分子生物学实验 PCR-RFLP检测NQO1 C609T多态性

GGATCC CCTAGG NhomakorabeaGTC GAC CAG + CTG
G + GATCC G CCTAG
平端切口
粘端切口
NQO1基因C609T（rs1800566）
NQO1基因C609T（rs1800566）
NQO1基因C609T（rs1800566）
本实验利用盐析法提取口腔拭子DNA， PCR扩增后用Hin fⅠ酶切，琼脂糖凝胶电泳 分析NQO1基因C609T多态性。 盐析法提取口腔拭子DNA是用细胞裂解液 和蛋白酶K消化裂解口腔黏膜上皮细胞，使其释 放DNA，然后用浓盐沉淀蛋白质并通过离心去 除蛋白质，再用异丙醇沉淀DNA，最后经70％ 乙醇洗涤后得到DNA。
PCR扩增
反应体系（20 μl）： 2×Taq master mix 模板 引物（F＋R） 灭菌去离子水 离心后放PCR仪扩增(注意盖子)
10.0 μl 1.0 μl 0.8 μl 8.2 μl
反应条件： 94℃ 94℃ 60℃ 72℃ 72℃ 5min 20s 20s 20s 5min
35个循环
PCR-RFLP
PCR (polymerase chain reaction) 聚合酶链式反应 RFLP (restriction fragment length polymorphism)
限制性片段长度多态性
限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶 (restriction 围切割双链DNA的一类内切酶。
2%琼脂糖凝胶电泳
酶切
10×FastDigest Green Buffer PCR产物 FastDigest Hin fⅠ 灭菌去离子水 1 μl 5 μl 1 μl 9 μl
混匀离心后37℃酶切 10min
GAAGCCCAGACCAACTTCTGTTGTTTATAGTACAACT GCATGGAATTGGTTGACTTACCTCTCTGTGCTTTCTG TATCCTCAGAGTGGCATTCTGCATTTCTGTGGCTTCC AAGTCTTAGAA[Y]CTCAACTGACATATAGCATTGGG CACACTCCAGCAGACGCCCGAATTCAAATCCTGGAA GGATGGAAGAAACGCCTGGAGAATATTTGGGATGA GACACCACTGTATTTTGCTCCAAGCAGCCT Y=C或T
gnl|dbSNP|rs1800566|allelePos=501|totalLen=1001|taxid=9606|snpclass=1|alleles='C/T'|mol=Genomic|build=147 AGTGGAAGCC GCAATGAGCC GAGATCGTGC CATGGCACTC CAGCCTGGAC GACCGAGCGA GACTCTGCCT CAAAAAAAAA AAAAAAAAGA AAAAGAAAAA AAGGACTCAT CTAGTTATAT GGAGAGGCAG AGAAATGCAC CCACGCAGGT CTTGGTGAGT CACCTGCCAA GAAACTGAGA CTCCCTAAAG TAACAGAACT TCCAGCCTTC TTGGCAAAGG ATCCAGGTTG GCACAGTTTC AAGGTTTATG CATTTAAAGA AGAACACACC TGAGAAGGCT AAAATTGGTA ACGGCTAGGT AGAGGGTAAG AGAGAGACGC TAGCTCTGAA CTGATTCTCT AGTGTGCCTG AGGCCTCCTT ATCAGAGTGT CTTACTGAGA AGCCCAGACC AACTTCTGTT GTTTATAGTA CAACTGCATG GAATTGGTTG ACTTACCTCT CTGTGCTTTC TGTATCCTCA GAGTGGCATT CTGCATTTCT GTGGCTTCCA AGTCTTAGAA Y CTCAACTGAC ATATAGCATT GGGCACACTC CAGCAGACGC CCGAATTCAA ATCCTGGAAG GATGGAAGAA ACGCCTGGAG AATATTTGGG ATGAGACACC ACTGTATTTT GCTCCAAGCA GCCTCTTTGA CCTAAACTTC CAGGCAGGAT TCTTAATGAA AAAAGAGGTA CAGGATGAGG AGAAAAACAA GAAATTTGGC CTTTCTGTGG GCCATCACTT GGGCAAGTCC ATCCCAACTG ACAACCAGAT CAAAGCTAGA AAATGAGATT CCTTAGCCTG GATTTCCTTC TAACATGTTA TCAAATCTGG GTATCTTTCC AGGCTTCCCT GACTTGCTTT AGTTTTTAAG ATTTGTGTTT TTCTTTTTCC ACAAGGAATA AATGAGAGGG AATCGACTGT ATTCGTGCAT TTTTGGATCA TTTTTAACTG ATTCTTATGA TTACTATCAT GGCATATAAC CAAAATCCGA CTGGGCTCAA GAGGCCACTT AGGGAAAGAT
单核苷酸多态性 ( single nucleotide polymorphisms ,SNPs)，
是指群体基因组DNA特定的核苷酸位置上， 不同个体之间存在2种或2种以上不同碱基，形 成DNA序列多态性，其中低频率的等位基因在 群体中的频率不小于1%。
SNPs分类
非同义SNPs 编码区SNPs 同义SNPs 内含子区SNPs 调控区SNPs
GAAGCCCAGACCAACTTCTGTTGTTTATAGTACAACT GCATGGAATTGGTTGACTTACCTCTCTGTGCTTTCTG TATCCTCAGAGTGGCATTCTGCATTTCTGTGGCTTCC AAGTCTTAGAA[Y]CTCAACTGACATATAGCATTGGG CACACTCCAGCAGACGCCCGAATTCAAATCCTGGAA GGATGGAAGAAACGCCTGGAGAATATTTGGGATGA GACACCACTGTATTTTGCTCCAAGCAGCCT Y=C或T
PCR-RFLP检测NQO1 C609T多态性
【学习目的要求】
（一）掌握盐析法快速DNA抽提法的原理。 （二）掌握PCR-RFLP分型SNP的原理。 （三）熟悉盐析法快速DNA抽提法的操作技术。 （四）了解单核苷酸多态性的常用分型方法。
【实验教学内容】
（一）实验原理 （二）实验操作
（一）实验原理
Hin fⅠ
G ANTC
2%琼脂糖凝胶电泳
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M
1: 2: 3:
CT 基因型
TT 基因型
G ANTC × G ANCC
CC 基因型
Bam HⅠ GGATCC CCTAGG
endonuclease,
RE)是识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其周
G GATCC + CCTAG G
Ⅱ类酶识别序列特点—— 回文结构(palindrome)
GGATCC CCTAGG 切口：平端切口、粘端切口
HindⅡ
Bam HⅠ
GTCGAC CAGCTG
单核苷酸多态性的常用分型技术 单链构象多态性、RFLP (restriction fragment length polymorphism，限制性片段长度多态性)，变性梯度凝 胶电泳、温度梯度凝胶电泳、变性高效液相色谱、单 碱基延伸、高分辨率熔解曲线、DNA测序等，它们都 是在对目的SNP扩增的基础上对PCR产物进行分析。
（二）实验操作
盐析法提取口腔拭子DNA
1、清水漱口，灭菌棉签擦拭颊粘膜10次。 2、将拭子放入1.5 ml 离心管中，加入裂解液400 μl、蛋白酶K 20 μl，搅动使拭子上口腔黏膜上皮细胞脱落，折断拭子（棉 花部分留在离心管中）。 3、将离心管放入65℃恒温水浴箱30 min，期间摇动数次。 4、取出离心管瞬时离心，加入200 μl 5M Nacl，充分混匀。瞬 时离心，将离心管内液体尽量转移到新的离心管中。15000rpm ×5 min，将上清转移到新的离心管中。 5、加入等体积异丙醇，充分混匀。15000 rpm×5 min，弃上 清。沉淀加1.0 ml 70%乙醇洗涤1次，15000 rpm×5 min， 弃上清。 6、瞬时离心，吸出管底乙醇，加入DNA溶解液50 μl。