蛋白质沉淀浓缩方法原理及详细解析

卵白质沉淀浓缩方法原理及详细解析之马矢奏春创作

在生化制备中,沉淀主要用于浓缩目的,或用于除去留在液相或沉淀在固相中的非需要成份.在生化制备中经常使用的有以下几种沉淀方法和沉淀剂：

1．盐析法多用于各种卵白质和酶的分离纯化.

2．有机溶剂沉淀法多用于生物小分子、多糖及核酸产物的分离纯化,有时也用于卵白质沉淀.

3．等电点沉淀法用于氨基酸、卵白质及其它两性物质的沉淀.但此法独自应用较少,多与其它方法结合使用.

4．非离子多聚体沉淀法用于分离生物年夜分子.

5．生成盐复合物沉淀用于多种化合物,特别是小分子物质的沉淀.

6．热变性及酸碱变性沉淀法用于选择性的除去某些不耐热及在一定PH值下易变性的杂卵白.

第一节盐析法

一般来说,所有固体溶质都可以在溶液中加入中性盐而沉淀析出,这一过程叫盐析.在生化制备中,许多物质都可以用盐析法进行沉淀分离,如卵白质、多肽、多糖、核酸等,其中以卵白质沉淀最为罕见,特别是在粗提阶段.

盐析法分为两类,第一类叫Ks分段盐析法,在一定PH和温度下通过改变离子强度实现,用于早期的粗提液；第二种叫Kb分段盐析法,在一定离子强度下通过改变PH和温度来实现,用于后期进一步分离纯化和结晶.

一．影响盐析的若干因素

1．卵白质浓度

高浓度卵白溶液可以节约盐的用量,但许多卵白质的b 和Ks常数十分接近,若卵白浓渡过高,会发生严重的共沉淀作用；在低浓度卵白质溶液中盐析,所用的盐量较多,而共沉淀作用比力少,因此需要在两者之间进行适被选择.用于分步分离提纯时,宁可选择稀一些的卵白质溶液,多加一点中性盐,使共沉淀作用减至最低限度.一般认为2.5%-3.0%的卵白质浓度比力适中.

2．离子强度和类型

一般说来,离子强度越年夜,卵白质的溶解度越低.在进行分离的时候,一般从低离子强度到高离子强度顺次进行.每一组分被盐析出来后,经过过滤或冷冻离心收集,再在溶液中逐渐

提高中性盐的饱和度,使另一种卵白质组分盐析出来.

离子种类对卵白质溶解度也有一定影响,离子半径小而很高电荷的离子在盐析方面影响较强,离子半径年夜而低电荷的离子的影响较弱,下面为几种盐的盐析能力的排列次第：磷酸钾>硫酸钠>磷酸铵>柠檬酸钠>硫酸镁.

3．PH值

一般来说,卵白质所带净电荷越多溶解度越年夜,净电荷越少溶解度越小,在等电点时卵白质溶解度最小.为提高盐析效率,多将溶液PH值调到目的卵白的等电点处.但必需注意在水中或稀盐液中的卵白质等电点与高盐浓度下所测的结果是分歧的,需根据实际情况调整溶液PH值,以到达最好的盐析效果.

4．温度

在低离子强度或纯水中,卵白质溶解度在一定范围内随温度增加而增加.但在高浓度下,卵白质、酶和多肽类物质的溶解度随温度上升而下降.在一般情况下,卵白质对盐析温度无特殊要求,可在室温下进行,只有某些对温度比力敏感的酶要求在0-4℃进行.

二．硫酸铵的使用

硫酸铵中常含有少量的重金属离子,对卵白质巯基有敏感作用,使用前必需用H2S处置：将硫酸铵配成浓溶液,通入H2S饱和,放置过夜,用滤纸除去重金属离子,浓缩结晶,100℃烘干后使用.另外,高浓度的硫酸铵溶液一般呈酸性（PH=5.0左右）,使用前也需要用氨水或硫酸调节至所需PH.

硫酸铵的加入有以下几种方法：1）加入固体盐法用于要求饱和度较高而不增年夜溶液体积的情况；2）加入饱和溶液法用于要求饱和度不高而原来溶液体积不年夜的情况；3）透析平衡法先将盐析的样品装于透析袋中,然后浸入饱和硫酸铵中进行透析,透析袋内硫酸铵饱和度逐渐提高,到达设定浓度后,目的卵白析出,停止透析.该法优点在于硫酸铵浓度变动有连续性,盐析效果好,但手续烦琐,需不竭丈量饱和度,故多用于结晶,其它情况少见.

使用固体硫酸铵时：1）必需注意饱和度表中规定的温度,一般有0℃或室温两种,加入固体盐后体积的变动已考虑在表中；2）分段盐析中,应考虑每次分段后卵白质浓度的变动.一种卵白质如经二次透析,一般来说,第一次盐析分离范围（饱和度范围）比力宽,第二次分离范围较窄.3）盐析后一般放置半小时至一小时,待沉淀完全后才过滤或离心.过滤多用于高浓度硫酸铵溶液,因为此种情况下,硫酸铵密度较年夜,若用离心法需要较高离心速度和长时间的离

心把持,耗时耗能.离心多用于低浓度硫酸铵溶液.

第二节有机溶剂沉淀法

有机溶剂的沉淀机理是降低水的介电常数,招致具有概况水层的生物年夜分子脱水,相互聚集,最后析出.该法优点在于：1）分辨能力比盐析法高,即卵白质或其它溶剂只在一个比力窄的有机溶剂浓度下沉淀；2）沉淀不用脱盐,过滤较为容易；3）在生化制备中应用比盐析法广泛.其缺点是对具有生物活性的年夜分子容易引起变性失活,把持要求在高温下进行.总体来说,卵白质和酶的有机溶剂沉淀法不如盐析法普遍.

有机溶剂的选择首先是能和水混溶,使用较多的有机溶剂是乙醇、甲醇、丙酮,还有二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、乙腈和2-甲基-2,4戊二醇等.

有多种因素影响有机溶剂的沉淀效果：1）温度高温可坚持生物年夜分子活性,同时降低其溶解度,提高提取效率；2）样品浓度和PH 与盐析法中的作用基秘闻同；3）金属离子一些多价阳离子如Zn2++和Ca2+在一定PH下能与呈阴离子状态的卵白质形成复合物,这种复合物在水中或有机溶剂中的溶解度都年夜年夜下降,而且不影响卵白质的生物活性.4）离子强度盐浓度太年夜或太低都对分离有晦气影响,对卵白质和多糖而言盐浓度不超越5%比力合适,使用的乙醇量不超越二倍体积为宜.

第三节其他沉淀法

一．等电点沉淀法

两性电解质分子上的净电荷为零时溶解度最低,分歧的两性电解质具有分歧的等电点,以此为基础可进行分离.如工业上生产胰岛素时,在粗提液中先调pH8.0去除碱性卵白质,再调pH3.0去除酸性卵白质.

利用等电点除杂卵白时必需了解制备物对酸碱的稳定性,否则盲目使用十分危险.很多卵白质与金属离子结合后,等电点会发生偏移,故溶液中含有金属离子时,必需注意调整PH值.等电点法常与盐析法、有机溶剂沉淀法或其他沉淀方法联合使用,以提高其沉淀能力.

二．生成盐复合物沉淀法

1．金属复合盐法

许多有机物质包括卵白在内,在碱性溶液中带负电荷,能与金属离子形成沉淀.根据有机物与它们之间的作用机制,可分为羧酸、胺及杂环等含氮化合物类,如铜锌镉；亲羧酸疏含氮化合物类,如概镁铅；亲硫氢基化合物类,如汞银铅.卵白质-金属离子复合物的重要性质是它们的溶解度对溶液的介电常数非常敏感,调整水溶液的介电常数（如加入有机溶剂）,即可沉淀多种卵白.

2．有机盐法

含氮有机酸如苦味酸、苦酮酸、鞣酸等能与有机分子的碱性功能团形成复合物而沉淀析出.但此法常发生不成逆的沉淀反应,故用于制备卵白质时,需采纳较温和的条件,有时还需