转基因小鼠肿瘤模型的研究进展

转基因小鼠肿瘤模型的研究进展沈富毅，潘隽玮，郁嘉伦，余昂，侯晓骏[摘要] 动物模型在肿瘤病因的揭示，发病机理的探索以及治疗措施的评估中有着不可替代的重要作用。

继常规转基因方法之后，可诱导表达转基因、基因打靶、条件性基因打靶以及基因捕获等技术的出现及其在肿瘤模型建立中的应用为我们提供了大量能较好模拟人体相应肿瘤的动物模型，极大地深化了我们对肿瘤生物学行为的认识，并有助于人们找到攻克肿瘤的办法。

[关键词] 肿瘤，小鼠模型，转基因肿瘤是一类严重危害人类健康及生命的重大疾病，动物模型在肿瘤病因、发病机理的揭示以及治疗措施的评价中发挥着不可替代的作用。

肿瘤动物模型最早源自小鼠自发突变系或经致癌剂诱变而得，对它们的研究使我们对环境致癌物及其代谢活动机理有了一定的认识；但自发突变频率在自然状态下通常很低，而诱发模型也因其不可精确控制性而限制了它们的应用。

在过去的二十多年里，随着人们对癌基因激活或抑癌基因失活在肿瘤发生发展中作用的认识日益深入，以及近年发展起来的小鼠生殖系引入可诱导或精细调控突变技术的应用，小鼠肿瘤模型的建立工作取得了突破性进展，本文就此作一简要综述。

1.常规转基因（transgenic）上世纪80年代初发展起来的原核显微注射技术，使我们可以将外源DNA直接导入小鼠生殖系以构建转基因动物模型。

目的基因在合适启动子驱动下表达，可赋予转基因动物新的表型，通过其表型分析可识别研究基因的功能。

转基因动物技术在肿瘤研究中的主要作用就是建立转基因的肿瘤动物模型，该研究始于1974年，Jaenisch等1用显微注射法将多瘤病毒SV40的DNA导入到小鼠的囊胚（blastocyst）中，在子代小鼠的肝、肾组织中检测到了SV40的DNA。

这一结果证明，将外源基因导入胚胎细胞中并实现整合是可能的。

以后相继有人用同样的方法实现了外源基因向小鼠受精卵的转移，并能遗传给后代。

在基因转移的方法上相继出现了逆转录病毒载体法、电脉冲法等。

1985年，Adams2等用转基因方法首次构建了B淋巴瘤myc癌基因易位的小鼠模型，此后10年，陆续发展了针对各种类型恶性肿瘤的转基因小鼠研究。

如今这项技术运用较为成熟的是，利用免疫球蛋白启动子调控的c-myc基因在转基因小鼠中的表达，导致早期淋巴瘤的发生3。

在LTR/c-myc转基因小鼠模型中，利用哺乳类动物肿瘤病毒长末端重复序列（LTR）驱动c-myc广谱的表达，可造成多种组织形成肿瘤，如睾丸、乳腺和淋巴系。

1984年Stewart把小鼠乳腺癌病毒（MMTV）的增强子与myc基因或ras基因连接,形成的MMTV-myc转基因小鼠和MMTV/V-Ha-Ras转基因小鼠都有高的乳腺癌发生率4。

近年来，这项技术更多的运用于肿瘤发生机制的探索上。

Li等5构建了乳腺癌转基因小鼠模型，该模型由小鼠乳清酸蛋白WAP 启动子和SV40 大T 抗原构建而成，可用于乳腺癌变过程中细胞的增殖与凋亡、DNA 突变及修复机制等方面的研究。

在慢性粒细胞性白血病(CML) 的研究中，Heisterkamp等6构建的bcr-abl 和crkl 双转基因小鼠发病潜伏期及存活期均大大缩短，直接证明了crkl 参与了bcr-abl 所致的白血病。

尽管相关的研究已经很多，然而常规转基因本身固有的缺陷如基因拷贝数的不可控性（因为是在小鼠胚胎时期植入转基因，所以无法知晓其复制的数目）以及转入的基因整合在宿主基因组的位点随机性增加了其表型分析的难度，因此现在已较少单独采用常规转基因技术来制作肿瘤动物模型。

2．可诱导表达的转基因（inducible transgene expression）常规转基因技术通过特定启动子的选择实现了转基因的组织特异性表达，在此基础上，人们又开发了许多可诱导表达模型用以调控基因表达的时相。

目前，最常用的是反式因子rtTA与四环素衍生物强力霉素结合后激活四环素操纵子表达的方法（tet-on），而tTA与强力霉素结合则起抑制四环素操纵子表达的作用7（tet-off）。

这样，tet-on转基因小鼠可以通过摄入四环素的方法激活癌基因的表达；tet-off转基因小鼠则持续表达癌基因，直至因强力霉素的摄入而被特异性抑制。

应用此系统已构建了可诱导性Hras-G12V小鼠黑色素瘤8,c-myc可诱导表达T细胞淋巴瘤9等肿瘤模型。

Fisher等10利用四环素诱导系统建立了在肺细胞定向表达、带有K-Ras4b(G12D)癌基因的小鼠模型。

在此种转基因小鼠饮食中加入强力霉素，诱导癌基因K-Ras 表达，7天后肺细胞增生，2个月后小鼠肺组织中相继形成腺瘤、腺癌，并向胸膜扩散。

撤去强力霉素后，K-Ras mRNA水平急剧下降, 增生细胞和肿瘤细胞凋亡，3天后肿瘤肿块迅速缩小，1个月后检测不到肿瘤组织。

四环素诱导系统的优点在于可以对转基因的表达进行精确的调控，转基因的表达呈四环素药物剂量依赖性反应并可具有组织特异性，而只须停止给药就可恢复到对照条件。

3．基因打靶或基因删除(gene targeting)从80年代到90年代初，小鼠ES细胞基因打靶技术已发展到成熟阶段。

1981年Evans11等从小鼠胚胎中成功分离得到胚胎干细胞(Embryonic Stem cell，ES)，即从着床前胚胎(孕3～5天)分离出内细胞团(Inner cell mass，ICM)细胞并摸索出维持其全能性的体外培养条件，在此基础上建立了胚胎干细胞技术。

1984年，Bradly等12成功应用显微注射法将ES细胞移入囊胚腔，并移植回假孕母鼠，获得生殖系嵌合体，经过适当的交配，获得了源于ES细胞系的纯系小鼠。

随后不久，同源重组现象被发现并很快用于内源性基因的精确修饰。

1987年，Utah大学Kirk13领导的研究小组根据同源重组的原理，实现了导入外源基因的定点整合，这一技术称为“基因打靶”。

基因打靶是通过同源重组将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点，以达到定点修饰改造染色体上某一基因目的的一种技术14。

1988年，Mansour等15通过建立一套正负双选择标记系统（PNS）来筛选基因组内同源重组正确发生的ES细胞克隆。

该载体上含有正负选择基因各一，正选择基因为neo基因（neomysine），位于同源区内，其在随机整合和同源重组中均可正常表达；负选择基因为HSV-TK基因（herpers simplex virus-TK），在靶基因同源区之外，位于载体的3’末端。

同源重组时，TK基因将被切除而丢失，而在随机整合时，所有的序列（包括TK）均保留。

（图1）当加入G418和GANC后，HSV-TK由于表达的胸苷激酶可使GCV （ganciclovir）转变为毒性氨基酸，使含此基因的转染细胞死亡。

同源重组后，因HSV-TK基因位于构建的打靶载体目的基因同源序列之外，所以可用GCV来筛选随机整合的阳性克隆细胞。

因此经过正负双选择系统的筛选可得到同源重组已发生的阳性克隆细胞。

图1 正负双选择标记系统基因打靶技术的出现为在体内研究抑癌基因的功能提供了可能。

基因敲除或称基因打靶，对象是胚胎干细胞（ES），注入ES细胞的基因片段与靶基因发生同源重组后可使该位点上的一个等位基因发生突变，携带有突变的等位基因的ES细胞重新注射到正在分裂的囊胚中，再移植到假受孕体鼠，其F1代产生的是嵌合体小鼠，近交F2代中就会产生纯合子后代。

利用此方法，最先建立的抑癌基因动物模型是p53-/-小鼠16。

P53-/-小鼠自发肿瘤发生早，且经化学致癌物诱发的肿瘤生长速度明显加快，这些结果提示p53具有抑癌功能。

除p53基因外，相继建立的抑癌基因剔除小鼠模型还涉及Rb、Apc、Nf1和Nf2、Brcal和Brac2等基因17。

p21、p16、p15等抑癌基因的突变也与多种恶性肿瘤的发生有着密切的关系，黑素瘤就是其中之一18。

Shapiro19在实验中发现，p16缺失的NSCLC细胞株中出现Rb持续磷酸化，转染p16后恶性生长受到抑制，表明p16对肿瘤生长具有抑制作用。

Sharpless20等发现，p16缺失的小鼠自发性或致癌物诱导性肿瘤的发生率明显增高。

以上模型在应用于抑癌机理的探索过程中，常有出乎意料的结果，这可能是由于人和小鼠之间许多基本的生物学差别所造成。

4. 条件性基因打靶(conditional gene targeting)常规的基因打靶技术无法控制靶基因的表达，外源基因的表达不具组织特异性，且许多抑癌基因的纯合缺失容易导致早期胚胎死亡。

此外，在培养纯系小鼠的过程中，有些基因的互补效应也增加了表型分析的复杂性。

而条件性基因打靶则是在常规的基因打靶基础上，利用重组酶介导的位点特异性重组技术，在对小鼠基因修饰的时空范围上设置一个可调控的“开关”，从而使对小鼠基因组修饰的范围和时间处于可控状态。

条件性基因打靶技术有效地克服了常规基因打靶的上述缺点，因而能更加真实地模拟体内抑癌基因的失活过程。

(图2)条件性打靶的示意图条件性基因打靶的结果是使靶序列被删除或倒置。

目前使用得最广的是噬菌体P1的Cre和酵母flp重组酶。

它们分别识别34bp的LoxP和48bp的Frt位点。

早在1983年，CoxMM就发现大肠杆菌内flp基因所表达的flp重组酶可以特异性地让其质粒DNA发生置换，此后人们利用这项发现开展了一系列条件性基因打靶研究。

1993年，Gu等21以Cre-LoxP系统为基础，利用控制Cre表达的启动子的活性或所表达的Cre酶活性具有可诱导的特点，通过对诱导剂给予时间的控制或利用Cre基因定位表达系统中载体的宿主细胞特异性，从而在LoxP动物的一定发育阶段和一定组织细胞中实现对特定基因进行遗传修饰的目的(图2)。

人们可以通过诱导剂给予时间预先设计的方式来对动物基因突变的时空特异性进行人为控制，以避免出现死胎或动物出生后不久即死亡的现象。

Johnson等22利用噬菌体Cre-loxP系统建立了在转基因小鼠肺组织中特异表达Ras基因的模型。

此模型种，Ras癌基因一侧连接了LoxP单元和一个终止信号，并将其导入小鼠基因组中。

只要终止信号存在, Ras基因就没有活性。

当小鼠吸入一种含有Cre基因的重组腺病毒之后，腺病毒感染肺细胞，Cre基因与LoxP单元发生重组，LoxP单元与终止信号从Ras基因侧翼被切下, 失去终止信号的Ras基因就在腺病毒感染的肺细胞中表达了。

通过控制吸入腺病毒的数量, 来控制Ras基因在肺细胞中表达的数量。

这种小鼠模型与人类癌症发生非常相似，首先是区域细胞增生，然后是非癌增生，接着发展成恶性腺癌。

利用Cre-LoxP系统和Flp-frt系统也可用于特定组织器官或特定细胞中靶基因灭活的表型改变研究23。

5. 基因捕获技术（gene trapping）条件性基因打靶技术是目前被用来研究结构信息明确的基因功能的最重要的手段之一。