药物筛选技术的研究进展

综述与编译

药物筛选技术的研究进展

吕秋军综述徐天昊,吴祖泽审校

(军事医学科学院放射医学研究所,北京100850)

摘要:药物筛选是药物发现的主要手段之一,近年来在药物筛选的技术方面发展迅速。本文综述了药物筛选中药靶的发现、化合物样品的选择、超高通量药物筛选技术、高信息量筛选、药代动力学和毒性的高通量筛选、数据分析等方面的进展。

关键词:药物筛选;药物靶标;先导化合物

中图分类号:Q812;R914.2文献标识码:A文章编号:100120971(2003)0320129206

20世纪90年代,药物发现进入工业化时代,人工合成和筛选有限数量的化合物被大规模化合物合成和高通量筛选(high throughput screening,HTS)所取代。人类基因组学计划和蛋白组学研究可望发现大量新药靶,组合化学技术使可供作为药物筛选的化合物数量呈指数级增长,这些成为HTS发展的技术基础。制药企业对新化学实体需求增加并由此带来的投资增多,推动着现有的药物筛选技术迅速发展。另一方面,尽管制药企业投入了巨资进行HTS,新的候选药物上市并未显著增加,这也促使人们对HTS 进行进一步发展和完善。现代药物筛选除通过筛选化合物以便发现对药靶有作用的活性化合物(/hit0)起滤过(filter)作用外,还应用于活性化合物作用选择性、毒性和药代动力学等多方面性质的筛选,在先导化合物的选择和优化等过程中起着重要作用[1]。如国外常通过合成小分子有机化合物库来优化先导化合物,这就需要设计HTS来确定在活性、药代动力学特性和选择性等方面较理想的结构类型。本文对近年来HTS的研究进展进行综述。

1药靶的识别和确证

药靶是指在一种疾病的病理过程中起某种作用的生物分子,是创新药物发现的前提,也是药物筛选的基础。最早的药靶是病原微生物,以此为药靶发现了抗生素。50年代以后药靶主要是受体和酶,如肾上腺素受体及血管紧张素转化酶,由此开发出了一些抗高血压药物。80年代随着分子生物学技术的应用,药靶的发现深入到基因水平。人类和病原微生物的基因组学及功能基因组学研究的开展引发

收稿日期:2002207230了新一轮的药靶发现高潮。药靶的急剧增多,与组合库的应用和制药企业的竞争一起成为HTS发展的主要推动力。药靶的识别(identification)是指采用生物信息学、化学基因组学和芯片等方法及技术发现与疾病相关的生物分子。如利用从结核杆菌的基因组序列得到的信息,克隆和表达涉及细胞壁合成的酶,用来筛选对耐药菌株有活性的化合物或寻找与宿主免疫反应有关的药物以消灭进入潜伏期的结核病[2]。基于生物信息学的方法主要是依据已知药靶分子功能域的结构特征,搜索基因文库,找到具有相同结构特征的基因或序列作为候选药靶。化学基因组学利用对药靶有特异作用的化合物来全面研究基因的功能,寻找与药效密切相关的靶基因[3]。目前,利用基于芯片的表达谱分析而发现的候选药靶分子增多。基因组测序、转录组学和蛋白组学分析是通过检测疾病相关的表达谱以发现药靶。Tanaka 等[4]利用转录组学的分析方法(随机cD NA测序、mRN A展示和差异杂交),研究脑血管痉挛动物模型基因表达变化,发现了脑血管痉挛治疗靶血红素氧化酶(heme oxygenase)21。Celera基因组公司的Ryan 等[5]介绍了基于蛋白组学的工业化规模发现药靶的整个过程,把药靶的发现分为样品准备阶段(包括样品分离和分层)、样品处理阶段1包括二维凝胶电泳或高效液相色谱/质谱的定量分析和凝胶点切割及酶切和(或)串联质谱的识别2及数据分析阶段(包括数据获取及数据的管理和分析)。

良好的药靶是发现性质优良药物的基础。因此,药靶的确认(validation)在整个药物发现过程中至关重要。药靶的确认是指证实疾病病理过程中靶分子的重要性和价值。目前,药靶的确认主要采用

基因敲除、转基因技术、反义技术、抗体、基因突变和生物芯片技术等,在整体动物和细胞水平进行。RNA干扰(RN Ai)技术发展迅速,因为较低浓度双链RNA(dsRNA)即可使靶基因沉默,故其在药靶确认方面应用越来越多[6]。药靶的确认首先是要了解候选药靶分子的生理作用,再明确其在疾病的发生和发展过程中的作用,最后证明阻断或激活候选药靶分子将产生有益的治疗效果。如神经性疼痛被认为是损伤部位钠离子通道功能异常所致。通过鞘内给予靶向河豚毒素抗性的钠离子通道Na V1.8的特异反义寡核苷酸,可以降低相应神经元的钠电流,减轻神经损伤引起的神经性疼痛,证实了NaV1.8可以作为治疗神经性疼痛的特异性分子靶[7]。

2化合物样品的选择

化合物样品与药靶、筛选模型一样是药物筛选体系的重要组成部分。随着药物筛选新技术的出现,如超高通量筛选(uHTS)药物、组合化学和基因组测序等,天然产物(natural product,NP)在先导化合物产生中的重要性越来越不被人们重视,一些制药企业(如Abbott和Pfiz er公司)早已终止对NP的研究,在21世纪从NP发现新药有可能被边缘化。其原因可能有:通过传统的活性导向NP分离和筛选周期长且费用高,很难得到纯的NP,已知结构重复发现等。但在1983~1994年被FD A批准的新药中,39%来自NP或是衍生的NP,如抗生素、免疫抑制剂、抗肿瘤药和调节血脂药物。在2000年销售最好的20个非蛋白药物中,有9个来自NP。另外,NP 是目前蛋白质功能研究的有用工具。制药企业为保持每年10%的增长率及缩短确定先导化合物的周期,需要利用HTS技术从数量巨大、结构多样的化合物库中进行筛选。而NP的主要优点为其结构的多样性,因此,通过采用新方法和新技术最终将会使NP成为供药物筛选用化合物样品的主要来源。

筛选天然药物的一个重要变化是从活性导向的提取筛选转向纯化合物筛选,即不依赖于活性化合物的分离和筛选。1998年Rho^ne2Poulenc Rorer公司认识到发现的药靶越来越多,活性导向的分离过程与筛选不相适应,故决定放弃对提取物的筛选,而采用对纯化合物进行筛选以发现先导化合物的策略[8]。与此同时,A nalytiCon Discovery与A ventis合作进行一项试验,旨在18个月内建立含4000个纯度高、不重复的来自微生物和植物的NP库。库内每个化合物超过5mg,纯度\80%,其中10%的化合物进行完全结构解析。结果表明,利用现有的分离技术和高通量结构解析方法,在几个月内可以建立含几千个纯NP的化合物库,化合物具有高度的结构多样性,与合成化合物的结构显著不同,39%的化合物为新化合物,79%的化合物分子量为0.2~0.7 ku,适合于药物筛选。对库中60%的化合物针对9个不同药靶进行了HTS,结果发现阳性率极高(9次检测5次阳性),进行再次筛选阳性率高于或接近于对合成纯化合物库筛选的结果。这至少说明N P和合成化合物同样可以是现代药物筛选的化合物来源。尽管利用纯化N P进行HTS,早期的化合物分离和纯化的投入会很大,但从筛选到先导物确认的过程会很快,费用显著降低。从提取物筛选到纯化合物筛选仅是NP复兴的第一步,将来通过对潜力巨大的生物合成基因的深入研究,利用组合生物合成产生大量的NP将会对药物发现产生更为重要的影响。

研究型制药企业库存的化合物一般有20~100万个,加之逐年合成新的化合物,如果对每一个化合物进行多个模型的筛选,将会使药物筛选的成本较高。因此,一些制药企业尝试采用每次对3~10个化合物的混合物(compound pooling)进行筛选,以降低成本,但需要对阳性结果进行解析,以确定混合物中有活性的化合物[9]。

3超高通量筛选

一般将每个工作日检测次数>105、反应体积[ 10L L、在高密度(\1536孔)检测板中进行的药物筛选认为是uHTS。uHTS采用微量化技术、灵敏的信号检测方法、多种板样式、自动化样品传送系统和数据管理系统,因而具有高效、成本效益比合理的特点。

微量化技术是实行uHTS的关键。已建立的生化检测方法须易于微量化以缩短整个筛选周期和降低成本,如基于芯片的实验室系统高度微量化,检测体积达pL水平,流通量每日超过10万次检测。检测微量化是一个建立合适于检测条件、使用高密度孔板、提高流通量、同时减少试剂和样品消耗的过程。但检测微量化需解决以下几方面问题:(1)液体处理系统的精确性;(2)蒸发效应最小化;(3)检测灵敏度可变性;(4)蒸发表面与体积比增强吸附效应;

(5)试剂的稳定性、酶反应动力学、细胞沉积和存活