丝氨酸蛋白酶抑制剂

综述
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HIV蛋白酶在Phe－Pro，Phe－Leu，Phe－Thr的特异性 剪切，使得抑制剂的设计必须具备高度可变性。目前， 有8类蛋白酶抑制剂用于HIV治疗，包括替拉那韦，印地 那韦，沙奎那韦，洛匹那韦。新一代的抑制剂正在被开 发以发挥最大的疗效，来治疗病患。目前治疗HIV的第 二代蛋白酶抑制剂TMC－114已进入临床Ⅲ阶段测试中。 这些药物制剂的研究成功引起了人们对于蛋白酶抑制剂 治疗作用的极大兴趣。下面将集中介绍蛋白酶抑制剂针 对多种疾病的潜在使用价值。
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1.3 分子结构
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• 丝氨酸蛋白酶抑制剂是一类单链蛋 白质，它们的一级结构及特性多种 多样，仅氨基酸的数量就从大约29 个到400个。经序列分析和X射线衍 射图谱分析，这些抑制剂并非同源。 基于其序列、拓扑结构及功能的相 似性，丝氨酸蛋白酶抑制剂可分为 至少20个家族。
2 作用机理
丝氨酸蛋白酶抑制剂按其抑制机理的不同分为典型 的丝氨酸蛋白酶抑制剂、非典型的丝氨酸蛋白酶抑 制剂及serpin类丝氨酸蛋白酶抑制。
3.3 活性鉴定方法
热稳定性 材料中丝氨酸蛋白酶抑制剂样品溶液（质量终浓 度50mg/ml）在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、 80℃、90℃和100℃加热10 min, 取出后立即放 冰上冷却，然后用检测抑制剂活性的方法测定 处理样品的抑制活性 酸碱稳定性 将材料中丝氨酸蛋白酶抑制剂样品溶液（质量终 浓度50 mg/ml）与等体积的pH 2-11的各种缓冲 溶液（缓冲溶液为0.2M氨基乙酸-HCl 缓冲溶液， pH 2和3；0.2M乙酸-乙酸钠缓冲溶液，pH 4和5； 0.2M磷酸氢盐缓冲溶液，pH 6,7和8；0.2M氨基 乙酸-NaOH缓冲溶液，pH 9,10和11）混合，4℃ 放置18h，然后用0.4M Tris–HCl缓冲溶液，pH 7.8调整抑制剂混合溶液的pH值为7.8，并测定 其抑制剂活性。
1.1 理化性质
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1 理化 性质 种类 分布 及结 构
目前在人、动物、植物、真菌、细菌及病毒中发现的丝 氨酸蛋白酶抑制剂超过1500种，根据其序列相似性、二 硫键拓扑结构和反应位点的不同，Laskowski和Kato (1980)将丝氨酸蛋白酶抑制剂分为八个不同的超家族， 2000年进一步分为17个蛋白家族。丝氨酸蛋白酶抑制剂 一般为单一肽链蛋白质，且氨基酸残基具有较强的保守 性。丝氨酸蛋白酶抑制剂分子一般由350～500个氨基酸 残基组成，在X光下的晶体结构一般为球状蛋白并含有9 个α －螺旋和3个β －折叠。
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4.3 研究展望，重点是需要研究的方面
蛋白酶抑制剂在合成工艺方面存在相当的难度，受限于 技术、成本等问题，目前主要利用物理、化学或者生物 化学方法 因此，研究人员已着手构建含有抑制剂基因的工程菌株， 利用微生物发酵成本低、产量大和可控性高的有点，尝 试进行规模化生产，满足人们对于抑制剂的实际需要。
4.2 作为食品、化工、临床药物的优点与局限 丝氨酸蛋白酶抑制剂具有广泛的生物活性和作 用，在新药研制和防治疾病方面具有广阔的前 景。蛋白酶抑制剂可与病毒蛋白酶催化基因结 合抑制酶活性，导致蛋白前体裂解和形成成熟 病毒体。现阶段，经国家食品药品监督管理局 批准生产的蛋白酶抑制剂仅有3个品种。这主 要是由于蛋白酶抑制剂在合成工艺方面存在相 当的难度，受限于技术、成本等问题，目前主 要利用物理、化学或者生物化学方法，从动植 物及微生物体内收集材料例如动物的血液以及 植物的块根块茎等提取各类丝氨酸蛋白酶抑制 剂，并不能大量低成本地获得抑制剂蛋白，从 而使得其不能大规模投入生产
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4、对所获得的蛋白酶抑制剂CaSPI进行结合比和及最小抑 制常数Ki测定，结果为CaSPI与胰蛋白酶结合比为1.15： 1时能完全抑制蛋白酶水解活性，Ki为0.46μ M，表明 CaSPI为竞争性抑制剂。并对其进行稳定性（时间、温 度、pH、金属离子及变性剂）检测，表明CaSPI具有相 当的稳定性。
• 典型的丝氨酸蛋白酶抑制剂
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• 非典型的丝氨酸蛋白酶抑制剂多来源于吸血生 物，特异性地阻断参与凝血反应的酶，尤其是 凝血酶和Xa因子。这类抑制剂通过N端与酶的酶 切位点相互作用行使抑制功能。
3 功能作用
最基本的功能是防止不必要的蛋白水解，调节丝氨酸蛋 白酶的水解平衡。作为调控物，丝氨酸蛋白酶抑制剂参 与机体免疫反应，对生物体内的血液凝固、补体形成、 纤溶、蛋白质折叠、细胞迁移、细胞分化、细胞基质重 建、激素形成、激素转运、细胞内蛋白水解、血压调节、 肿瘤抑制以及病毒或寄生虫致病性的形成等许多重要的 生化反应和生理功能有重要的影响
1.2 种类、分布
• 分布：广泛存在于动物、植物、微生物体中。在动物体 中。 • 种类：根据活性位点氨基酸种类不同可将蛋白酶抑制剂 分为四大类型:丝氨酸蛋白酶抑制剂、巯基蛋白酶抑制 剂、天冬氨酸蛋白酶抑制剂和金属蛋白酶抑制剂。其中 尤以丝氨酸蛋白酶及其抑制剂在体内一些重要生理活动 中起关键性的调控作用。
• 三、活性物质的 研究方法及手段 • 3.1研究的技术路 线及方案 • 3.2分离纯化方案 • 3.3 活性鉴定方 法 • 3.4 基因克隆
物 质 简 介
丝氨酸蛋白酶抑制剂具有广泛的生物活性和作用，在新 药研制和防治疾病方面具有广阔的前景。蛋白酶抑制剂 可与病毒蛋白酶催化基因结合抑制酶活性，导致蛋白前 体裂解和形成成熟病毒体。作为一类重要的艾滋病药物， 蛋白酶抑制剂市场可谓是一块诱人的大蛋糕。目前已经 投入市场的蛋白酶抑制剂主要有：奈非那韦、沙奎邦韦、 茚地那韦、安泼那韦、利托那韦、洛匹那韦及复合制剂。
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5、琼脂糖凝胶电泳 6、DNA凝胶纯化 7、连接反应 8、大肠杆菌DH5α 的感受态制备 9、连接产物转化 10、菌液PCR鉴定 11、RACE扩增鲫鱼卵中serpin基因3’端和5’端的引物设 计
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3.4 基因克隆
利用RT-PCR和RACE技术，获得了一条全长为1397bp，其 中包括1233bp完整的开放阅读框的核酸序列，编码410 个氨基酸。对由核酸序列推测的氨基酸序列分析显示， 在52-408处具有SERPIN结构域。 1、总RNA提取 2、RNA浓度测定 3、RNA反转录 4、引物设计及PCR扩增条件
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3.1 研究的技术路线及方案
3 活 性物 质的 研究 方法 及手 段
材料 收集 及预 处理
材料 及原液收集
、处理
色谱层析 、HPLC 分离
Trizol 法提取 RNA
收集峰冷冻离心
3 ’ 和 5 ’ RACE 克隆
不同的峰活性检测
PCR 扩增
理化性质研究
PCR 产物回收
PCR 鉴定，测序
材料 蛋白酶Hale Waihona Puke Baidu制剂
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4.1 应用
天然的蛋白酶抑制剂具备抗病毒的潜能，能控 制外源细菌释放的蛋白酶水解抑制特异性病毒 生长并使自身细胞不受伤害。基于上述功能， 蛋白酶抑制剂作为药物使用已经被研究开发了 好多年，目前已被用于治疗人类免疫缺陷病 （HIV）和高血压等疾病。血管紧张素转化酶 （ACE）抑制剂是一个用于药物治疗的蛋白酶 抑制剂。ACE能催化血管紧缩素Ⅰ和血管紧缩 素Ⅱ的水解，一个有效的血管收缩药能使缓激 肽失活。而ACE抑制剂通过降低周围血管阻力 达到降低血压的目的，同时ACE抑制剂能降低 蛋白尿和稳定肾功能，对治疗糖尿病肾病有疗 效。ACE抑制剂的使用最初源于1977年。目前 其它的ACE抑制剂也已投入市场。
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3、利用RT-PCR和RACE技术，获得了一条全长为1397bp，其 中包括1233bp完整的开放阅读框的核酸序列，编码410 个氨基酸。对由核酸序列推测的氨基酸序列分析显示， 在52-408处具有SERPIN结构域。经过BLAST比对，该蛋 白与来源于动物脑膜液的CP9等serpins超家族的丝氨酸 蛋白酶抑制剂具有高度同源性，并且在P1位置处为精氨 酸（Arg），推测该蛋白属于Sepins超家族一员
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丝氨酸蛋白 酶抑制剂
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• 一、物质简 介
二、研究进展 • 1. 理化性质、种类、分布及结 构 • 1.1 理化性质 • 1.2 种类、分布 • 1.3 分子结构 • 1.4 基因表达及cDNA编码特点 （若有研究需综述） • 2 作用机理 • 3 功能作用 • 4 应用 • 4.1 应用 • 4.2 作为食品、化工、临床药物 的优点与局限 • 4.3 研究展望，重点是需要研究 的方面
基因生物信息学分析
3.2分离纯化方案
1、收集动物组织，以发色底物对其进行丝氨酸蛋白酶抑制 活性测定，包括胰蛋白酶、弹性蛋白酶、枯草杆菌蛋白 酶和胰凝乳蛋白酶。
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2、通过ConA Sepharose 4B亲和层析、Sephadex G-75凝胶 过滤、反相高压液相等生化技术手段，从中获得一个表 观分子量约为43kDa的单链蛋白。我们将其命名为CaSPI。 CaSPI对胰蛋白酶具有专一性的抑制活性。Edman降解法 测序结果显示CaSPI的N-末端氨基酸序列为EAHPSHSGED。 糖蛋白检测结果表明CaSPI属于糖蛋白。接合活性测定中， CaSPI在SDS-PAGE电泳时能与胰蛋白酶形成稳定的复合物， 该结果提示它可能属于serpins蛋白超家族中的一员。