坂崎肠杆菌检验文稿演示
食品微生物之检验方法-阪崎肠杆菌之检验
附件食品微生物之檢驗方法－阪崎腸桿菌之檢驗1 適用範圍〆本方法適用於一般食品及奶粉中阪崎腸桿菌之檢驗。
2 檢驗方法〆2.1 工作環境〆工作平台須寬敞、潔淨、光線良好，操作平台光度為100呎燭光以上，密閉室內換氣良好，儘可能沒有灰塵及流動空氣。
每15分鐘落菌數不得超過15 CFU／培養皿。
2.2 器具及材料〆2.2.1 乾熱滅菌器。
2.2.2 高壓滅菌釜。
2.2.3 攪拌均質器（Blender）或鐵胃（Stomacher）〆適用於無菌操作者。
2.2.4 天平〆可稱量到2000 g者，靈敏度為0.1 g々可稱量到120 g者，靈敏度為1 mg。
2.2.5 冰箱〆能維持5 ±3℃者。
2.2.6 吸管或吸管尖〆已滅菌，1 mL吸管應有0.01 mL之刻度々5 mL及10 mL吸管應有0.1 mL之刻度。
2.2.7 吸管輔助器（Pipette aid）或微量分注器。
2.2.8 稀釋瓶〆160 mL，玻璃、聚乙烯（polyethylene）、鐵弗龍（Teflon）或其他能耐121℃濕熱滅菌20分鐘以上之塑膠材質，附螺旋蓋。
2.2.9 培養皿〆已滅菌，內徑約9 cm，深度約15 mm，底皿之內外面應平坦，無氣泡、刮傷或其他缺點。
2.2.10 增菌用容器〆附螺旋蓋之125 mL、250 mL、2 L三角錐瓶或廣口瓶々玻璃、聚乙烯、鐵弗龍或其他能耐121℃濕熱滅菌20分鐘以上之塑膠材質。
2.2.11 pH測定儀。
2.2.12 培養箱〆能維持內部溫度在±1℃以內者。
2.2.13 溫度計〆量測溫度範圍1～55℃，最小刻度0.1℃。
2.2.14 水浴〆加蓋，具水流循環系統，能維持水溫溫差在±0.2℃以內者。
2.2.15 接種針及接種環（直徑約3 mm）〆鎳鉻合金、鉑銥或鉻線材質，或可拋棄式者。
2.2.16 曲玻棒〆可滅菌者，直徑3～4 mm，塗抹區域45～55 mm。
2.2.17 試管〆10 ×100 mm，13 ×100 mm，13 ×120 mm，15 ×150 mm，16 ×150 mm試管，或其他適用者。
阪崎肠杆菌_ppt课件
※氧化酶阴性
※过氧化氢酶阳性，并生成黄色菌落
营养成分表
样品
美赞臣 安婴儿婴儿配方奶粉
罐装
配料表： 100%进口奶源配料：乳糖、精炼植物油、浓缩 乳清蛋白、脱脂奶粉、低聚半乳糖（GOS）、 花生四烯酸（ARA）和二十二碳六烯酸（DHA） （来源于单细胞油）、矿物质（碳酸钙、氯化钙、 柠檬酸钾、氯化钾、氯化镁、硫酸亚铁、硫酸锌、 硫酸铜、硫酸锰、亚硒酸钠、碘化钾）、玉米糖 浆固体、维生素（维生素A、维生素D3、维生素 E、维生素C、维生素B1、维生素B2、维生素B6、 维生素B12、维生素K1、胆碱、肌醇、烟酰胺、 叶酸、泛酸、生物素）、牛磺酸、核苷酸、食品 添加剂：磷脂、抗坏血酸棕榈酸酯、氢氧化钙、 碳酸氢钾。
44 ℃±0.5 ℃ 培养24h±2h 。
10 mL mLST-Vm 肉汤
36 ℃±1 ℃培 养24 h±2 h。
各取增菌培养物1 环，分 别划线接种于两个阪崎肠 杆菌显色培养基平板
①前增菌和 增菌
②分离
挑取1 个～5 个可疑菌落，划 线接种于TSA 平板。 25 ℃±1 ℃培养48 h±4 h。
③鉴定
阪崎肠杆菌显色培养基DFI
微生物
菌落颜色
• 阪崎肠杆菌 • 大肠杆菌 • 金黄色葡萄球菌
蓝绿色 无色菌落 被抑制不生长
培养基和试剂
• 4 、胰蛋白胨大豆琼脂（trypticase soy agar， TSA）：见附录A 中A.3。
• 5 、生化鉴定试剂盒。 • 6、 氧化酶试剂：见附录A 中A.4。 • 7、 L-赖氨酸脱羧酶培养基：见附录A 中A.5。 • 8 、L-鸟氨酸脱羧酶培养基：见附录A 中A.6。 • 9 、L-精氨酸双水解酶培养基：见附录A 中A.7
KJ06 阪崎肠杆菌普通PCR法.
阳性结果：282bp PCR扩增产物
4.结果分析
阳性：阴性和空白对照均未出现预期大小的扩增条 带；阳性对照和待测样品均出现预期大小的扩增条 带，怀疑存在阪崎肠杆菌。 阴性：阴性、空白对照及待测样品均未出现预期大 小的扩增条带；阳性对照出现预期大小的扩增条带。 无效试验：阳性对照未出现预期大小的扩增条带。 污染可能：阴性对照和空白对照出现预期大小的扩 增条带。
试剂 仪器设备 方法步骤及注意事项 结果分析 确认试验
1.试剂
增菌： • 改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（MLST） 即：在一升LST中增加氯化钠29.22克；高 压后添加万古霉素10mg/L。 • 脑心浸液（BHI） DNA提取：试剂盒
PCR试剂： 10×PCR buffer、Taq酶、dNTP、ddH2O、 引物、阳性、阴性对照DNA。 电泳： 琼脂糖（分析纯）、溴化乙锭、电泳缓冲 液、加样缓冲液、分子量标记：100 bp DNA ladder。
5.确认试验
PCR阳性结果需做确认试验。 取留存的BHI增菌液接种于VRBGA及显色培 养基，参照标准第一部分挑取可疑菌落进行 鉴定。
6.检验程序
样品100 g加入900 mL MLST中 44°Байду номын сангаас 22 h～24 h
0.2mL MLST增菌液加到5 mL BHI中 36℃1℃ 水浴4h PCR 检测 阴性 阳性
SN/T 1632.1-2005 奶粉中阪崎肠杆菌检测方法
第2部分
奶粉中阪崎肠杆菌的PCR检测方法
增菌液的选择
采用经试验评估的美国杜邦公司BAX系 统相关增菌方法：用改良月桂基硫酸盐 胰蛋白胨肉汤（MLST）对奶粉中阪崎肠 杆菌进行选择性增菌，再用脑心浸液 （BHI）对阪崎肠杆菌在短时间内进行快 速增殖，以供PCR检测。
阪崎肠杆菌的测定.pptx
阪崎肠杆菌的分布
1.环境 原油、切削液、苍蝇、食品加工厂（奶制品、谷类、
巧克力、马铃薯粉），医院（空气、听诊器、临床 食品）、家庭、温泉、鼠、沉积物、沼泽地、土壤 2.食品及相关用品 啤酒杯、干酪、婴儿配方奶粉和豆粉、婴儿配方粉 冲调用品（搅拌器、勺子、甁刷），普通奶粉、碎 牛肉、肉类、香肠、发酵面包、豆腐、蔬菜、水 （管道、生物膜）、调味品
冷藏条件下可以生长 5、在TSA培养基上产生黄色色素 6、产生α-葡萄糖苷酶，其它肠杆菌均不产生； 7、较强的耐干燥性，耐高渗透压， “干燥逆境抗
性”比其他，大多数乳品中分离得到的肠杆菌更 加耐热，但标准的高温短时巴氏杀菌可消灭
5
易感人群
• 阪崎肠杆菌可引起各年龄段的感染，但从 报道病例的年龄分布来看，高危人群主要是 婴儿（即＜1岁的儿童），新生儿（≤28天）、 尤其是早产儿、低出生体重或免疫力下的婴 儿，发生严重感染的危险性最高。
• 母亲HIV阳性的婴儿
6
主要感染渠道
虽然现在还不能确定阪 崎肠杆菌的宿主和传播 模型，但在多起新生儿 阪崎肠杆菌感染事件的 调查中发现婴幼儿配方 粉是主要的感染渠道
7
阪
崎
检
1前增菌 2选择性增菌
测 3平板分离
பைடு நூலகம்
步
4平板确认 5 生化鉴定
骤
8
阪崎肠杆菌检验——前增菌
操作：100g样品+900mL增菌液，培养18h±2h GB使用的增菌液为BPW 主要作用：营养丰富，更利于食品检验具有缓冲体系
10
阪崎肠杆菌检验——平板分离
操作：各取培养物一环，接种显色平板，培养24h±2h 培养基作用 显色培养基 •显色培养基利用阪崎特异性α-葡萄糖苷酶原理，分解底物
食品微生物之检验方法-阪崎肠杆菌之检验
食品微生物之检验方法－阪崎肠杆菌之检验1 适用范围：本方法适用于一般食品及奶粉中阪崎肠杆菌之检验。
2 检验方法：2.1 工作环境：工作平台须宽敞、洁净、光线良好，操作平台光度为100呎烛光以上，密闭室内换气良好，尽可能没有灰尘及流动空气。
每15分钟落菌数不得超过15 CFU／培养皿。
2.2 器具及材料：2.2.1 干热灭菌器。
2.2.2 高压灭菌釜。
2.2.3 搅拌均质器（Blender）或铁胃（Stomacher）：适用于无菌操作者。
2.2.4 天平：可称量到2000 g者，灵敏度为0.1 g；可称量到120 g者，灵敏度为1 mg。
2.2.5 冰箱：能维持5 ± 3℃者。
2.2.6 吸管或吸管尖：已灭菌，1 mL吸管应有0.01 mL之刻度；5 mL及10 mL吸管应有0.1 mL 之刻度。
2.2.7 吸管辅助器（Pipette aid）或微量分注器。
2.2.8 稀释瓶：160 mL，玻璃、聚乙烯（polyethylene）、铁弗龙（Teflon）或其它能耐121℃湿热灭菌20分钟以上之塑料材质，附螺旋盖。
2.2.9 培养皿：已灭菌，内径约9 cm，深度约15 mm，底皿之内外面应平坦，无气泡、刮伤或其它缺点。
2.2.10 增菌用容器：附螺旋盖之125 mL、250 mL、2 L三角锥瓶或广口瓶；玻璃、聚乙烯、铁弗龙或其它能耐121℃湿热灭菌20分钟以上之塑料材质。
2.2.11 pH测定仪。
2.2.12 培养箱：能维持内部温度在± 1℃以内者。
2.2.13 温度计：量测温度范围1～55℃，最小刻度0.1℃。
2.2.14 水浴：加盖，具水流循环系统，能维持水温温差在± 0.2℃以内者。
2.2.15 接种针及接种环（直径约3 mm）：镍铬合金、铂铱或铬线材质，或可抛弃式者。
2.2.16 曲玻棒：可灭菌者，直径3～4 mm，涂抹区域45～55 mm。
2.2.17 试管：10 × 100 mm，13 × 100 mm，13 × 120 mm，15 × 150 mm，16 × 150 mm试管，或其它适用者。
食品卫生微生物学检验-阪崎肠杆菌 ppt课件
阪崎肠杆菌介绍
易感人群:
免疫力低下者和婴幼儿、新生儿， 尤其是早产儿、低体重儿可以致病。感 染来源主要是受阪崎肠杆菌污染的奶粉， 人与人之间无传染性。
阪崎肠杆菌介绍
1、阪崎肠杆菌在自然界分布广泛，在水、土壤、食 物、排泄物等中都能够检出。细菌不耐热，加热到 72℃持续15秒就可以杀灭。细菌不在人与人之间传播。 2、阪崎肠杆菌在一般情况下不对人体健康产生危害， 但对于新生儿，尤其是早产儿、低体重儿可以致病。 3、绝大多数患者为轻症病例，表现为轻微的消化道 症状，恢复良好；重症病例罕见但病死率高。对于发 现的病例应及时报告。
阪崎肠杆菌介绍
阪崎肠杆菌（Enterobater sakazakii）属肠杆菌科肠杆 菌属，革兰染色阴性杆菌。阪崎肠杆菌在自然界分布 广泛，繁殖迅速，但不耐热，可通过巴斯德消毒法杀 灭。阪崎肠杆菌属条件致病菌，在一般情况下，不对 人体健康产生危害，但对于免疫力低下者和婴幼儿、 新生儿，尤其是早产儿、低体重儿可以致病。感染来 源主要是受阪崎肠杆菌污染的奶粉，人与人之间无传
食品卫生微生物学检验-阪崎肠杆菌 ppt课件
阪崎肠杆菌检验 GB/T 4789.40-2008
一、采标情况
二、适用范围 三、操作过程 1 第一法 阪崎肠杆菌的检验 2 第二法 阪崎肠杆菌的计数
阪崎肠杆菌检验 GB/T 4789.40-2008
二、适用范围
适用于婴幼儿配方奶粉、乳和乳制品及 其原料中阪崎肠杆菌的检验
挑取绿色菌落
接种TSA平板
25℃±1 ℃ 48 h ± 4 h 挑取黄色菌落
生化鉴定
阪崎肠杆菌检验
第一部分：一般特征
一．培养特征 二．生化反应 三．抵抗力 四．增殖能力
与其他常见肠杆菌相似
5
一、培养特征
阪崎肠杆菌兼性厌氧，营养要求不高，能在营养琼脂、 血平板、麦康凯(MacConkey，MAC)琼脂、伊红美蓝 琼脂、脱氧胆酸琼脂等多种培养基上生长繁殖。
ES在VRBGA平板上首次划线分离时，37℃培养24h可生成2种不同 的形态学特征： 1. 干燥或粘液状、圆锯齿状（凹口或锯齿），用金属环接触时 可发现坚韧或有弹力，即粘贴金属环的菌量很少，并且菌落 可很快恢复。传代培养后可能会转变为典型的光滑菌落。 2. 光滑、易于用金属环从菌落移取细胞。
阪崎肠杆菌检验
GB 4789.40--2010
Enterobacter sakazakii(ES)
2
内
容
第一部分：一般特征 第二部分：致病性 第三部分E．sakazakii)是人和动物肠道内 寄生的一种革兰阴性无芽孢杆菌，属肠杆 菌科肠杆菌属，是肠道正常菌丛中的一种 ，在一定条件下可引起人和动物致病。 阪崎肠杆菌能引起严重的新生儿脑膜炎、小 肠结肠炎和菌血症，死亡率高达50% 以上 。目前，微生物学家尚不清楚阪崎肠杆菌 的污染来源，但许多病例报告表明婴儿配 方粉是目前发现的主要感染渠道。
7
二、生化反应
8
• DNASE-脱氧核糖核酸酶
注：＋ ：90-100％；(＋) ：75-89%； V ：25-74％；(－)：10 -24％；－ ：0-9％
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三、抵抗力
• 耐热性 • 渗透压 • 干燥
不同菌株的耐热性存在明显的差别，但标准的巴氏消 毒过程能有效的灭活ES。 ES对渗透压的耐受性使该菌能够成为环境中的优势株， 增加PIF（婴儿配方奶）加工后污染的危险性，使其在PIF （婴儿配方奶） 中长期存活。
食品克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)检验原始记录
食品克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）检验原始记录样品编号：检验开始时间：年月日样品名称：检验完成时间：年月日检测项目：克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）检测依据：GB 4789.40-2016 第一法 第二法一、克罗诺杆菌属定性检验无菌操作称（量）取样品100g或ml置于灭菌锥形中，加入900mL已预热至44℃的缓冲蛋白胨水，摇动充分溶解，36±1℃培养18±2h，移取1mL转种于10mLST-Vm肉汤，44±0.5℃培养24±2h。
轻轻混匀培养物，各取1环，分别划线于两个阪崎杆菌显色培养基平板，36±1℃培养24±2h。
挑取可疑菌落，划线于TSA平板，25±1℃培养48±4h。
观察，挑取可疑菌落进行生化鉴定。
二、克罗诺杆菌属平板计数法无菌操作称（量）取样品100g（ml）、10g（ml）、1g（ml）置于灭菌锥形中，加入900mL、90mL、9mL已预热至44℃的缓冲蛋白胨水，摇动充分溶解，36±1℃培养18±2h，移取1mL转种于10mLST-Vm肉汤，44±0.5℃培养24±2h。
轻轻混匀培养物，各取1环，分别划线于两个阪崎杆菌显色培养基平板，36±1℃培养24±2h。
挑取可疑菌落，划线于TSA平板，25±1℃培养48±4h。
挑取可疑菌落进行生化鉴定。
注：+生长或有可疑菌落；-未生长或无可疑菌落。
计算及结果：定性检验：得100g(mL) 计数法，查MPN检索表，得MPN/g,mL电子天平编号：使用状况试验前：试验后：培养箱编号：使用状况试验前：试验后：检测人：校核人：审核人：。
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第一法 阪崎肠杆菌的检验
阪崎肠杆菌检验程序
检样 10010g0（g（mmLL））+BPW稀释液 900 mL
36℃±1℃，18 h±2h
1mL + mLST-Vm 10mL 44℃±0.5℃，24 h±2h
DFI琼脂 36℃±1℃，24 h±2h
挑取蓝绿色菌落
前增菌 选择性增菌
选择性分离
TSA 25℃±1℃，48h±4h
ES及亲缘关系较近的肠杆菌生化反应比较
生化反应1
试验
阪崎 肠杆菌
阴沟 肠杆菌
产气 肠杆菌
成团 肠杆菌
日勾维 肠杆菌
赖氨酸脱羧酶 精氨酸双水解酶 鸟氨酸脱羧酶 KCN生长 发酵:
蔗糖
－
－
＋
－
＋
＋
＋
－
－
－
＋
＋
＋
－
＋
＋
＋
＋
v
＋
＋
＋
＋
(＋)
＋卫矛醇－Fra bibliotek(－)
－
(－)
－
核糖醇
－
(－)
＋
－
－
棉子糖
＋
＋
＋
v
＋
D-山梨醇
3. 2004年荷兰乳及乳制品控制中心对各种阪崎肠杆菌检测方法 的比较研究；
4. 雀巢研究中心2005年环境样品中阪崎肠杆菌快速检测方法； 5. 阪崎肠杆菌快速检测培养基DFI研究资料。
• SN第一部分：分离与计数方法 第二部分：PCR方法 第三部分：荧光PCR方法
常见选择性培养基
• DFI (Oxoid, UK) • ESIA (AES, France) • R＆F（R&F Laboratories，Switzerland） • OK medium • 其他：国内阪崎肠杆菌显色培养基、CES (Merck,
1. 硫化氢指示剂可以区分ES和产生少量α-葡萄糖苷酶但H2S阳 性菌株（如普通变形杆菌）。
2. ES都可以在DFI平板上生长并产生蓝绿色菌落 3. 其他常见菌在DFI平板的菌落颜色
a. 白色菌落：肺炎克雷伯氏菌、阴沟肠杆菌、大肠埃希氏 菌、泛菌属的多种菌等
b. 黄色菌落：赫氏埃希氏菌 c. 黑褐色、粉色或中心蓝绿菌落：少量菌种
－
＋
＋
v
－
χ-甲基-葡萄糖甙
＋
(＋)
－
－
－
D-阿拉伯糖醇
－
(－)
＋
－
＋
黄色素
＋
－
－
(＋)
－
注：＋ ：90-100％；(＋) ：75-89%； V ：25-74％；(－)：10 -24％；－ ：0-9％
第三部分
食品卫生微生物学检验 阪崎肠杆菌检验
主要内容
一、制订的主要依据 二、《食品卫生微生物学检验 阪崎肠杆菌检验》
• ESIA:蓝色，1-3mm
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选择性增菌肉汤的选择
• FDA方法选择EE肉汤，ISO方法选择mLST-Vm ，即在LST中加入Nacl和Vm。本标准使用 mLST-Vm。
• EE肉汤适合所有肠道菌群的生长繁殖，这就可能 对ES的生长产生竞争性抑制作用，降低检出率。
• 研究证明与其他肠杆菌科细菌（如沙门氏菌，大 肠埃希氏菌等）相比，ES具有较高的耐渗透压能 力。加入0.5M的Nacl在保证ES良好生长的同时 ，可以有效地抑制上述其他细菌的生长。
• Vm可有效地抑制G+菌的生长。而较高的生长温 度可以进一步抑制其他细菌的生长。
二、食品卫生微生物学检验 阪崎肠杆菌检验
本标准修改采用
1. ISO/TS 22964 （ 1st edition 2006-02-01 ） Milk and milk products — Detection of Enterobacter sakazakii
二、培养特征
• G－无芽孢杆菌，兼性厌氧，在6℃-47℃范 围内均可生长，适温35-37℃
• 营养要求不高： VRBGA、TSA、NA、MAC、EMB、其他
与其他常见肠杆菌相似
三、生化反应
生化反应
D-山梨醇 产生吐温80脂酶 细胞外Dnase 氧化酶试验 黄色菌落 α-葡萄糖苷酶
结果
+ + + +
挑取黄色菌落 生化鉴定 报告
生化鉴定
5.1 前增菌和增菌
加样入已预 热到44℃的
BP中
左图：未混合； 右图：混合后。
5.2 分离
DFI 36℃±1℃ 24 h±2h
黄色素
TSA： 25 ℃培养后 典型ES：黄色
阴性对照E. coli ATCC 25922：白色菌落
5.3 鉴定（生化反应）
2.ESIA和DFI的基本原理相似，二者都是根据ES能 产生α-葡萄糖苷酶，分解底物XaGlc产生有色菌 落。
3.VRBGA对ES的选择性差，ES、阴沟肠杆菌和成 团肠杆菌等多种肠道菌都可以在该平板上生长并 产生粉紫色菌落，胆汁酸沉淀形成紫色晕圈。
显色培养基的选择性较好
• DFI对ES的选择性较好，ES形成的蓝绿色特征性菌落 易于辨认，而且：
2. FDA July 2002; Revised August 2002 Isolation and Enumeration of Enterobacter sakazakii from Dehydrated Powdered Infant Formula
第一法：阪崎肠杆菌的检验 第二法：阪崎肠杆菌的计数
坂崎肠杆菌检验文稿演示
优选坂崎肠杆菌检验
Enterobacter sakazakii(ES)
内容
第一部分：一般特征 第二部分：流行病学特征 第三部分：ES的检验
第一部分：一般特征
一．命名 二．培养特征 三．生化反应 四．抵抗力 五．增殖能力 六．致病性
一、命名
1980年之前一直被称为黄色阴沟肠杆菌。 • DNA-DNA杂交 • 生化反应 • 黄色素 • 抗生素敏感性
Germany)，NA+ -MUG
显色培养基的特点
-葡萄糖苷酶活性
指示剂：
1. 5-溴-4-氯-3-吲哚-，D-吡喃葡糖甙（XGlc） 2. 4-甲基伞形酮--D-葡糖苷（-MUG） 3. 4-邻硝基苯--D-吡喃葡糖甙
选择性培养基的选择
1. FDA方法使用VRBGA，ISO 方法中使用ESIA， 本方法中我们选用DFI。
制订的主要依据
1. ISO 2006年“乳和乳制品中阪崎肠杆菌的检测”（Milk and milk products—Detection of Enterobacter sakazakii）方法；
2. 美国FDA 2002年颁布的“婴儿配方粉中阪崎肠杆菌的分离和 计数”（Isolation and Enumeration of Enterobacter sakazakii from Dehydrated Powdered Infant Formula）方法；