构建cdna文库的基本步骤
634901 SMART cDNA 文库构建实验流程(clontech)
操作一览(PT3000-2)本操作一览仅为实验流程，对于初用者，请在使用操作一览前仔细阅读SMART TM cDNA 文库构建试剂盒(Cat. No. 634901) 的说明书。
A. 第一链cDNA(fs cDNA)合成1. 在0.5-ml 离心管中混匀以下试剂：1–3 μl RNA 样本(对照反应，使用1 μl 的对照RNA)1 μl SMART™ IV Oligonucleotide1 μl CDS III/3' PCR Primer如果总体积<5 μl时，用水补齐至5 μl。
2. 混匀试剂并瞬时离心。
3. 72°C孵育2 min。
冰上冷却2 min。
4. 瞬时短暂离心。
5. 向每管反应中加入以下试剂：2.0 μl 5X First-Strand Buffer1.0 μl DTT (20 mM)1.0 μl dNTP Mix (10 mM)1.0 μl SMARTScribe MMLV Reverse Transcriptase10.0 μl 总体积6. 使用枪轻柔地混匀试剂，并瞬时离心。
7. 42°C孵育1 hr。
之后的LD PCR（步骤B）操作需在冰上进行。
8.引物延伸合成ds cDNA分别向反应管中加入1 μl 氢氧化钠，68°C孵育30 min，然后进行步骤C。
B. LD PCR扩增合成cDNA1. 在一个新的0.5-ml 离心管中混匀以下试剂：2 μl First-Strand cDNA (from Step A.7)80 μl Deionized H2O10 μl 10X Advantage2 PCR Buffer2 μl 50X dNTP Mix2 μl5' PCR Primer2 μl CDS III/3' PCR Primer2 μl 50X Advantage2 Polymerase Mix100 μl总体积2. 使用枪轻柔地混匀试剂，并瞬时离心。
第三章 cDNA文库和基因组文库
片段
• 缺点： 酶切可能切断cDNA
对策：
利用切点稀少的限制酶
甲基化
• 接头（adapter）
是一类人工合成的一头具有某种限制酶粘性末端，
另一头为平末端的特殊的寡核苷酸片段。
• 可能问题：
接头自身连接
• 解决方法：
接头分子一端磷酸化
具异常的5’-OH粘性末端结构的Bam稀少的限制酶
②dG：dC段可能影响转录和测序
back
同聚物加尾法克隆双链cDNA
通过依次加入、连接 合成的DNA衔接物 进行cDNA克隆
用衔接物分子连接平末端的DNA片段
• 衔接物（linker）
指用化学方法合成的一段由10-12个核苷酸组成，具
有一个或数个限制酶识别为点的5% 15000种
• 步骤： ①新鲜材料 ②提取RNA（mRNA） ③第一条cDNA链的合成
反转录酶④第二条cFra bibliotekNA链的合成⑤双链cDNA同载体的连接
置换合成/引物-衔接头法
λgt10/ λgt11
利用oligo（dT）引物和反转录酶合成cDNA第一链
自身引导法合成双链cDNA
双链cDNA的置换合成
引物-衔接头法合成双链cDNA
• 双链cDNA的置换合成缺点：
缺少对应于mRNA5’端的几个核苷酸
• 引物-衔接头法优点： ①利于获得全长cDNA ②利于和载体连接 缺点： ①酶切可能切断cDNA
• 部分酶解片段越大，所需重组体数目越少 • 载体：λ噬菌体 细抑制自身连接 ②基因组DNA不互补，稍短的片段极不可能连接成 带有原基因组上非相邻DNA区段的结构
cDNA文库制备非常详细
cDNA⽂库制备⾮常详细cDNA⽂库组标准流程⼀. Total RNA的提取 (2)⼆. mRNA的分离 (5)三．cDNA双链合成 (8)四．载体制备 (11)五. cDNA双链和载体的连接 (13)六．电转化流程 (14)七．快速鉴定、菌落PCR (16)⼋．pBlueScript cDNA库扩增 (18)⼀.Total RNA的提取1.试剂配制准备⼯作：1、研钵、5ml/10ml/ 25ml移液管、100ml/250ml量筒、250ml/100ml容量瓶、药匙、试剂瓶等玻璃制品均⽤锡纸包裹⼝部，置于烤箱内,180℃，烤6⼩时。
2、50ml/1.5ml离⼼管、枪头等塑料制品⽤0.1‰DEPC⽔浸泡过夜后，121℃20mins ⾼压灭菌。
3、电泳槽及电泳托、梳⼦⽤3%双氧⽔处理。
4、常⽤试剂及其配⽅：▲DEPC⽔：在1000ml去离⼦⽔中加⼊100ul DEPC, 静置过夜后⾼压灭菌。
▲0.78M柠檬酸纳：PH=4~5三⽔合柠檬酸纳22.94g加DEPC⽔定容⾄100ml，室温放置备⽤。
▲10%肌氨酸钠：肌氨酸钠10g加DEPC⽔定容⾄100ml，室温放置备⽤。
▲变性裂解液：0.78M柠檬酸钠8.25ml10%肌氨酸钠12.375ml异硫氰酸胍118.05g加DEPC⽔定容⾄250ml，室温放置备⽤临⽤前加β-巯基⼄醇使其终浓度为1%（v/v）▲2M 醋酸钠PH=4.5NaAc·3H2O 13.6g加DEPC⽔定容⾄50ml,⾼压灭菌，室温放置备⽤▲3M醋酸钠PH=5NaAc·3H2O 20.4g加DEPC⽔定容⾄50ml,⾼压灭菌，室温放置备⽤▲4M LiCL:LiCL 24.164g加DEPC⽔定容⾄100ml,⾼压灭菌，室温放置备⽤▲0.5M EDTA PH=8.0EDTA 18.61g⽤NaOH调PH值⾄8.0，定容到100ml，⾼压灭菌，室温放置备⽤▲10X MOPS (3-（N-吗啉代）丙磺酸):MOPS 41.86gNaAC·3H2O 4.10g0.5MEDTA（PH 8.0）20ml⽤NaOH调PH值 6.5 , DEPC⽔定容到1L，室温避光放置备⽤。
怎样构建基因组文库
i. 两菌株分别培养,分别收集和制备，包装前混合---本底低（对λDNA分子大小有严格限制），高效。
ii. 两菌株分别培养，混合收集和制备----操作简单， 本底高，可包装不同大小的λDNA分子。
2） 重组λDNA分子的包装过程 包装制备物（-70℃）于冰上缓慢融化 加入重组 λDNA分子 边融化边混合边包装 离心除去 细胞碎片 λ颗粒于-70℃保存待用
sa c B
K anr
p a c lo x P
D N A h ea d fu l
+
+ p a c c le a v a g e
p r o te in
C re
R e c o m b ila tio n
DNA
A m p lific a tio n七. 利用YAC载体构建基因组1. 两臂DNA片段的制备:
第四章基因的建立来自基因文全部遗传信息的重组D因组DNA长度之比
S
C o s o r i A pr S
SalI Cos
S
H
S
S1 Cos
H
BamH I 小片段
Cos
H
35-45kb DNA 片 段
T4 DNA ligase
Cos
H
利
构用
建双
COS
基
因
组质
文粒
S
离体包装
S
库载
感 染 E.coli
体六. 利用P1载体构建基因组构建过程也与λ载体构建过程十分相似:
1. 两臂DNA片段的制备: pAD10sacB BamHI/ScaI 2. 供体DNA片段的制备: 部分酶切 蔗糖梯度离心 3. 两DNA的连接和重组DAN分子的包装
cdna文库 名词解释
cdna 文库名词解释cDNA 文库是一种生物学研究中常用的技术手段，它通过反转录酶将 mRNA 转录成 cDNA，再进行克隆和扩增，最终得到一个包含所有基因编码的 cDNA 分子的克隆群。
本文将为您详细介绍 cdna 文库的概念、制作方法、优缺点以及在生物学研究中的应用。
一、cdna 文库的概念cdna 文库是指某生物某一发育时期所转录的 mRNA 全部经反转录形成的 cDNA 片段与某种载体连接而形成的克隆的集合，具有组织或细胞特异性。
cDNA 文库的制作方法通常包括 mRNA 的提取、反转录、克隆和扩增等步骤。
二、cdna 文库的制作方法1.mRNA 的提取：从生物组织或细胞中提取 mRNA，可以使用酚/氯仿法、异硫氰酸胍法等方法进行提取。
2.反转录：将提取到的 mRNA 用反转录酶反转录成 cDNA，反转录酶通常使用 MMLV 或 HIV 反转录酶。
3.克隆：将反转录产生的 cDNA 片段与载体连接，通常使用质粒载体，如 pCDNA3.1 等。
4.扩增：通过 PCR 技术对克隆的 cDNA 片段进行扩增，获得足够的 cDNA 文库。
三、cdna 文库的优缺点cdna 文库的优点是可以从组织或细胞中快速、高效地获取目的基因，并且可以进行高通量测序，获取大量的转录组信息。
此外，由于 cDNA 文库只包含 mRNA 转录的 cDNA 片段，因此可以减少基因组DNA 污染和 rRNA 等非编码 RNA 的干扰。
cdna 文库的缺点是需要进行反转录过程，可能会引起基因突变；同时，由于反转录酶的作用，cDNA 文库中可能会含有一些误差，如插入误差、缺失误差等。
四、cdna 文库在生物学研究中的应用cdna 文库在生物学研究中应用广泛，例如：1.基因表达分析：通过比较不同组织或细胞中的 cDNA 文库，可以了解基因在不同组织或细胞中的表达情况，从而探究基因的功能和调控机制。
2.基因克隆和表达：通过 cDNA 文库可以快速克隆目的基因，并进行表达和功能研究。
cdna基因文库名词解释 概述及应用场景
cdna基因文库名词解释概述及应用场景1. 引言1.1 概述CDNA基因文库是指利用互补式DNA（complementary DNA）技术构建而成的一类基因文库，其中包含了特定细胞或组织内所表达的mRNA分子的DNA 复制品。
通过将mRNA转录为cDNA，并将其插入到合适的质粒载体中，科学家们可以获取到特定时期或特定条件下细胞中所表达的全部转录本信息。
CDNA基因文库构建技术是基于反转录酶作用原理而来，通过选取合适的引物和核苷酸，在体外将mRNA逆转录合成相应的cDNA。
这些cDNA分子可进一步克隆到质粒载体中，并在宿主细胞内扩增。
最终形成一个包含大量不同cDNA 片段的基因文库，可供后续研究使用。
1.2 文章结构本文首先会对CDNA基因文库进行详细的名词解释，包括其定义、合成过程及特点以及构建方法与步骤。
接着，将进一步讨论CDNA基因文库在不同领域中的应用场景，尤其是在基因表达研究、蛋白质研究以及新药研发方面的应用。
最后，我们将总结已有的研究成果，并展望CDNA基因文库在未来的发展前景和应用潜力。
1.3 目的本文的目的是为读者提供关于CDNA基因文库的详细解释和应用场景的介绍。
通过阅读本文，读者将更全面地了解CDNA基因文库的概念、构建过程以及其在科学研究中的重要性和广泛应用。
同时，本文也旨在展示CDNA基因文库在基因表达、蛋白质研究以及新药研发等领域所起到的关键作用，为读者理解该技术在科学研究中所扮演的角色提供深入了解。
最后，通过总结已有研究成果并展望未来发展前景，让读者对CDNA基因文库技术有一个更加清晰的认识，并认识到其仍然具有巨大的发展潜力。
2. CDNA基因文库名词解释2.1 CDNA基因文库的定义CDNA基因文库，即亦称为互补脱氧核糖核酸（complementary DNA，cDNA）文库，是一种由转录反应合成的DNA序列集合，其中包含了从细胞中提取的mRNA分子逆转录合成的互补DNA。
cdna文库的构建和测序方法
cdna文库的构建和测序方法**CDNA Library Construction and Sequencing Methods**The construction of a cDNA library is a fundamental technique in molecular biology, enabling researchers to isolate, clone, and study specific genes. The process begins with the isolation of mRNA from a target cell or tissue. This mRNA is then reverse-transcribed into cDNA using a reverse transcriptase enzyme. The resulting cDNA fragments are subsequently cloned into a suitable vector, such as a plasmid or bacteriophage, to form a recombinant DNA molecule. These recombinant molecules are then introduced into host cells, typically bacteria, for amplification and storage.cDNA文库的构建是分子生物学中的一项基础技术，它使研究者能够分离、克隆和研究特定的基因。
该过程始于从目标细胞或组织中分离出mRNA。
随后，使用逆转录酶将这种mRNA逆转录成cDNA。
接着，将得到的cDNA片段克隆到合适的载体中，如质粒或噬菌体，形成重组DNA分子。
然后，这些重组分子被引入宿主细胞，通常是细菌，进行扩增和保存。
**Sequencing of cDNA Library**Once the cDNA library is constructed, sequencing becomes the next crucial step. Sequencing technologies have evolved significantly in recent years, with next-generation sequencing (NGS) platforms becoming increasingly popular. NGS allows for high-throughput sequencing, generating millions of reads in a short time. Thesereads are then aligned to a reference genome or transcriptome, enabling the identification and analysis of individual genes and gene expression patterns.cDNA文库构建完成后，测序成为下一个关键步骤。
cDNA文库构建技术手册
目录1 材料与方法 (1)1.1 植物材料以及菌株的保存与培养 (1)1.2 Trizol法提取Total RNA (1)1.3 Oligo（dT）磁珠纯化mRNA (1)1.4 三框cDNA的合成 (2)1.5 cDNA均一化与小片段去除 (4)1.6 双链cDNA与pGADT7（lineared）同源重组 (6)1.7 质粒转化大肠杆菌 (7)1.8 文库鉴定 (7)1.9 文库质粒大抽 (8)2 结果与分析 (9)2.1 RNA质量较好无降解 (9)2.2 ds cDNA合成 (10)2.3 ds cDNA均一化与去除小片段 (11)2.4 克隆计数 (11)2.5 文库质量鉴定 (12)附录 (14)1．材料与方法1.1 植物材料以及菌株的保存与培养1.1.1 植物材料的保存盐穗木由客户提供，存放于-80℃超低温冰箱。
1.1.2 菌株的保存与培养大肠杆菌（Eschrichia coli）菌株TOP10于LB培养液摇菌后保存成20%的甘油菌于-80℃冷冻保存。
大肠杆菌于37℃培养箱中培养。
1.2 Trizol法提取Total RNA1）研钵研棒药勺用液氮预冷，样品在液氮中研磨成粉末状，转移到离心管中；2）按50-100 mg/ml trizol加入trizol，充分振荡混匀。
室温静置5 min，使其充分裂解；3）按200 μl/ml trizol加入氯仿，振荡混匀后室温放置10 min；4）4℃ 12000 rpm离心15 min，吸取上层水相至一新的离心管中，按500 μl/ml trizol加入异丙醇混匀，-20℃放置10 min；5）4℃ 12000 rpm离心10 min，弃上清，此时RNA沉淀于管底；6）按1 ml/ml trizol加入75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。
4℃ 8000 g 离心5 min，尽量弃去上清；7）重复步骤6一次；8）室温晾干或真空干燥5-10 min，用29 μl RNase-free ddH2O和1 μl的RNase inhibitor 溶解RNA样品；9）分别吸取2 μl进行电泳检测与浓度测定。
cDNA文库组标准流程-5
cDNA文库组标准流程-54EcoRIadaptor加接:1.往双链 cDNA沉淀中加入9ulEcoRI adaptor(400ng/ul),4℃至少放置30分钟以充分溶解cDNA沉淀;2.溶解完成后,顺序加入下列试剂:1.2ul 10×Ligase Buffer1ul 10mMrATP1ul T4DNA Ligase(4U/ul)3.混匀后,4℃连接3days,或者8℃过夜连接;5双链cDNA末端的磷酸化及XhoI酶切:1.连接反应完成后,将反应体系70℃放置15分钟灭活 T4DNALigase;2.稍微离心使反应物集中至管底,室温下放置5分钟,然后加入下列试剂:1ul 10×LigaseBuffer1ul 10mMrATP6ul ddH2O1ul T4PNK(10U/ul)3.37℃反应30分钟,然后70℃灭活15分钟;4.稍微离心使反应物集中至管底;5.室温放置5分钟;然后加入下列试剂:4ul Xho10×Buffer2ul BSA5ul ddH2O8ul XhoI(10U/ul)6.37℃反应1.5小时,然后65℃灭活酶10分钟;7.反应完成,双链cDNA合成完毕。
置于4℃准备回收。
6.胶回收cDNA(QIAEXII GEL Extraction Kit回收试剂盒)1．配制小胶数板（每个样品一板）：1%琼脂糖凝胶，2ulEB/300ml胶2．取4℃保存样品上样，40ul/孔。
3．电泳50V；1hr4．紫外灯下分别切下500~1kb、1.0-2.0kb及2.0-4.0kbcDNA片段.，分别放入已做标记的 1.5ml离心管中。
5．称取胶重，加入三倍体积bufferQXI（例如，100mg胶中加入300ul buffer QXI）6．50℃ 水浴数分钟，至胶完全融化。
用手指弹QIAEXII使重悬，每管中加入5ul Q IAEXII7．50℃水浴10min，每隔2min取出颠倒混匀数次，使QIAEXII保持悬浮8．4℃，13000rpm，30sec。
基因文库的构建
（2）cDNA与载体相连
cDNA与一个载体在T4连接酶作用下以粘末端 互相连接，即为重组DNA 分子。
（3）导入宿主细胞 重组体在一定条件下导入宿主细胞培
养或保存。 宿主细胞必须是来自一个细胞的克隆
体的寡核苷酸链为探针）
2. mRNA比基因组中基因少, 因此筛选某一特 定功能基因工作量较小。
3. mRNA中拷贝数大于基因组中的拷贝数, 利 于获得较多的模板。（转录特征）
4. 可在原核细胞中表达有生物活性蛋白
5. 不同种类不同状态的细胞的cDNA不同 6. 不能研究基因组的结构功能
构建cDNA1.制备mRNA凝胶阻滞法
DNase Ⅰ足迹法
4.7.1 凝胶阻滞实验
又叫DNA迁移率变动实验（DNA mobility shift assay），是在80年代初期出现的用于 在体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特殊 的凝胶电泳技术。它具有简单、快捷等优点， 也是当前被选作分离纯化特定DNA结合蛋白质定长度的DNA片段克隆到某种载体上发育时期所转录的mRNA 经逆转录形成的cDNA片段与某种载体ene pool)：某一生物群体所拥有的全部基因。
4. 筛选目的基因
原核细胞不可用来作为基因的表达系统 （无转录后加工）。
原核细胞基因库——只能用核酸探针杂 交筛选目反转录酶的作 用下将点：
1. cDNA无内含子, 长度较基因组基因小, 使操皿内所形成的菌落或噬菌斑）转印到硝酸 纤维素膜上，碱解后加带标记的探针进行杂交，能显 示特异结合探针的点（克隆）便是目的基因所在处。 确定菌落或噬菌斑的位置，扩增，提取，再用限制性 酶切出cDNA基因片断，即为目的基因。（如图）
溶菌、使DNA 暴露
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构建cdna文库的基本步骤
《构建cDNA文库的基本步骤》
引言：
cDNA文库的构建是基因组研究中重要的实验技术之一，它可以利用转录酶逆转录RNA为cDNA，然后将其插入适当的载体中，最终形成一个具有表达能力的基因文库。
本文将介绍构
建cDNA文库的基本步骤。
一、总RNA的提取
首先，需要从细胞或组织中提取总RNA，并保证RNA的完整性和纯度。
常用的提取方法包括
酚/氯仿法、硅胶柱法等。
提取得到的总RNA可以用琼脂糖凝胶电泳进行分离和检测。
二、逆转录反应
逆转录反应是将RNA逆转录为cDNA的过程。
在逆转录反应中，需使用逆转录酶、引物和核
苷酸等。
逆转录酶能合成第一链cDNA，引物通常采用寡聚dT引物或随机引物。
三、DNA合成和连接
在逆转录反应后，需要使用DNA聚合酶和核苷酸进行第二链cDNA的合成。
然后，将合成的cDNA连接到选择的载体上，常见的载体有质粒、噬菌体等。
连接过程一般采用连接酶催化反应。
四、转化和筛选
将连接好的载体转化到合适的宿主细胞中，可以通过热冲击法、电穿孔法等方法进行转化。
之后，将转化后的细胞涂在筛选板上，并在含有抗生素的培养基上筛选，筛选出含有目标基因的
克隆。
五、鉴定和分析
最后，对构建好的cDNA文库进行鉴定和分析。
可以利用限制性内切酶等方法进行单克隆检测和鉴定，也可以通过PCR扩增目标基因进行进一步分析。
结论：
构建cDNA文库是一项关键的技术，它为基因组研究提供了丰富的资源。
通过提取总RNA、
逆转录反应、DNA合成和连接、转化和筛选，最终可以得到一个具有表达能力的cDNA文库。
这些步骤的顺利进行和准确操作，对于后续的基因组研究具有重要意义。