化学药物分析方法验证的内容和评价

化学药物分析方法验证的内容和评价

质量可控是活性化合物成药及进行药品安全有效性评价的前提。对药品的质量进行控制应该是多方面的，其中包括生产环境的控制、原辅料来源和质量的控制、生产工艺过程的控制，以及按照质量标准进行成品检验控制等。

但是，在药品研发过程中，揭示药品的品质、控制药品的质量，通常是要针对研制药品的特性 (主药的理化性质及制剂的质量要求等 )确定相应的研究测

试项目，再根据测试项目的需要，建立适宜的分析方法 (包括方法的选择和方法的验证 )，最后是根据药品质量的要求及安全性研究结果确定各测试项目的限度，起草制订检验药品质量的质量标准。分析方法是揭示药品品质的工具和手段，方法验证是判断采用的分析方法是否科学、可行的过程。实际上，方法验证就是根据确定的检测项目的要求，预先设置一定的验证内容，并通过设计合理的试验来验证所采用的分析方法能否符合检测项目的要求。下面就根据《化学药物质量控制分析方法验证技术指导原则》解读分析方法验证的内容和评价要点，在对目前申报资料中分析方法验证工作中存在的问题进行分析的基础上，以高效液相色谱法为例，阐述方法验证的思路及验证要点，希望能对药物研发者有所帮助。

一、方法验证的内容

首先应该明确的是：方法验证的内容应根据检测项目的要求，同时结合所采用的分析方法的特点确定。相同的分析方法用于不同的检测项目时，其验证要求是不同的。例如，采用高效液相色谱法用于制剂的鉴别和杂质定量检查时的验证要求是不同的；前者重点要验证方法的专属性，而后者重点要验证方法的专属性、准确度和定量限。通常需要验证的检测项目：鉴别、杂质检查 (限度试验、定量试验 )、定量测定 (含量测定、溶出度、释放度等 )，还有其他特定的检测项目 (粒径分布、分子量分布)等。方法验证的内容包括专属性、线性、范围、准确度、精密度、检测限、定量限、耐用性 (粗放度 )和系统适用性等。

1、专属性专属性系指在其他成分 (如杂质、降解物、辅料等 )存在下，采用的分析方法能够正确鉴定、检出被测物的特性。通常，鉴别、杂质检查、含量测定均应验证方法的专属性，排除非主药成分的干扰。

2、线性线性系指在设计的测定范围内，检测结果与供试品中被测物的浓度(量)直接呈线性关系的程度，是定量测定的基础，涉及定量测定的项目，如杂质定量试验和含量测定均需要验证方法的线性。

3、范围范围系指能够达到一定的准确度、精密度和线性，测试方法适用的试样中被测物高低限浓度或量的区间。通常用与分析方法的测试结果相同的单位(如百分浓度 )表达。涉及到定量测定的检测项目均需要验证范围，如含量测定、含量均匀度、溶出度或释放度、杂质定量试验等。范围应根据剂型和(或)检测项目的要求确定。含量测定范围应为测试浓度的 80%~100%或更宽。制剂的含量均匀度范围应为测试浓度的70%~130%。

4、准确度准确度系指用该方法测定的结果与真实值或认可的参考值之间接近的程度。具有一定的准确度是进行定量测定的必要条件，因此，涉及到定量测定的检测项目均需要验证方法的准确度，如含量测定、杂质定量试验等。准确度应在规定的范围内建立。

5、精密度精密度系指在规定的测试条件下，同一均质供试品经多次取样进行一系列检测所得结果之间的接近程度 (离散程度)。一般用偏差、标准偏差或相对标准偏差表示。精密度可以从3个层次考察：重复性(同样的操作条件下，在较短时间间隔内，同一分析人员测定结果的精密度)、中间精密度(同一实验室，不同时间、不同分析人员、不同仪器设备测定结果的精密度)、重现性(不同实验室、不同分析人员测定结果的精密度，当分析方法被法定标准采用时，应进行重现性试验)。

6、检测限检测限系指试样中的被测物能够被检测到的最低量，但不一定要准确定量。该验证指标的意义在于考察方法是否具备灵敏的检测能力。因此，对杂质限度试验，需验证并证明方法具有足够低的检测限，以保证检出需控制的杂质。

7、定量限定量限系指试样中的被测物能够被定量测定的最低量，其测定结果应具有一定的准确度和精密度。它体现了分析方法是否具备灵敏的定量检测能力。杂质定量试验，需验证方法的定量限，以保证含量很少的杂质能够被准确测定。

8、耐用性(粗放度 ) 耐用性系指测定条件发生小的变动时，测定结果不受影响的承受程度。主要考察方法本身对于可变试验因素的抗干扰能力。典型的变动因素包括：液相色谱法中流动相的组成、流速和 pH值、不同厂牌或不同批号的同类型色谱柱、柱温等。9、系统适用性对一些仪器分析方法，在进行方法验证时，有必要将分析设备、电子仪器与实验操作、测试样品等一起当作完整的系统进行评估。系统适用性便是对整个系统进行评估的指标，其试验参数的设置需根据被验证方法类型而定。色谱方法对分析设备、电子仪器的依赖程度较高，因此，所有的色谱方法均应进行系统适用性验证，并将该指标作为分析方法的组成部分。

二、方法验证的评价要点及需要关注的问题

方法验证的评价应围绕验证目的进行，同时关注方法验证内容的全面性和试验方案的系统性和合理性，以及验证过程的规范性。

1、杂质定量方法验证

杂质定量试验要验证方法的专属性、检测限、定量限、线性、范围、准确度、精密度等。为考察方法能否有效检出原料药或制剂中的杂质，可采用原料药尚未精制的粗品、或加入合成中间体的方法；还可根据药物的化学结构特点、制剂的处方与工艺、贮藏条件等选用合适的酸、碱、光、热、氧化等强制破坏性试验来验证方法专属性；注意进行破坏试验的条件要适度，着重考察敏感条件，即不能无降解产物产生，也不能将主药成分破坏殆尽，应以主药成分破坏 20%~30%为宜；否则，无降解产物产生或主药成分破坏殆尽时进行的专属性试验是不能反映拟定的方法能有效将主药与杂质分开并能有效检出可能的杂质的。另外，在进行方法专属性试验时，还可采用二极管阵列检测器、质谱检测器等检测峰纯度；因在强制降解试验条件下产生的降解产物较药品货架期产生的降解产物复杂、未知杂质多，分离难度大，二极管阵列检测器和质谱检测器可有效显示各色谱峰的纯度，以免因分离度不符合要求，导致分析结果不准确。如果不具备检测峰纯度的试验条件，也可通过调整流动相的组成或比例的方法使各色谱峰的相对保留时间发生改变，来印证杂质检查方法的专属性。对杂质定量方法验证进行评价，需要关注的问题还有杂质的定量方法。通常，杂质的定量方法有：①外标法(杂质对照品法)。

②加校正因子的主成分自身对照法。③不加校正因子的主成分自身对照法。

④峰面积归一化法。杂质对照品法定量比较准确，是进行杂质有效控制的最

直接的方法，建议已知杂质控制尽量采用杂质对照品法定量；此时，还应对对照品进行评估和确认，制订质量控制要求。加校正因子的主成分自身对照法应对校正因子进行严格测定，该方法适用于相对响应因子在 0.5~1.5 范围内的已知杂质的控制；超出 0.5~1.5范围时，宜采用杂质对照品法或调整检测波长使杂质的相对响应因子落在 0.5~1.5范围内。不加校正因子的主成分自身对照法的前提是假定杂质与主成分的响应因子基本相同；相对响应因子在 0.9~1.1 范围内，可以采用主成分自身对照法，超出 0.9~1.1范围时，宜采用杂质对照品法或加校正因子的主成分自身对照法。峰面积归一化法简便快捷，但是，因各杂质与主成分的响应因子有差异、杂质量与主成分量不一定在同一线性范围内、仪器对微量杂质和常量主成分的积分精度及准确度不相同等因素影响定量的准确性，一般不建议采用。

2、复方制剂杂质研究的考虑要点