酶活力的测定
酶活力测定
酶活力测定
酶是一种能够催化生物体内化学反应的蛋白质，广泛存在于动植物、微生物、真菌等
生物体内。
酶在生理代谢、免疫系统、消化系统等方面扮演着重要的角色。
因此，对于酶
的活力测定十分重要。
下面将详细介绍酶活力测定方法。
酶活力测定的基本原理是通过测定一个给定反应体系下酶所催化的底物转化速度来确
定酶的活力。
酶活力的测定通常采用标准曲线法、比色法、荧光法、放射性同位素标记法、酶电极法等多种方法。
其中，比色法和荧光法是最为常用的两种方法。
二、比色法
比色法是通过反应体系中某一底物和产物的比色反应来测定酶的活力。
常用的比色反
应有蛋白质和氨基酸比色法、尿素酶测定法等。
以蛋白质和氨基酸比色法为例，其测定步骤如下：
1. 选定底物，例如眼镜蛇毒素，反应物为酸性的巴氏液
2. 选定测定时点，例如反应20分钟之后
3. 加入颜色试剂，例如Folin验液，使反应产生深色络合体
4. 测定吸光度，根据标准曲线计算出反应深度，从而计算出酶的活力值
三、荧光法
荧光法是通过酶催化的底物转化产生的荧光信号来测定酶活力。
荧光法具有高灵敏度、高精度、高速度、低误差等优点，越来越受到人们的关注。
1. 选择荧光素为底物，荧光素在激发光的作用下会发出荧光信号
2. 酶催化荧光素转化为羟基荧光素，生产出更强的荧光信号
四、注意事项
酶活力测定的过程中需要注意以下几个方面：
1. 选择适当的反应体系、底物和试剂
2. 在测定前保持合适的反应条件（例如pH、温度等）
3. 为了获得比较准确的测定结果，需要进行多次测定
4. 保证测定设备和试剂的质量和准确性。
酶活性的测定
式中
A—对照KMnO4滴定毫升数； B—酶反应后KMnO4滴定毫升数；
VT—酶液总量（ml）； V1—反应所用酶液量（ml）;
W—样品鲜重（g）；
1.7mg
1.7—1ml H2O2。
0.1mol/L旳KMnO4相当于
紫外分光光度法:
H化测2O氢量2在，吸2使光40反率nm应旳波溶变长液化下吸速有光度强度即烈可(吸A测2收40出)，随过过反氧氧应化化时氢氢间酶酶而旳能降活分低性解。。过根氧据 以1min内A240降低0.1旳酶量为1个酶活单位（u）。
硫酸盐缓冲液，盐酸羟胺，黄嘌呤，黄嘌 呤氧化酶，醋酸等。
试验环节：
计算措施：
每毫升反应液中SOD 抑止率达50％时相应 旳SOD 量为一种SOD 活力单位（U），待测 样品中旳SOD 活力由下式计算：
SOD克制率（％）＝（A2-A1）/A2×100% SOD 活力（U/ml）＝（A2-A1）
据此，可根据H2O2旳消耗量或O2旳生成量测定该酶活力大小。 在反应系统中加入一定量（反应过量）旳H2O2溶液，经酶促反 应后，用原则高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多出旳H2O2
。
即可求出消耗旳H2O2旳量。
酶表活达性 ：用每克鲜重样品1min内分解H2O2旳毫克数
酶活(mgH2O2/gFW·min)=
测定茶树鲜叶APX活性旳最佳条件
PVPP旳加入量为鲜叶重旳1.5倍，提取液pH 为7.8，反应液pH为7.0，底物AsA浓度为 0.5mmol/L。
注意事项：
（1）因为测定反应是经过加液量控制在60s内，使产生旳A290光值下 降呈良好旳线性关系。
1.试剂： 0.1mol/L Tris-HCl 缓冲液
(pH8.2
酶活性的测定方法
酶活性的测定方法
酶活性的测定方法有多种。
以下列举了常见的几种方法：
1. 酶动力学法：通过测定酶催化底物转化为产物的速率，来确定酶活性。
常用的酶动力学方法有初始速率法、双重倒数法、利用酶反应速率与底物浓度的关系等。
2. 比色法：利用酶与底物反应后产生的色素变化进行酶活性测定。
例如，过氧化物酶活性可通过测量其催化产生的有色产物浓度的变化来确定。
3. 荧光法：利用酶与底物反应后产生的荧光变化进行酶活性测定。
荧光法的灵敏度高，操作简便。
例如，酯酶活性可通过测量底物转化为产物后产生的荧光强度的变化来确定。
4. 放射性同位素法：将放射性同位素标记在底物上，通过测量酶催化底物与同位素的结合来确定酶活性。
例如，放射性同位素法可用于测定DNA聚合酶活性。
5. 电化学法：利用酶与底物反应后产生的电流变化进行酶活性测定。
常用的电化学方法包括循环伏安法和电化学阻抗法。
例如，葡萄糖氧化酶活性可通过测量产生的电流与葡萄糖浓度之间的关系来确定。
值得注意的是，不同酶具有不同的理化性质和催化机制，因此需要根据具体酶的
特性选择适合的测定方法。
ABTS法测酶活
ABTS 法测酶活
1、先配制0.1mol/L 的醋酸-醋酸钠缓冲液（pH =4.0）；
2、再配制0.5mmol/L 的ABTS ；（0.5mmol/L ABTS ：0.27434g ABTS 加入到1L 纯水中溶解即可。
（分子量为548.67））
3、在无菌的环境中提取1mL 的粗酶液，放入EP 管内；
4、用离心机对其离心（8000转2分钟），取上一定量的上清液，用醋酸-醋酸钠缓冲液进行稀释一定的倍数；
5、取一定量的ABTS 试剂，和稀释后的酶液分别在不同的试管内进行水浴（40℃，10min ）；也将比色皿冲洗干净放在干燥箱里，温度调到40℃；
6、尽量保持在40℃的温度下混合ABTS 和稀释后的酶液（比例1:1），当两种液体混合时开始计时，记录下第30s 和90s 两个时间点分光光度计的显示数（λ=420nm ）；
7、定义1 个酶活力单位用每分钟1μmol 的ABTS 被转化所需的酶量。
（原理是ABTS 被Lac 氧化，氧化产物的消光系数ε为3.6×104（mol/L ）-1·cm -1），所以酶活的换算按照下列公式：
t 10
6.31043
∆∆⨯⨯⨯D 酶液总体积反应液总体积。
酶活力的测定方法
酶活力的测定方法
酶活力咋测？嘿，有办法。
先准备好材料，就像要去打仗得有武器。
然后按照步骤来，可不能瞎搞。
注意啥呢？温度得控制好呀，不然酶活性乱了套，那可完蛋啦。
还有时间也得把握准，就像做饭不能糊了锅。
安全不？只要你操作规范，没啥问题。
就像走路走得稳就不会摔跟头。
稳定性嘛，只要条件控制好，结果就比较靠谱。
就像盖房子基础打好就不会歪。
啥时候用这方法？做实验、研究的时候呗。
优势可不少呢，能知道酶有多厉害，就像给酶做个体检。
我见过人家测酶活力，那数据准得很。
就像神枪手打靶，百发百中。
测酶活力有门道，弄好了超棒。
你还等啥呢？赶紧试试吧！。
05-01-024常规测定酶活力的步骤(精)
天津现代职业技术学院
常规测定酶活力的步骤
酶活力测定一般包括两个阶段：首先，在一定条件下将酶与底物混合反应一段时间；然后，测定反应液中底物或产物量的变化。
常规测定酶活力的步骤如下：
1)酶液的稀释
2)选择合适的底物
3)确定酶促反应的最适条件
根据资料或试验结果，确定酶促反应的最适条件，包括底物浓度、最适温度、最适pH、适当稀释的酶液和严格的反应时间，抑制剂不可有，辅助因子不可缺。
有些酶促反应，要求有激活剂等其它条件，应根据需要适量添加。
4）反应时间必须准确
反应体系必需预热至规定温度后，加入酶液并立即计时，达到反应时间后，应立即灭酶活性，终止反应的进行，并记录终了时间。
5）反应量的测定
测底物减少量或产物增加量均可。
因为酶促反应底物的浓度一般都很高，少量底物的消耗量较难测准；而产物则是从无到有，变化明显，测定较为灵敏准确，所以，一般大都测定产物的增加量即生成量。
1。
酶活性测量的方法有哪几种
酶活性测量的方法有哪几种酶活性测量是评估酶在特定条件下，催化底物转化为产物的能力的一种方法。
根据不同的酶特性和底物/产物的特性，可以使用多种方法来测量酶的活性。
以下是常见的酶活性测量方法：1. 比色法：比色法是最常用的测量酶活性的方法之一。
在酶催化底物转化为产物之后，产生的有色化合物可以通过分光光度计来测量其吸光度。
比色法适用于各种酶的测量，包括氧化还原酶、氨基酸酶等。
2. 荧光法：荧光法是利用酶底物转化为产物之后所产生的荧光来测量酶活性的方法。
这种方法通常需要在底物或产物中引入荧光染料，通过测量荧光信号的强度来定量酶活性。
荧光法对于具有较高灵敏度要求的酶活性测量非常有用，例如蛋白酶、DNA酶等。
3. 发光法：发光法是利用酶催化底物转化为产物后所产生的光来测量酶活性的方法。
这种方法通常需要在底物或产物中引入发光底物或荧光染料，通过测量其发光强度来测量酶活性。
发光法对于对时间分辨率要求较高的酶活性测量非常有用，例如ATP酶、NADH酶等。
4. 放射性法：放射性法是利用酶催化底物转化为产物后所释放的放射性物质测量酶活性的方法。
该方法需要在底物或产物中引入放射性同位素，通过测量其放射性强度来定量酶活性。
放射性法对于具有极高灵敏度要求的酶活性测量非常有用，例如DNA聚合酶、RNA酶等。
5. 电化学法：电化学法是利用酶催化底物转化为产物后所产生的电流来测量酶活性的方法。
这种方法通常需要在底物或产物中引入可反应的电活性物质，通过测量电流来定量酶活性。
电化学法对于某些具有电催化酶活性的酶测量非常有用，例如葡萄糖氧化酶、酒精脱氢酶等。
6. 色谱法：色谱法是利用酶催化底物转化为产物后所产生的物质在色谱柱上的分离来测量酶活性的方法。
这种方法通常需要在底物或产物中引入特定的标记物质，通过测量标记物质在色谱图谱上的峰面积或峰高度来定量酶活性。
色谱法对于某些底物或产物具有特定的分离性质的酶活性测量非常有用，例如激酶、酮糖酶等。
酶活力测定实验报告
酶活力测定实验报告一、实验目的酶活力测定实验的主要目的是了解酶的活性及其影响因素，掌握测定酶活力的基本方法和原理，以及学会使用相关仪器和试剂进行实验操作。
二、实验原理酶是生物体内具有催化作用的蛋白质或核酸。
酶活力是指酶催化一定化学反应的能力，通常用在一定条件下酶催化反应的速度来表示。
本实验采用分光光度法测定酶活力，其原理是基于酶催化反应所产生的产物在特定波长下具有光吸收特性，通过测定反应体系在该波长下吸光度的变化，可以计算出酶催化反应的速度，从而反映酶的活力。
以过氧化氢酶为例，过氧化氢酶能够催化过氧化氢分解为水和氧气。
在本实验中，通过加入一定量的过氧化氢溶液，使其与过氧化氢酶反应，然后使用高锰酸钾溶液滴定剩余的过氧化氢，根据高锰酸钾溶液的用量计算出过氧化氢酶的活力。
三、实验材料与仪器1、实验材料新鲜的猪肝或土豆等富含过氧化氢酶的组织。
过氧化氢溶液（3%）。
高锰酸钾溶液（002 mol/L）。
磷酸缓冲液（pH 70）。
2、实验仪器研钵。
离心机。
移液器。
分光光度计。
恒温水浴锅。
试管、量筒、容量瓶等玻璃仪器。
四、实验步骤1、酶液的制备称取新鲜的猪肝或土豆组织_____g，置于研钵中，加入适量的磷酸缓冲液（pH 70），研磨成匀浆。
将匀浆转移至离心管中，以_____rpm 的转速离心_____min，取上清液即为粗酶液。
2、酶活力的测定取_____支试管，分别标记为 1、2、3。
在 1 号试管中加入_____mL 磷酸缓冲液（pH 70）作为空白对照，在 2、3 号试管中分别加入_____mL 粗酶液。
向 1、2、3 号试管中分别加入_____mL 过氧化氢溶液（3%），立即摇匀，并同时开始计时。
在反应进行_____min 后，迅速向 1、2、3 号试管中分别加入_____mL 浓度为 2 mol/L 的硫酸溶液终止反应。
用移液器吸取_____mL 反应液，加入到另一支装有_____mL 高锰酸钾溶液（002 mol/L）的试管中，摇匀。
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实验26 过氧化氢酶活力的测定（必修）
[目的与原理]
掌握过氧化氢酶活力的测定原理和比色测定方法，并用此方法测定水产动物血清中过氧化氢酶的活力。
血清中的过氧化氢酶（CA T）分解H2O2的反应，可通过加入钼酸铵而迅速中止，剩余的H2O2与钼酸铵产生一种淡黄色的络合物，在405nm处测定其生成量，即可计算出CA T 的活力，CAT活力单位定义为：每1分钟分解1μmol的过氧化氢即为1个酶活力单位（U）。
[试剂与器材]
试剂：
1、磷酸盐缓冲液（67mmol / l，pH=7.4）：取Na2HP04 7.60g，KH2P041.82g，溶于1L蒸馏水中，调pH至7.4。
2、基质液（65μmol/ l, H2O2）：取30% H2O2 3.69 ml加pH7.4磷酸盐缓冲液至500ml。
3、钼酸铵：称取［(NH4)6Mo7O24］20.2g溶于500ml蒸馏水中。
器材：
721分光光度计, 0.5cm比色杯，恒温水箱（37℃±0.5℃），试管16mm×100mm，移液管，吸耳球，可调微量进样器。
[实验步骤]
1、样品测定：基质液置于37℃水浴5 min，然后按下列步骤操作
试剂对照管标准管测定管
基质液 1.0ml 1.0ml 1.0ml
钼酸铵 1.0ml 1.0ml —
缓冲液—0.2ml —
血清0.2ml —0.2ml
37℃水浴准确温育60s后，立即加入钼酸铵1.0ml摇匀，10min后于405nm以蒸馏水调零比色。
记录各管吸光度值（A）
2、计算：
过氧化氢酶活力(U/ L)= [(A对－A测)/ A标] ×（65×1×1000/0.2 ×1000）
= [(A对－A测)/ A标]×325
(式中65为标准管H2O2浓度，1为1.0ml H2O2体积，1000换算成1L血清，0.2为血清用量，1000为μmol换算成mmol)
[方法评估]
本实验采用分光光度法测定底物（H2O2）的减少量来评价过氧化氢酶活力。
此法操作简便、准确，在实验时间（1小时）内显色稳定，适于科研和实验检验用。
[应用意义]
CA T具有重要的生理功能，细胞内与产生H2O2的需氧脱氢酶类（如氨基酸氧化酶等）同时存在，能将细胞代谢所产生的毒性物质H2O2迅速加以清除，从而共同保护血红蛋白、巯基酶、膜蛋白和解毒作用。
此外，CA T清除H2O2后可减少过氧化脂质生成和对人体的毒害，因而有抗衰老和保护作用。
[注意事项]
1、反应时间在80秒内吸光度降低与反应时间成反比关系，故选用60秒为测定时间（所以本法不宜大批量样品同时测定，以每批4～5份为宜）。
2、酶活力在100~140U范围内呈线性关系；钼酸铵和H2O2呈色反应在pH＜7时吸光度升高，当pH＞7.6时吸光度下降，故选用pH7.4作为测定条件。
3、黄色复合物至少在1h内稳定。
4、血清不能溶血，溶血样品应该弃去。
5、加入钼酸铵后，由于释放O2，气泡会干扰比色，宜在显色10min后比色。
[思考题]
1、试述过氧化氢酶的测定方法？
2、底物与血液中过氧化氢酶反应时间为什么要准确定为60秒？
3、试述过氧化氢酶催化H2O2反应的机制？
淀粉酶活力的测定（必修）
[目的与原理]
掌握淀粉酶活力的测定方法，测定水产经济动物的主要消化器官肝胰脏、胃、肠内的淀粉酶活力。
淀粉酶催化淀粉分子中葡萄糖苷键水解，产生葡萄糖、麦芽糖等。
在基质充分的条件下，反应后加入的碘液与未被水解的淀粉结合成蓝色复合物，其蓝色深浅与未经酶促反应的空白管比较其吸光度，从而推算出淀粉酶的活力单位。
[试剂与器材]
试剂：
1、0.04%可溶性淀粉
精确称取可溶性淀粉0.20g，置于20ml烧杯内，加入蒸馏水约5ml，摇匀使成淀粉混悬液，另称取无水磷酸二氢钠13.3g及苯甲酸4.3g，共置于500ml烧杯内，加入蒸馏水约250ml,煮沸后，将淀粉混悬液倒入此烧杯内，并用蒸馏水洗涤装淀粉混悬液的烧杯数次，洗涤亦倒入此烧杯内。
继续煮沸1分钟，冷却至室温后倒入500ml容量瓶中，并用蒸馏水稀释至500ml 刻度。
此淀粉液pH应为7.0±0.1，在室温下保存2―3个月。
2、0.1N碘贮存液：精确称取碘酸钾(KIO3) 3.567g及碘化钾（KI）45g置于1L容量瓶内，加入蒸馏水约800ml，然后缓慢加入浓盐酸9ml，摇匀后用蒸馏水稀释至1L刻度，置冰箱内备用。
3、0.01N碘应用液：取0.1N碘贮存液50ml，用蒸馏水稀释至500ml，盛于棕色瓶中置冰箱内约保存1个月。
材料：
新鲜鱼、虾、贝的肝胰脏、胃、肠标本。
器材：
分光光度计、电子天平、离心机、pH测定仪，恒温水箱、匀浆器、剪子、镊子、冰块、50ml比色管若干、移液管若干，500ml容量瓶，烧杯。
[实验步骤]
1、酶提取液的制备
取新鲜肝胰脏、胃、肠组织称重，在冰盘上剔除脂肪及内容物，以10倍缓冲液或去离子水匀浆各组织，将组织悬液低温下离心（3000rpm/min）,上清液为酶粗提液（酶液）。
2、（见实验蛋白酶活力的测定）
2、淀粉酶活力的测定
取50ml刻度比色管二只，标明为对照管，测定管。
对照管测定管
0.04％可溶性淀粉 5.0ml 5.0ml
将两管在37℃水浴中预热2—5分钟
酶液—0.1ml
测定管混匀后，再置37℃水浴中反应7.5分钟
0.01N碘应用液 5.0ml 5.0ml
用蒸馏水稀释至50ml，立即混匀。
用660nm或红色滤光板进行比色，以蒸馏水校正光密度0点，读取对照管和测定管光密度读数。
3、计算
淀粉酶活力单位定义：在370C、30min内，100ml酶液中的淀粉酶能完全水解淀粉10mg 称为一个淀粉酶活力单位。
淀粉酶活力单位/100ml＝（对照管光密度—测定管光密度）/对照管光密度×2/10×30/7.5×100/0.1=（对照管光密度—测定管光密度）/对照管光密度×800
[方法评估]
测定淀粉酶的方法有很多种，大致可分为两类：即测定底物（淀粉）的减少量和测定产物（如还原性糖）的生成量。
本实验采用前者的淀粉—碘比色法。
[应用意义]
分析淀粉酶的活力有助于了解水产动物对食物中淀粉的消化能力，由于鱼虾等水产动物种类与大小的差异和所提供食物品质的不同，以及动物所处生活环境的变化，各种水产动物对食物的消化吸收有明显的差别。
认识鱼虾消化酶变化特性，为研究水产种类饲料配伍提供科学依据
[注意事项]
1、0.04%可溶性淀粉溶液5ml内含淀粉量为2mg，在本法条件下，当2mg淀粉完全水解时相当于800淀粉酶单位／100ml（即：2/10 × 30/7.5 × 100/0.1 = 800）。
2、对照管内含淀粉2mg，由于淀粉溶液比较稳定，故对照管在固定比色计上的光密度读数并不改变，因而在测定中不必每次作对照管。
3、当淀粉酶接近800单位时，由于淀粉已几乎完全被水解，故加入碘液后也不再显蓝色，因此淀粉酶单位较高时（接近600单位）宜将标本稀释（2～5倍）后重新测定，并将测定结果乘以稀释倍数。
4、如淀粉溶液出现混浊或絮状物，表示淀粉溶液污染或变质，不能再用。
5、唾液内含有大量的淀粉酶，故即使是唾液的飞沫污染，也能使测定结果显著偏高。
[思考题]
1、试述淀粉—碘比色法测定淀粉酶活力的原理？
2、影响淀粉酶活力大小的因素有哪些？。