用正交法测定几种因素对酶活力的影响实验报告

用正交法测定几种因素对酶活力的影响

一、前言

正交实验法

正交实验法就是利用排列整齐的表-来对试验进行整体设计、综合比较、统计分析，实现通过少数的实验次数找到较好的生产条件，以达到最高生产工艺效果。正交表能够在因素变化范围内均衡抽样，使每次试验都具有较强的代表性，由于正交表具备均衡分散的特点，保证了全面实验的某些要求，这些试验往往能够较好或更好的达到实验的目的。包括两部分内容:第一，是怎样安排实验;第二，是怎样分析实验结果。

（enzyme activity）也称为，是指一定反应的能力。酶活力的大小可用在一定条件下，酶催化某一的速度来表示，酶催化愈大，酶活力愈高，反之活力愈低。测定酶活力实际就是测定的速度。促反应速度可用单位时间内、单位中底物的减少量或产物的增加量来表示。在一般的酶促反应体系中，底物往往是过量的，测定初速度时，底物减少量占总量的极少部分，不易准确检测，而产物则是从无到有，只要测定方法灵敏，就可准确测定。

二、实验目的

1.学习并掌握正交法应用原理。

2.采用正交法测定多种因素对酶活力的影响。

三、实验原理

酶促反应常常同时受到多种因素(包括激活剂和抑制剂等)的交互影响，可采用正交法进行综合研究，即通过少量试验收到更好的效果：多快好省。本实验以正交法同时测定[S]、[E]、温度和pH值对trypsin活性的影响，以求得酶活最大时相应影响因素的最佳值(水平)，并借此初步掌握正交法的使用。

四、实验器材和试剂

实验器材：

①试管

②漏斗

③温度计④吸管

⑤恒温水浴锅

⑥分光光度计

实验试剂：

①2%血红蛋白液(Hb)

②15%三氯醋酸液(TCA)

③trypsin酶液④0.04mol/L巴比妥缓冲液(pH 7, 8, 9)

⑤考马斯亮蓝染液

五、实验操作

1.实验设计

本实验为四因素三水平(总试验次数34=81)，可选用L9正交表（仅需9次试验)，展开后其特性为均衡搭配

（1）每列中水平数1、2、3出现次数相同，均为3次；

（2）每两列的横行数对(1-1/1-2/…/3-2/3-3)各出现一次。

2.将各因素及其相应水平参数依次填入得到实验安排表

（1）各试管编号，分别加入对应容量的底物(2% Hb)和相应pH 值的缓冲液，混匀；

（2）同温处理的3支试管同时预温5min；

（3）各试管依序分别加入对应容量的trypsin酶液(统一加样时间间隔)，混匀；

（4）同温处理的3支试管置对应恒温水浴中反应10min；

（5）各试管依次加入15%三氯醋酸液2ml，混匀以终止反应；

（6）非酶促对照：另取一试管，先加入2%血红蛋白液0.5ml

及pH8缓冲液2.0ml，再加15%三氯醋酸液2.0ml，混匀静置10min 后再加入酶液0.5ml；

（7）上述各管反应液室温静置15min后过滤，取滤液待测酶活；

（8）酶活测定(考马斯亮蓝法，标准曲线制备略)：取试管若干支编号，分别加入对应的样品滤液1.0ml及考马斯亮蓝液4.0ml，混匀，室温静置3min，以非酶促对照管为空白，于波长595nm比色测定。

3.数据记录及分析

将各管测定所得光密度值对应填入表格，分别算出各因素一、二及三水平的试验结果总和Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ，并分别取其平均值计算相应的极差(各列中最大与最小值之差)；比较各因素极差的大小以评估各因素对酶活的影响，并对酶活最高时的各因素水平作一直观分析。

六、实验结果及数据处理

1.实验数据：

2.实验数据处理分析：

由上述表格各因素极差大小可看出，底物浓度对于酶活力影响最大，其次是酶浓度，再次是pH，最后是温度。

根据上表数据，以吸光度值（Ⅰ/3、Ⅱ/3、Ⅲ/3）为纵坐标，因素的水平数为横坐标作图

图一底物浓度对酶活力的影响

从图一可看出，在一定浓度范围内，随着底物浓度的增大，酶活力是逐渐降低的，约在底物浓度为0.5mol/ml时酶活力达到最低。

图二酶浓度对酶活力的影响

从图二可看出，在一定浓度范围内，随着酶浓度升高，酶活力是逐渐降低的，约在酶浓度为0.55mol/ml时酶活力达到最低。

图三温度对酶活力的影响

从图三可看出，在一定浓度范围内，随着温度升高，反应速率是逐渐升高的，即酶活力是逐渐升高的，约在温度为50℃时酶活力达

到最高。

图四pH对酶活力的影响

从图四可看出，在一定浓度范围内，随着pH升高，反应速率是逐渐升高的，即酶活力是逐渐升高的，约在pH为8时酶活力达到最高。

七、实验注意事项

1.每加入一种试剂都需要充分混匀。

2.应确保酶促反应的温度及反应时间的准确性。

八、思考题

1.正交法有何优点？

答：通过少数的实验次数找到较好的生产条件，能够在因素变化

范围内均衡抽样，使每次试验都具有较强的代表性，保证了全面实验的某些要求，这些试验往往能够较好或更好的达到实验的目的。

2.各管温育后为何要加入三氯醋酸液？

答：三氯醋酸液可作为蛋白质沉淀剂，使反应停止，进而保证变量的统一。

3.非酶促空白对照的作用是什么？其处理为何与其他各管不同？

答：非酶促空白对照的作用是为了保证实验变量的统一。因为其理论上讲并不会发生任何反应，因此不需经过加热，剩下其余条件都要和实验组相一致。