植物蛋白质组研究方法

第31卷第3期湖南农业大学学报(自然科学版) V ol．31 No．3 2005年6月Journal of Hunan Agricultural University (Natural Sciences) Jun．2005文章编号：1007-1032(2005)03-0342-05植物蛋白质组研究方法龙桂友a，刘 杰b，饶力群b(湖南农业大学 a.园艺园林学院；b.生命科学与技术学院，湖南长沙 410128)摘要：蛋白质组研究是后基因组时代的热点领域．介绍了蛋白质组概念提出的背景，蛋白质组与基因组的联系与区别，蛋白质组研究的内容，重点综述了植物蛋白质组研究的技术．双向凝胶电泳仍为蛋白质分离的核心技术，该技术在某些方面作了改进和发展；生物质谱是蛋白质鉴定的关键技术，进一步发展了生物传感芯片质谱及蛋白质芯片技术；对蛋白质组研究的信息处理依赖于生物信息学的发展，介绍了国内外相关的蛋白质数据库及建立数据库主要应用的图像软件．关键词：植物蛋白质组；双向凝胶电泳；生物质谱；蛋白质数据库；蛋白质芯片中图分类号：Q51 文献标识码：AMethods of Plant Proteome ResearchLONG Gui-you a，LIU Jie b，RAO Li-qun b(a.College of Horticulture and Landscape；b.College of Life Science and Technology，HNAU，Changsha 410128，China)Abstract: Proteome research is one of the most active fields in the post-genomic era．In this paper is an attempt to introduce the scientific background of the origination of proteome，the content of proteome research and the distinction between proteome and genome．This article focuses on reviewing the methods of plant proteome study，which include the improved two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis that is the core technique of protein separation，bio-mass spectrometry that is the critical tool of protein identification and the protein database that is the main means of protein information processing．It also makes a description of some last developed techniques in proteome research such as biosensor chip mass spectrometry and protein chip，2D image analysis software．Key words: plant proteome；two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis；bio-mass spectrometry；protein database；protein chip澳大利亚Macquarie大学的Wilkins和Williams 于1994年首先提出了蛋白质组的概念，即基因组表达的全部蛋白质，即某一物种、个体、器官、组织或细胞基因组的全部蛋白质产物的表达谱[1~3]．随着人类基因组研究工作的进一步深入，生命科学将进入后基因组时代，基因组学的研究重点从结构基因组学过渡到功能基因组学[4]．蛋白质组学作为后基因组计划的一个重要组成部分，成为生命科学的最前沿研究领域 [5~8]．蛋白质组与基因组有紧密的联系，但二者也存在着根本的区别．从基因到mRNA再到蛋白质，最后体现生命功能的是蛋白质，基因组决定了细胞的遗传特性，但是基因的遗传信息最终要通过蛋白质的功能来表达．组成某一有机体的所有细胞共享一个特定的基因组，但由于基因组内各个基因表达的条件和表达的程度随时间、地点、环境、条件而不同，因而其表达的最终产物蛋白质组便处于一个新陈代谢的动态变化中，即使同一种细胞的生长与活动，也因不同时期、不同条件其蛋白质也处在不断的变化之中．人类基因只有3~4万个，而蛋白质却有25万种[9]，一个基因可以产生多种蛋白质，而且形式各异，功能不同．因而仅以基因组水平很难认识生命活动的全部过程，尚需借助蛋白质组学研究以诠释生命的全部内涵[2，3]．收稿日期：2004-10-10基金项目：湖南省科技重大专项(04NK1005)作者简介：龙桂友(1963-)，男，汉族，湖南永兴人，博士研究生，湖南农业大学副教授．第31卷第3期 龙桂友等 植物蛋白质组研究方法 343蛋白质组学包括蛋白质的定性和定量[10]，还包括它们的定位、修饰、活性、功能、相互作用等[11，12]，其研究目标就是建立完整的蛋白质文库．蛋白质组研究的内容包括三个大的方面[8]：一是建立一个细胞或机体在正常条件下的蛋白质文库，或称参考图谱，即“组成蛋白质组”[1，3]；二是研究在各种条件下的蛋白质变化，注重那些可能涉及到特定功能机制的蛋白质群体，称为“功能蛋白质组”[1，8，13]；三是蛋白质组生物信息学的研究，即采用计算机技术和信息论方法对蛋白质组学研究中获得的大量而复杂的数据进行采集、储存、传递、检索、分析和解读，以揭示并预测重要的生物信息[8]．1 蛋白质分离技术蛋白质分离是植物蛋白质组研究的关键步骤．双向电泳技术是蛋白质组分析的核心技术．双向聚丙烯酰胺凝胶电泳主要适用于微生物和动物细胞的全蛋白质的分析，虽然在某些方面作过改良[14]，但对植物组织的蛋白质分析仍不是十分理想．由于植物材料蛋白质含量低，加之植物组织中色素、酚、醌及其他多种次生代谢产物的干扰，使得传统的双向聚丙烯酰胺凝胶电泳(2D-PAGE)难以取得满意的效果．为此，不少科技工作者对此方法进行了改良，在植物蛋白质组研究中取得较满意的结果[15~17]．其中样品制备、提取蛋白质技术的改进是关键，制备全蛋白质过程中采用冷丙酮、10%TCA 沉淀蛋白质，不仅有效地抑制了蛋白酶对蛋白质的水解作用，而且可除去色素、酚等干扰电泳效果的物质，采用80%的丙酮洗涤程序，可大大减少样品中盐分的含量，提高电泳效果[17]．双向电泳技术改进的另一重点是等电聚焦过程中两性电解质的配比．在微生物和动物细胞蛋白质双向电泳分析中，两性电解质pH3.5~10和pH5~7的配比为1∶4，这种配比对植物不太理想．植物叶片功能蛋白质通常分布于等电点pH4~6的区域内，改进后两性电解质配比pH3.5~10∶pH4~6∶pH6~8为1∶1∶3或pH3.5~10∶pH5~7∶pH6~8为1∶2∶2[15，17]．朱友林等[18]对植物蛋白质双向电泳染色技术作了改良，发展了一种考马斯亮兰—银染复合染色法，有效地提高了蛋白质双向电泳的分辨率．银染比考马斯亮兰染色的灵敏度高约100倍，但显色太快，稳定性和重复性不如考马斯亮兰染色，因此，在银染前用考马斯亮兰染色液代替固定液处理凝胶，既能得到正常的考马斯亮兰染色结果，可对样品中的主要蛋白质进行分析，同时也能提高银染稳定性和重复性，在适合考马斯亮兰染色的较大样品进样量(200㎍)的情况下也能获得满意的银染效果，从而有可能对样品中的微量蛋白质组分作进一步的分析．此外，目前应用的蛋白质分离技术还有琼脂糖凝胶与聚丙烯酰胺凝胶联用及毛细管电泳与聚丙烯酰胺凝胶电泳的联用，即毛细管等电聚焦．琼脂糖凝胶的孔径比一般聚丙烯酰胺凝胶的孔径大，如第一相用琼脂糖等电聚焦，第二相用聚丙烯酰胺凝胶电泳，可使上样量增大，有利于低丰度蛋白质的探测．毛细管等电聚焦即样品在融合硅毛细管上进行等电聚焦，然后朝阳极移动，通过改变阳极液(从NaOH溶液到冰醋酸溶液)，用紫外(280 nm)吸收峰探测，达到蛋白质的分离定量，此过程可实现全自动化．“双向”高效柱层析是分离纯化蛋白质的另一有效方法．先进行一次分子筛柱层析，从柱上流出的蛋白峰自动进入第二向层析，通常是利用蛋白质表面疏水性进行分离的反向柱层析，第二次分离的原理与双向电泳中利用蛋白质等电点分离完全不同，它的优点是可以适当放大，分离的蛋白质较多；另一个优点是流出的蛋白质可以直接进入质谱进行鉴定[19]．近年来，Sypro Rubby染色法已成为蛋白质组学研究中的一种灵敏的荧光染色方法，该方法在动态范围、定量可重复性、灵敏度及与质谱的兼容性方面的优势是其他方法不可比拟的，其动态检测范围比银染高几个数量级，使得很容易检测到低丰度蛋白的表达差异并对其进行定量[20]．2 蛋白质鉴定技术生物质谱是蛋白质组研究中的关键技术：蛋白质分子量测定，蛋白质和多肽纯度测定，多肽序列测定，肽质量酶谱测定，蛋白质翻译后修饰的测定，酶的活力部位研究，蛋白质折叠和高级结构的研究等[1，3，19，21]．应用较多的是电喷雾电离质谱，基质辅助激光解吸电离质谱，串联质谱及色(谱)质(谱)联用技术．新近发展起来的生物传感芯片质谱对研344 湖南农业大学学报(自然科学版) 2005年6月究蛋白质分子与蛋白质分子及与其他生物大分子之间的相互作用很有价值，它的核心是一块小的生物传感芯片，由金黄色的玻璃底物构成，所需分析的可溶性蛋白质各自与结合在芯片表面的固定生物分子(受体)相互作用，滞留在芯片上的蛋白质通过与基质结合而从与受体分子的相互作用中解离出来，便可直接进行基质辅助激光解吸电离质谱分析[3]．该方法快速、灵敏、精确、特异，需要的蛋白质(肽)样品仅需1~10 µg，检测水平可达10─16~10─15，精确度可达0.1%，一次实验只需10 min左右，能直接检测复杂混合物中蛋白质间相互作用，具有实时监测性，相互作用分析后可直接进行质谱鉴定，弥补了因蛋白质量少而难以分离鉴定的问题[22，23]．酵母双杂交系统(yeast two-hybrid system)是研究蛋白质组中蛋白质间相互作用的另一重要手段[1]．Uetz等[24]使用该系统构筑了蛋白质芯片，即在玻片表面高密度排列6 000个凹井，每个凹井中含有微量的酵母转化子，用来检测酵母可能的全部6 000种蛋白质之间的相互作用．蛋白质芯片是继基因芯片之后发展的一种高通量、微型化和自动化的蛋白质分析技术．目前蛋白质芯片主要分两种，一种类似于DNA芯片，即在固相支持物表面高密度排列的探针蛋白点阵，可特异地捕获样品中的靶蛋白，然后通过检测器对靶蛋白进行定性或定量分析[25]；另一种是微型化的凝胶电泳板，在电场作用下，样品中的蛋白质通过芯片上的孔道分离开来，经喷雾直接进入质谱仪中进行检测，以确定样品中蛋白质的分子量及种类[1]．蛋白质微测序是蛋白质分析鉴定中的一经典而普通的技术，目前在蛋白质组研究中蛋白质鉴定上仍有其广泛的用途[19，26]．特别是双向凝胶电泳与PVDF膜电印迹相结合，经过染色、切割，可进行Edman微量测序，测定N端序列．目前已实现了蛋白质微量测序的自动化．首先将凝胶分离的蛋白质直接印迹在聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)或玻璃纤维膜上，染色，切割后直接置于测序仪中，可用于皮克以下水平的蛋白质鉴定，近来应用自动化的N-末瑞Edman降解法可产生短的N-末端序列标签，这是将质谱序列标签概念用于Edman降解，这一技术已成为强有力的蛋白质鉴定技术[27]．3 蛋白质组信息处理技术双向电泳仍是目前蛋白质组研究的核心技术，用该技术分离得到的蛋白质斑点肉眼能分辨的仅数百个，大量的肉眼难以分辨的蛋白质斑点需通过计算机处理以提高分辨率和准确性，而生物信息学正是采用计算机技术和信息论方法研究蛋白质及核酸序列等各种生物信息的采集、储存、传递、检索、分析和解读的一门新兴学科，蛋白质组学研究已成为生物信息学的主要研究内容之一．蛋白质组研究依赖于生物信息学的理论、技术与数据库，因蛋白质组比基因组更复杂，因而蛋白质组信息学更具挑战性[2]．第一个完整的蛋白质数据库——酵母蛋白质数据库已于1997年由Garrels为首的美国麻省蛋白质组公司创建[2]．创建于1986年，由瑞士生物信息学研究所和欧洲生物信息学研究所共同协作维护的SWISS-PROT蛋白质序列数据库是因特网上生物信息学最核心的3个数据库之一，该数据库到2001年共收录102 708个蛋白质序列，包含37 803 202个氨基酸，它的URL地址为http://www.expasy. ch/sprot．一些蛋白质高级结构数据库还可提供结构同源比较的检索，如PDB，其URL地址为http:// /．中国科学院上海生命科学研究院生物信息中心与蛋白质组研究中心已发布中国第一个蛋白质组图谱数据库(http://202.127.18.190)，将给中国的生物学尤其是蛋白质组学的研究工作带来极大的便利．郑广勇等[28]详细介绍了该数据库结构特点，数据库全面采用Java技术，具有完全的平台无关性，用户可以方便地对数据库中的图谱进行浏览，对图谱的各个区域进行放大操作，还可使用数据库提供的多种检索工具获得感兴趣蛋白质的具体信息，并可通过SWISS-PROT的连接，获得更为详尽的蛋白质信息．对双向电泳分离的蛋白质斑点如何与蛋白质数据库建立链接，目前主要采用肽质谱指纹图，该方法需对凝胶进行脱色、干胶、原位酶解，得到肽片段提取液，然后进入质谱仪分析，获得肽质谱指纹图，再查询蛋白质数据库，以鉴定被分析的蛋白质．由于肽质谱指纹图的方法灵敏度高，分析迅速，已成为双向电泳鉴定蛋白质最广泛使用的方法[29~31]．目前第31卷第3期 龙桂友等 植物蛋白质组研究方法 345已有专门的计算机软件对双向电泳所获得的电泳图谱进行数据采集和分析，为双向电泳数据的分析与比较、数据库的建立、蛋白质功能的预测以及大规模蛋白质斑点的模式识别提供了方便．相关的软件有Bio-Rad公司的双向电泳凝胶图像分析软件PDQuest 6.2，Pharmacia生物技术公司的ImageMa- ster 2D分析软件等，主要过程包括凝胶图像的输入、背景的消减、蛋白质斑点的识别、蛋白质斑点数据的采集与分析及三维图形的建立等[32，33]．虽然蛋白质组的研究是一个崭新的领域，尤其在植物领域是全新的课题，但已取得了一些喜人的成绩，对拟南芥、麦子、玉米、水稻、大豆、烟草、土豆、番茄、豌豆、菠菜、三叶草、百合、松树、橡树、红豆杉、沙田柚等植物从个体水平到组织、器官、亚细胞水平在遗传多样性、遗传突变体、逆境生理等方面进行了蛋白质组研究，取得了良好的进展，为今后植物的蛋白质组深入广泛的研究奠定了基础[1，14，34~41]．但是也应看到，作为植物蛋白质组分离蛋白质核心技术的双向电泳技术操作繁琐，自动化程度低，难以检测蛋白质含量本来就低的植物细胞中的低丰度蛋白质，不能很好地分离具有疏水区域的蛋白质及高分子量酸性和碱性蛋白．膜蛋白的丰度很低，等电点偏碱，难溶于等电聚焦缓冲液，在电泳胶上更难被检测到．提纯蛋白质的技术也有待改进，因质谱灵敏度高，蛋白质纯度达不到95%~99%会影响检测结果．现有的蛋白质鉴定技术多为鉴定其性质，定量分析技术未跟上来．科学技术的发展日新月异，突飞猛进，随着蛋白质提取、分离、鉴定技术的日趋自动化、高通量、超微量和特异性，尤其是纳米理论与技术的发展，将使蛋白质组研究取得突破性进展，另外，还应加强国际间的学术合作，实现蛋白质组数据库资源共享[42，43]．参考文献：[1] GUO Yi-Ming，SHEN Shi-Hua，JING Yu-Xiang，etal．Plant proteomics in the post-genomic era[J]．Acta Botanica Sinica，2002，44(6)：631-641．[2] 马歌丽．蛋白质组研究的进展[J]．郑州轻工业学院学报(自然科学版)，2001，16(2)：7-10．[3] 卫功宏，印莉萍．蛋白质组学相关概念与技术及其研究进展[J]．生物学杂志，2002，19(4)：1-3．[4] Kaiser L．From genome to functional genomics [J]．Scien-ce，2000，288：1715．[5] Wilkins M R，Sanchez J C，Gooley A A，et al．Progresswith proteome projects：why all 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