生理生化实验研究方法

1.研究方法

（1）利用生物信息学进行序列检索和同源性分析以及性质与功能预测等，并设计引物；

（2）利用分子生物学技术进行分子克隆、载体构建；

（3）利用农杆菌介导法进行水稻基因遗传转化；

（4）利用E.coli 原核表达系统，进行外源基因诱导表达及Western 免疫印迹检测。

2.技术路线：

OsASP2干涉OsASP2片段抗体制备

OsASP2超表达酶活性测定

转基因植株筛选分子检测与生理生化指标分析

3.实验方法和步骤

1)成功构建以调控水稻细胞质天冬氨酸转移酶(OsASP2)的超表达及干涉载

体，通过农杆菌介导法分别已获得15 株独立的水稻转基因株系，收获T1代转基因种子,T2代筛选纯合子。

2)构建了OsASP2片段的的原核表达载体，在IPTG诱导下已获得大量目标蛋

白表达，并制备多克隆抗体。

3)根据拟南芥天冬氨酸氨基转移酶不同功能的突变位点，构建了不同位点

突变的OsAAT2的载体，将它们分别侵染水稻中花11。

4)对水稻、烟草和大肠杆菌TOP10菌种中天冬氨酸转氨酶(AAT)进行活性染

色，发现它们的AAT分子量大小不同，说明可以在大肠杆菌或烟草中表达水稻突变或非突变OsAAT2的活性。

4.可行性分析：

我已经完成相关专业课程的学习，掌握了相应的实验技术。而且

论文订题比较早，已经开始了相关的实验。且在这一年半的学习中，

已经阅读了大量相关的文献，对研究课题比较了解。加之导师参与过相关课题的直接研究，这些对我的实验都有很重要的指导意义，为课题的顺利完成打下了坚实的基础。

本实验室具备基础生理生化实验及分子生物学研究的常规仪器设备，为本研究提供了硬件支持。本实验室长期进行载体构建及水稻转化实验，积累了大量经验，为本实验的构建各种载体、农杆菌侵染和基因遗传转化等各种工作提供了理论基础。