羊种布鲁氏菌的分离鉴定及其ugpB基因的原核表达

丁美洲部分地区[3]。在我国布鲁氏菌病最主要的 致 病原也是羊种布鲁氏菌[4]，近几年，羊种布鲁 氏菌 在我国局部地区也有分离的报道 。 [5-8]
随着世界贸易市场的不断拓宽，世界优势品种 动物流通和交流逐步加深，布鲁氏菌病的人畜疫情 在我国和世界部分国家和地区均出现了回升势头，该 病已成为世界范围内严重的公共卫生问题之一[9]，给 畜牧业生产带来严重的经济损失，仅新疆地区每年因 布鲁氏菌病引起流产、空怀等少生幼畜达 100 万头～
ZHANG Hui1,2, CHEN Chuang-fu1,2*, WANG Yuan-zhi3, SHENG Jin-liang2, REN Yan2, GUO Fei2
(1. Key Laboratory of Xinjiang Endemic and Ethnic Disease, Shihezi 832003, China; 2. College of Animal Science and Technology of Shihezi University, Shihezi 832003, China; 3. College of Medicine of Shihezi University, Shihezi 832003, China)
第 31 卷 第 5 期 2009 年 5 月
中国预防兽医学报
Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine
Vol. 31，No.5 May 2009
羊种布鲁氏菌的分离鉴定及其 ugpB 基因的原核表达
张 辉 1，2，陈创夫 ， 1，2* 王远志 3，盛金良 2，任 艳 2，郭 飞 2
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中国预防兽医学报
2009 年
1.9 重组融合蛋白 ugpB 的诱导表达及检测 将检 测正确的阳性重组菌接种 10 mL LB 液体培养基，培 养过夜。次日按 2 %的接种 LB 液体培养基，37 ℃培 养至 OD600nm=0.6 左右时，加入终浓度为 1 mmol/L 异 丙 基 硫 代 半 乳 糖 苷 (IPTG) 进 行 诱 导 表 达 。 分 别 于 2 h、3 h、4 h、5 h、6 h 取样，各 1.5 mL 离心，取 沉 淀 的 菌 体 ， 进 行 SDS-PAGE 电 泳 分 析 、 western blot 分析；并利用凝胶成像软件 LabWorks 对表达蛋 白占菌体蛋白的含量进行分析，剩余部分菌液离心， 用于重组融合蛋白纯化。 1.10 重组蛋白的 Ni- NTA 亲和纯化 重组融合蛋 白 纯 化 用 QIAGEN 公 司 Ni-NTA Agarose 试 剂 盒 完 成，操作按试剂盒说明书进行。将沉淀的菌体重悬 于 5 mL Buffer B 中，超声破碎 - 冻溶处理 4 次；超 声 破 碎 每 次 10 s， 间 歇 15 s， 10 次 / 周 期 。 4 ℃ 12 000 r/min 离心 30 min，收集上清，加入用 Buffer B 平衡过的 Ni-NTA 琼脂糖珠，4 ℃轻柔震荡 30 min； 用漂洗缓冲液 Buffer C、D 依次清洗 Ni-NTA 琼脂糖 珠；最后用 Buffer E 对 Ni-NTA 琼脂糖珠进行洗脱， 收集洗脱液，进行 SDS-PAGE 电泳检测。
轮 PCR 加 样 量 ： 10 × 缓 冲 液 5 μL， dNTP 4 μL， Taq 酶 2.5 μL，SP1 和 SP2 各 1.5 μL，模板为第一轮 的稀释物 2 μL，超纯水 33.5 μL。
PCR 的 反 应 条 件 ： 第 一 轮 反 应 ： 95 ℃ 3 min， 94 ℃ 80 s，55 ℃ 50 s，72 ℃ 50 s，35 个循环，72 ℃ 10 min。第二轮反应：95 ℃ 3 min， 94 ℃ 30 s，57 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，35 个循环，72 ℃ 10 min。 1.5 生化鉴定 将经过细菌群体、个体形态观察及 PCR 检测后，初步判定为布鲁氏菌阳性的菌株严格 按 《可感染人类的高致病性病原微生物菌(毒)种或 样本运输管理规定》 送交中国疾病预防与控制中心 传染病预防控制所布鲁氏菌病组进行细菌学鉴定。 1.6 羊种布鲁氏菌新疆 027 株 ugpB 基因的克隆 根据 GenBank 中登录的布鲁氏菌(登录号：3827694) ugpB 基 因 序 列 ， 用 Primer5.0 软 件 进 行 引 物 设 计 ， 引物序列为：P1：5'-GATATCATGTTCACCCGTCTG ATCAC-3'； P2： 5'-GTCGACTTATTGAGCTGCGGC GATT-3'。
(1. 新疆地方与民族高发病教育部重点实验室，新疆 石河子 832003； 2. 石河子大学 动物科技学院，新疆 石河子 832003；3. 石河子大学 医学院，新疆 石河子 832003)
摘 要：对新疆某羊场流产胎儿进行布鲁氏菌病原分离、培养，采用细菌群体形态观察、PCR、生化试验进
行鉴定，结果分离得到了羊种布鲁氏菌生物 3 型，命名为 027 株。应用常规分子生物学方法克隆羊种布鲁氏菌生
Key words: Brucella melitensis; isolation; identification; ugpB gene; protein purification
布鲁氏菌病是一种严重危害人和家畜的世界 性、多宿主感染的细菌性慢性传染病，病原为布鲁 氏 菌 [1]， 根 据 布 鲁 氏 菌 的 细 菌 学 特 征 和 感 染 宿 主 的 偏爱性，布鲁氏菌属分为 6 个种，即羊种布鲁氏菌， 牛种布鲁氏菌，猪种布鲁氏菌，犬种布鲁氏菌，绵 羊 附 睾 种 布 鲁 氏 菌 和 沙 林 鼠 种 布 鲁 氏 菌 [2]。 其 中 羊 种布鲁氏菌流行最为广泛，成为引发布鲁氏菌病的 典型菌株，是世界范围内危害人、畜健康的重要病 原菌，该菌广泛分布于地中海沿岸国家、西亚及拉
Abstract: A Brucella isolate was isolated from aborted fetuses at a sheep farm in Xinjiang and characterized by PCR, biochemical assays. The result showed that the isolate belonged to Brucella melitensis biovar 3, and named Brucella melitensis 027. The ugpB gene of 027 strain was cloned into prokaryotic expression vector pET-32a (+) and transformed into E.coli BL21 (DE3) cells. Expression of the fusion protein ugpB was induced by IPTG and confirmed by SDS-PAGE and western blot.
PCR 反应的体系：10×反应缓冲液(含 15 mmol/L MgCl2) 2 μL，dNTP (各 2.5 mmol/L) 0.8 μL，上游引 物 P1 (25 μmol/L) 0.3 μL，下游引物 P2 (25 μmol/L) 0.3 μL，模板 0.5 μL，Taq 酶 0.75 u，补水至 20 μL； PCR 反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 50 s，53 ℃ 40 s， 72 ℃ 90 s，30 个循环；72 ℃延伸 10 min。PCR 产 物进行 2 %琼脂糖凝胶电泳分析。 1.7 pGM- T- ugpB 克 隆 载 体 的 构 建 及 鉴 定 将 纯 化的 PCR 产物与 pGM-T 载体 16 ℃过夜连接。连接 产 物 用 化 学 转 化 法 转 化 E.coli JM109 感 受 态 细 胞 。 转化后的 JM109 细胞涂于含 X-gal 和 IPTG 的氨苄抗 性 LB 固 体 培 养 基 上 ， 37 ℃ 培 养 ， 进 行 蓝 白 斑 筛 选。对阳性克隆进行培养，提取质粒，用 PCR 方法 和限制性内切酶 EcoRⅤ和 SalⅠ双酶切方法鉴定重 组质粒，对鉴定正确的质粒送上海生工生物工程有 限责任公司进行 DNA 测序分析。 1.8 pET- ugpB 原核表达载体的构建及鉴定 分别 将 pET-32a (+)质粒和 pGM-T-ugpB 质粒用限制性内切 酶 EcoRⅤ和 SalⅠ双酶切，分别回收 pET-32a (+)载 体片段和 ugpB 基因片段。将两个基因片段连接。连 接产物转化 E.coli BL21 (DE3)感受态细胞。转化后 的 BL21 细胞涂于含氨苄抗性的 LB 固体培养基上， 37 ℃培养。挑取单菌落进行培养，提取质粒，用 PCR 方法和限制性内切酶 EcoRⅤ和 SalⅠ双酶切鉴定。
Agarose 试剂盒进行蛋白纯化，获得了纯化的融合蛋白。
关键词：羊种布鲁氏菌；分离；鉴定；ugpB 基因；蛋白纯化
中图分类号：S852.614
文献标识码：A
文章编号：1008-0589(2009)05-0356-05
Isolation and identification of Brucella melitensis and prokaryotic expression of its ugpB gene
1 材料和方法
1.1 材料与菌株 新疆石河子地区某养羊场绵羊流 产胎儿 1 只，24 h 内采集流产胎儿新鲜病料。大肠 杆菌感受态细胞 E.coli JM109、E.coli BL21 (DE3)和 表达载体 pET-32a (+)为本室保存。pGM-T 载体试剂 盒购自北京天根生化科技有限公司。 1.2 主 要 试 剂 T4 DNA 连 接 酶 、 Taq DNA 聚 合 酶 、 DNA Marker、 辣 根 过 氧 化 物 酶 标 记 兔 抗 羊 HRP-IgG、western blot 膜封闭液、增强型 HRP-DAB 底物显色试剂盒均购自天根生化(北京)科技有限公 司；DNA 回收试剂盒购自北京百泰克生物技术有限 公 司 ； 限 制 性 内 切 酶 EcoR Ⅴ 、 Sal Ⅰ 购 自 Progema 公司；琼脂糖、硝酸纤维素膜及蛋白质 Marker 购自 上海生物技术工程有限公司；Ni-NTA 纯化试剂盒购 自 QIAGEN 公司；布鲁氏菌阳性血清、阴性血清均 由新疆地方与民族高发病教育部重点实验室提供。 1.3 细菌分离 取绵羊流产胎儿胃内容物接种于血 琼脂培养基，37 ℃，10 % CO2 环境条件进行细菌 培养。12 h、24 h、36 h、72 h、82 h 进行细菌群体 形态观察，菌落形成后采用改良萋 - 尼染色法进行细 菌个体形态观察，初步鉴定出布鲁氏菌阳性的菌落。 1.4 PCR 检测 将初步鉴定为阳性的菌落进行纯化 培 养 ， 接 种 少 许 菌 落 于 0.5 mL 超 纯 水 中 ， 煮 沸 15 min，制成细菌悬液，作为 PCR 模板。采用巢式 PCR 鉴 定 ， [10] 引 物 序 列 为 ： LP1： 5'-TGATGGGAG GGACCGACTA-3'；LP2：5'-TGGTTCTTCAGGTTGTT ACGC-3'；SP3：5'-CGTCTTCCAAATTCCCAAGC-3'； SP4：5'-AAGCGGGTCACGCCATAA-3'。