ０ ０ ０ ， ２ ８ ， １ ２ ： Ｅ ６ ３ ．
２在 细菌检测 中的应用
冯瑜菲等嘲 建立 的产志贺毒素 Ⅱ型变异体 大肠 杆菌 （ Ｓ ｔ ｘ ２ ｅ 大肠 杆菌 ） Ｌ Ａ ＭＰ检测 方 法对 Ｓ ｔ ｘ ２ ｅ大 肠杆菌 的最低检出量为 ３ ８ Ｃ Ｆ Ｕ ／ 管（ Ｃ Ｆ Ｕ是菌落形成 单位 ） ，敏感 性 高 于 Ｐ Ｃ Ｒ方 法 （ ３ ． ８ Ｘ １ ０ ｓ Ｃ Ｆ Ｕ ／ 管） 。 Ｌ Ａ Ｍ Ｐ和 Ｐ Ｃ Ｒ对 模 拟 样 品检 测 结 果 的符 合 率 为 １ ０ ０ ％。可 以检测 出不 同来 源 的 Ｓ ｔ ｘ ２ ｅ 大 肠杆 菌 ， 而 对 不耐热肠毒素、 耐热性肠毒素 、 Ｓ ｔ ｘ ２ ｅ 和大肠杆菌 的检 测 结 果 均为 阴性 。张 静 等【 ３ ］ 利用 Ｌ Ａ ＭＰ法快 速 检测 致 病 性 哈维 氏弧 菌方 法 ， 对 哈 维 氏弧 菌 Ｄ Ｎ Ａ 的最 小 检 出 量为 １ 飞克 ， 比Ｐ Ｃ Ｒ法灵 敏 度高 ３ 个 数量 级 。 选 择 哈 维 氏弧菌 、 副溶 血 弧菌 、 费 氏 弧菌 、 创伤弧菌 、 溶 藻
环介导等温扩增技术
简单，快速，准确的基因扩增法
四、问题分析
1.随机采取鸽子翅或尾部羽髓样，用试剂盒提取DNA
01
2.在家鸽在W染色体上找到保守基因并以LAMP引物设计
02
软件设计引物
3.进行应用LAMP法扩增目的基因、不断优化dNTPs、
03
Mg2+、甜菜碱浓度，反应体系温度，反应结果由紫红色
变为天蓝色为雌性，否则为雄性
80℃水浴，5min，结束反应，加指示剂
LAMP反应体系
三、应用
1、LAMP在食品安全中的应用：
水产品和水体中灿烂弧菌现场可视化环介导等温扩增快检方法的建立及应用；环介导等温扩增 技术快速检测植物蛋白饮料中大豆成分等
2、LAMP在动植物疫病检测中的应用：
环介导等温扩增技术检测鼠疫感染动物敏感性的应用性研究；
感谢各位观看
Thank You
3、LAMP在人类疾病检测中的应用：
环介导等温扩增技术在新型冠状病毒检测中的应用研究进展；环介导等温扩增技术（LAMP） 在肺结核诊断中的应用研究
四、问题分析
生产上的鸽子性别 鉴定主要通过PCR 和翻肛鉴别，不太 适用于养殖户
鉴别方法比较
LAMP法
PCR法
翻肛鉴别
温度 时间 产物量 特异性 检测
试剂
二、原理
设计四条引物，包括两条内引 物和两条外引物，利用DNA链在 60-65℃的恒温条件下处于解链 和退火的动态平衡状态，在DNA 聚合酶的驱动下结合靶序列启 动DNA合成，反应中生成LAMP反 应特有的焦磷酸镁白色沉淀， 运用HNB指示剂显色反应。
二、流程
制作LAMP反应体系，12.5uL，如右图 放入200uL PCR管中，离心混匀 64℃水浴，90min
环介导等温扩增技术
环介导等温扩增技术
无环介导等温扩增技术，又称无环PCR技术（Loop-less PCR），是一种建立在核酸扩增基础上的空洞检测机制，专门用于精确地发现定位特异性核酸条带。
该技术是由德国Max Planck研究所研究员Gero Steinbacher和其同事于2012年提出的。
无环介导等温扩增（LPCR）技术首先引入Gero Steinbacher提出的标记聚合物链反应（MPCR），并且大大地简化了传统偶联反应扩增的整个过程。
该技术主要通过设计两个特殊的引物，一个引物由正向片段和逆向片段组成，另一个引物只由正向片段组成，双方引物由T4 DNA尾端核酸连接而成，这种新颖的结构就是MPCR技术的核心。
该技术的优点在于：
1、空洞检测的结果更加准确可靠；
2、反应涉及的步骤少，整个扩增过程机械性好，易于操作；
3、可以有效提高检测标记特异性核酸信号强度，准确定位检测到特定碱基；
4、可实现环境友好，加快分析过程。
随着医学和生物技术领域对无环介导等温扩增技术的不断进步，该技术在克隆特异性序列，基因检测，基因组分析，病毒鉴定，抗体反应定量，微生物检测等多个领域得到了广泛的应用。
相比于传统的PCR技术，无环介导等温扩增技术拥有更高的检测效率，更简便的操作过程，并且可以有效实现环境友好。
由于该技术具有上述特点，极大地提高了信息的准确性，广泛应用于各种生命科学相关领域。
环介导等温扩增技术简介
环介导等温扩增反应的检测
荧光目视试剂检测
钙黄绿素 Mn2+
DNA聚合酶 扩增反应
dNTPs Mg2+
钙黄绿素
Mn2+ P2O74-
﹣+
焦磷酸锰（白色沉淀）
钙黄绿素（螯合剂）与试剂中的锰离子结合处于淬灭状态，扩增 反应的副产物焦磷酸离子与锰离子结合释放钙黄绿素，淬灭状态解 除，发出黄绿色荧光。
环介导等温扩增反应的检测
具体引物设计信息请参照网页：http://primerexplorer.jp/e/
哑铃状模板构造形成的过程
（1）
FIP
（2）
（3）
F3 Primer
（4） （5）
＋
解离链
（6） 环状结构
BIP
（7）
（8）
＋
解离链
环状结构
B3 Primer
环状结构
循环扩增阶段和延伸循环阶段
环介导等温扩增反应的体系
应用浊度的实时检测
如上图所见，可用分光光度计或浊度计对白色浑浊物（焦磷酸镁） 的浊度进行测定。
LAMP与普通PCR的比较
缺点
灵敏度高，一旦开盖容易形成气溶胶污染，故在进行试剂盒的研发过程
中可采用实时浊度仪，不要把反应后的反应管打开。
引物设计要求比较高，有些疾病的基因可能不适合使用环介导等温扩增 方法。
环介导等温扩增反应的检测
应用浊度检测
﹣+
阴性
阳性
扩增反应会产生一种叫焦磷酸镁的衍生物，此衍生物与生成的扩 增产物成正比，由于目的基因大量扩增同时也产生了大量的衍生物 ，于是出现白色浑浊沉淀（肉眼可见）。
dNTPs DNA Polymerase P2O74- +2Mg2+
环介导等温扩增技术的酶
环介导等温扩增技术的酶环介导等温扩增技术，这名字听着就让人有点头晕，对吧？别担心，不用担心，咱们慢慢聊。
其实它就像是一个能让DNA分子“自我复制”的超级神器，很多时候它比传统的PCR技术更快、更方便、更靠谱。
你知道，PCR这个东西，大家都耳熟能详。
它就像是做菜的高压锅，能把需要的东西集中处理，效率超高，但也有点麻烦——得搞什么温度循环，耗时还长。
但环介导等温扩增技术就不同，它直接在一个温度下进行扩增，反而比PCR来得轻松自在。
所以说，环介导等温扩增技术，核心的利器其实是一种特殊的酶——叫做“Bst聚合酶”。
哈哈，名字是不是有点土，像是个大叔？不过呢，这位“大叔”可不简单。
Bst聚合酶就像是一个超级耐高温的“小机灵鬼”，它能在高温下“安稳”地工作，不会被温度搞得焦头烂额。
它还特别聪明，能帮助我们快速地复制和扩增DNA。
这个“环介导”名字也不简单。
它的意思是，DNA复制过程中，有一个特殊的“环”形结构，把复制过程给稳定住了。
你想象一下，它就像是一个小小的圈圈，把DNA包围住，保证它能够顺利被复制。
简而言之，这种技术不像传统的PCR那样复杂，需要上下温度的波动，而是以恒定的温度，配合Bst聚合酶的“聪明才智”，进行DNA扩增。
至于酶的工作原理嘛，简单来说，Bst聚合酶就像是DNA复印机的“关键部件”。
你想让复印机工作得好，就得给它对的电源、对的纸张，对吧？Bst聚合酶就负责在DNA 链的两端开路，利用“环”结构，把遗传信息一圈圈地复制下来。
它的稳定性超强，就算温度变化，依旧能保持高效工作。
比方说，在45度的温度下，它能保持活力，而传统的酶可能在这个温度下早就“投降”了。
所以啊，环介导等温扩增技术用起来特别“稳妥”，能让我们在短时间内得到大量的DNA片段，真的是“好事成双”。
你可能会想，这玩意儿到底能用在哪儿呢？好啊，告诉你，它简直就是医疗、食品检测等领域的“超能英雄”。
比如在一些突发的疫情中，环介导等温扩增技术可以帮忙快速检测病原体，避免浪费时间。
环介导等温扩增
环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技术依赖于能够识别靶序列上6个特异区域的引物和一种具有链置换特性的DNA聚合酶，在等温条件下可高效、快速、高特异地扩增靶序列。
LAMP的特点：（1）特异性强。
LAMP能从仅相差1个核苷酸的基因标本中，找出相应的靶序列进行扩增。
（2）等温高效。
LAMP在等温条件下扩增，不会因温度改变而造成时间的损失，而且受非靶序列的影响小。
与PCR相比，其检测极限更小，仅为几个拷贝。
（3）耗时短。
在1h内可把靶序列扩增至109倍。
（4）产物易检测。
（5）操作简便。
反应不需PCR仪和特殊试剂。
通过逆转录酶，LAMP即能进行RNA高效扩增。
LAMP因具有高特异性、高效率和快速反应的特点，可以大量扩增所需的靶序列，故被用于病原微生物的检测和传染性疾病的诊断。
LAMP和其他的核酸扩增技术相比，可以在等温条件下，快速、高效、高特异地扩增靶序列。
但是，其引物设计比传统的PCR复杂，而且因为其产物的独特性，为单链DNA的分离增加了难度。
所以，还需要研究出更加有效的分离方法，同时摸索LAMP反应的条件，从引物的长度与浓度、目的序列的大小、茎环结构的大小等方面进行优化，提高扩增效率和特异性。
环介导等温扩增技术原理课堂PPT
基 础 结 构
13
LAMP
环介导的等温扩增技术原理
14
环介导等温扩增过程演示
15
反应时间对LAMP的影响
Effect of reaction time on the LAMP nes1,D NA marker(DL2000) with2000,1000,750 ,500,250 and 100bP:lanes2一 5,LAMP amPlification Produets for 15 min,30min,45min,6 0min,respectively :lane6,without DNA template in the reaction. 乔岩梅. 炭疽芽孢杆菌特征基因恒温扩增检测方法的研究[D]. 中国科学院研究生院（武汉病毒研究所） 2007
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各类等温扩增技术的比较
温度 ℃ 引物
模板
NASBA 42
需要2条 RNA
SPIA 42
1条
RNA
HDA
37/65 需要2条 DNA
SDA LAMP RCA Qβ
37/65 63 37-65 37
不需要 4条 需要 不需要
DNA DNA DNA RNA
其他 反转录酶，RNA酶 H，T7RNA聚合酶 反转录酶，T7RNA 聚合酶 解旋酶，扩增片段 小
F3引物：上游外部引物(Forward Outer Primer)，由F3区组 成，并与靶基因的F3c区域互补。
BIP引物：下游内部引物(Backward Inner Primer )，由B1C 和B2区域组成，B2区与靶基因3’端的B2c区域互补，B1C域与 靶基因5’端的Blc区域序列相同。
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环介导等温扩增原理
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环介导等温扩增技术（LAMP）法扩增
实时浊度检测或目视检测绿色荧光
优缺点
• 优点：灵敏度高（比传统的PCR方法高2～5个数量级）； 反应时间短（30～60分钟就能完成反应）；临床使用不需 要特殊的仪器（试剂盒研发阶段推荐用实时浊度仪）；操 作简单（不论是DNA还是RNA，检测步骤都是需将反应液、 酶和模板混合于反应管中，置于水浴锅或恒温箱中63℃左 右保温30～60分钟，肉眼观察结果）。 • 缺点：灵敏度高，一旦开盖容易形成气溶胶污染，故在 进行试剂盒的研发过程中可采用实时浊度仪，不要把反应 后的反应管打开；引物设计要求比较高，有些疾病的基因 可能不适合使用环介导等温扩增方法。
环介导等温扩增技术
胡星星 20150511 2015.10.20
主要内容
• • • • 定义 原理 操作步骤 优缺点及
定义
环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是指在等 温（60-65℃）条件下，利用链置换DNA聚 合酶短时间（通常<1h）内进行核酸扩增， 是一种“简便、快速、精确、低价”的基 因扩增方法。 其检测结果可直接肉眼观察白色沉淀 或者绿色荧光，是一种适合现场、基层快 速检测的方法。
应用
LAMP 技术因其快速、高效、特异、灵 敏和经济等优点，已经应用于病原菌、寄 生虫、病毒、疾病和转基因产品检测等领 域，并且还将广泛应用于临床诊断、环境 监测、食源安全等领域，具有更
B1末端延伸至形成一个环状构造（F1末端即3’端游 离）；BIP 退火到茎环结构（8’）上，引导链置换DNA 合成反应，产生结构（9’）的产物；随后产物（9’）的 F1末端即3’ 端自动引导链置换DNA 的合成，生成产物 (10’）和茎环结构（8），产物（ 8 ）开始新一轮的循环 扩增。
延伸循环步骤
•
产物(10)和(10’)进入延伸循环步骤，分别 形成(11)和(11’)；内部引物又可以(11)和(11’) 作为模板，引导链置换DNA 的合成，使产物的序 列不断延伸、环化、再延伸，最终的产物是一些 具有不同茎长度茎环结构的DNA 和带有许多环的 折叠结构的DNA 的混合物。
LAMP法实验室常规操作步骤
原理
扩增启动阶段
循环扩增阶段
延伸循环阶段
扩增启动阶段
FIP F3
（5）:有1个环状构造（Fc1末端5’端游离） 的单链
BIP
B3
（8）:有2个环状构造（F1末端即3’端游 离和Bc1末端即5’端游离）的单链
循环扩增阶段
• FIP
F1末端延伸至形成一个环状构造（B1末端即3’端游 离）；FIP 退火到茎环结构（8）上，引导链置换DNA 合 成反应，产生结构（9）的产物；随后产物（9）的B1末 端即3’ 端自动引导链置换DNA 的合成，生成产物(10） 和茎环结构（8’）（与开始的产物（8）序列互补的）；