项目10标本中未知细菌的分离和鉴定
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项目10:标本中未知细菌的分离和鉴定【目的要求】
熟悉临床标本中常见的病原性细菌的分离鉴定方法。
【实验内容】
一、脓汁、咽拭子等标本中病原性细菌的分离与鉴定
(一)标本采集
1.脓拭子:用无菌棉签蘸取患处深部脓液或分泌物少许,置入无菌空试管内,送检。
2.痰拭子:用消毒容器收集病人痰液,用无菌棉签挑取脓稠痰块,置入无菌空试管内,送检。
3.咽拭子:嘱病人把口张大,用压舌板压住舌根,用无菌棉签迅速蘸取咽部分泌物,置入无菌空试管内,送检。
4.血标本:疑为败血症患者,在严格无菌操作下,静脉采血,床旁直接加入含50ml的肉汤瓶内,立即摇匀后送培养。
5.脑脊液:对疑似流脑患者,作腰椎穿刺取脑脊液,立即行直接床旁接种(送检过程中应注意保温)。
6.尿道、阴道分泌物:对可疑淋病患者,男性可从尿道取材,取材时导尿管应进入尿道1cm~2cm,如为刚排尿,应等待1h左右;女性则可以从宫颈口取分泌物,当内窥器插入宫颈口后应稍等片刻,再旋转取出,取材应立即送检,不可放置冰箱。
(二)分离鉴定程序
待检标本可直接做涂片染色检查鉴定,必要时可做分离培养、生化反应及致病性鉴定。常见的致病性球菌检查程序如下。
直接涂片、革兰染色、镜检(形态、排列、染色性)
脓、痰、咽拭子
分泌物、脑脊液观察菌落性状、溶血性、色素
血琼脂平板→
↑挑取可疑菌落生化反应
血液、穿刺液→肉汤培养基纯分离致病性测定
↓药敏试验
如培养液混浊时可涂片、染色、镜检
(三)常见临床标本的检查方法
1.脓拭子
在脓汁中除了球菌外,也有杆菌存在,例如革兰阳性的有炭疽杆菌、白喉杆菌、结核杆菌、枯草杆菌等,革兰阴性的有大肠杆菌、绿脓杆菌、变形杆菌等,此外尚可有真菌、放线菌、螺旋体等。
【材料】
(1)标本:脓拭子
(2)培养基:血琼脂平板
(3)兔血浆、白色滤纸片、无菌生理盐水、载玻片
【方法】
脓汁→革兰染色→镜检
↓↑
血琼脂平板→观察菌落形态及溶血情况
↓
致病力试验
(1)将脓拭子作革兰染色,镜检(先作培养再涂片以免污染)。标本放置4℃冰箱保存,待报告发出后再丢弃。
(2)将脓汁涂布于血琼脂平板上,再以灭菌接种环作划线分离。置培养37℃培养18h~24h。
(3)经培养后据菌落特点及涂片检查结果进行初步识别,根据需要再作进一步鉴定。若菌落较大、溶血透明、产生金黄色色素、涂片为革兰阳性球菌并成堆排列时可能系葡萄球菌,应确定其为何种葡萄球菌;必要时再作血浆凝固酶试验及甘露醇发酵试验,确定其致病力。
2.咽拭子
咽喉中存在的细菌较多,可以有厌氧及需氧性链球菌、葡萄球菌、肺炎球菌、四联球菌、脑膜炎球菌、卡他球菌、喉杆菌、结核杆菌枯草杆菌、百日咳杆菌肺炎杆菌及绿脓杆菌等。此外也可有白色念珠菌奋森螺旋体等。本实验以咽拭子作为标本,重点检查病原性球菌。
【材料】
(1)标本:咽拭子。
(2)培养基:血琼脂平板。
【方法】
咽拭子
↓
血琼脂平板
↓
观察菌落形态及溶血性
↓
革兰染色,镜检
取标本涂布于血琼脂平板,再以灭菌接种环划线分离,置37℃培养18h~24h 培养。标本放置4℃冰箱保存,待报告发出后再丢弃。
可根据下述特点进行鉴别:
(1)在菌落周围产生2mm~4mm宽、界线分明、完全透明的溶血环、涂片为革兰阳性球菌并呈链状排列,可能是乙型溶血性链球菌。
(2)菌落细小、半透明、有草绿色溶血环、涂片为革兰阳性球菌呈链状排列,可能为甲型溶血性链球菌。需要进一步与肺炎球菌区别时,可做胆汁溶菌试验及菊糖发酵反应。
菌落细小半透明、不溶血、涂片为革兰阳性链状排列的球菌时,为丙型链球菌。
(4)菌落扁平边缘隆起、中央稍凹、半透明、呈草绿色溶血、革兰染色为阳性双球菌、呈矛头状排列时为肺炎球菌,应以胆汁溶菌及菊糖发酵反应与甲型溶血性链球菌区分。
(5)菌落中等大小、表面光滑、呈灰色、革兰染色为阴性双球菌,呈肾形排列时,可能为脑膜炎球菌,需要进一步作氧化酶试验及糖发酵试验(接种于含血清之葡、麦、蔗糖发酵管中)。
二、粪便标本中肠道杆菌的分离与鉴定
(一)标本收集
取患者的粪便或肛门拭子。
(二)鉴定程序
肠道杆菌为一大群革兰阴性杆菌,从形态及染色性上无法鉴别为何种菌,只能依靠生化反应和血清学反应进行鉴定。
患者粪便(粘液、脓血)→肠道选择、鉴别培养基(如ss、中国蓝、伊红美兰)
↓
挑取可疑菌落(据大小、颜色、透明度而定)
↓
双糖铁及其他鉴别培养基
↓
据结果分析鉴定
↓
玻片凝集试验(做出特异性诊断)
将致病菌与诊断血请作玻片凝集→出报告
(三)粪便标本的常用检查方法
从患者粪便或肛门拭子中分离病原菌。
【材料】
(1)标本:患者肛拭子。
(2)培养基:伊红美蓝琼脂平板、双糖铁培养基、蛋白胨水、葡、乳、麦、甘、蔗单糖管及醋酸铅、尿素培养基。
(3)吲哚试剂、沙门氏菌多价诊断血清、痢疾杆菌多价诊断血清、生理盐水、玻片。
【方法】
肛拭子
↓
伊红美蓝琼脂平板
↓
双糖铁培养基
↓↓
多价诊断血清凝集试验可疑菌落做生化反应
(初步鉴定)
(1)取标本拭子涂布伊红美蓝琼脂平板上,再以灭菌接种环划线分离,置37℃培养。标本置4℃冰箱保存,待报告发出后再废弃。
(2)取伊红美蓝琼脂平板观察有无半透明、较小的可疑菌落,挑选单个可疑菌落接种于半固体双糖铁培养基上(每一标本应接种1支~2支双糖铁培养基)。
(3)观察细菌在双糖铁培养基上生长情况
①葡萄糖产酸产气、乳糖分解、动力有或无者,初步鉴定为大肠杆菌。
②葡萄糖及乳糖均不分解而有动力者,初步鉴定为粪产硷杆菌。
③葡萄糖产酸产气、乳糖不分解、没有动力者,初步鉴定为副大肠杆菌。
如属上述三种情况,不必再继续鉴定。