感受态细胞常用的制备方法

感受态细胞常用的制备方法

常态的细胞不能摄入外部溶液中的DNA，，所以要转化质粒DNA进入大肠杆菌必须首先制备感受态的大肠杆菌细胞。受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl，RuCl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞(competent cell) 。

转化，是将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，是基因工程等研究领域的基本实验技术。进入细胞的DNA分子通过复制表达，才能实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。转化过程所用的受体细胞一般是限制－修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。?

α-互补现象：因为许多载体都带有一个LacZ基因的调控序列和头146个氨基酸的编码信息，编码α-互补肽，该肽段能与宿主编码的缺陷型β-半乳糖苷酶实现基因内互补（α-互补）。当这种载体转入可编码?－半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞中时，在异丙基-?-D 硫代半乳糖苷（IPTG）的诱导下，宿主可同时合成这两种肽段，虽然它们各自都没有酶活性，但它们可以融为一体形成具有酶活性的蛋白质。所以称这种现象为α-互补现象。由互补产生的α－半乳糖苷酶(LacZ)能够作用于生色底物5－溴－4－氯－3－吲哚－β－D－半乳糖苷(X-gal)而产生蓝色的菌落，所以利用这个特点，在载体的该基因编码序列之间人工放入一个多克隆位点，当插入一个外源DNA时，会造成LacZ(α)基因的失活，破坏α-互补作用，就不能产生具有活性的酶。所以，有重组质粒的菌落为白色，而没有重组质粒的菌落为蓝色。

杆菌电转化感受态细胞制备经验过程

实验步骤：

1、将适合菌株（如XL1-Blue, DH5α）置于LB或其他营养丰富的培养基上，在37°C下过夜培养。

2、高温灭菌大的离心瓶（250-500ml）。准备几瓶灭菌水（总量约1.5升），保存于冷冻室中以备重悬浮细胞用。

3、转移0.2-1ml过夜培养物至装有500ml LB（或其他营养丰富的培养基）的1-2升挡板摇瓶中。

4、37°C下剧烈振荡培养2-6小时。

5、定时监控O.D.600值（培养1小时后每半小时测定一次），当O.D.600值达到0.5-1.0时，从摇床中取出摇瓶，置于冰上冷却至少15分钟（需要的话这种方式可以存放培养液数小时）。

6、细胞在4°C 5000g下离心15分钟，弃上清液（如需要，沉淀可在4°C的10%甘油中保存一两天）。

7、用灭菌的冰水重悬浮细胞。先用涡旋仪或吸液管重悬浮细胞于少量体积中（几毫升），然后加水稀释至离心管的2/3体积。

8、照上面步骤重复离心，小心弃去上清液。

9、照上面步骤用灭菌的冰水重悬浮细胞。

10、离心，弃上清液。用20ml灭菌的、冰冷后的10%甘油重悬浮细胞14. 照上面步骤离心，小心弃去上清液（沉淀可能会很松散）。

11、用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为2-3ml。

12、将细胞按150μl等份装入微量离心管，于-80°C保存。

转化方法:

1、在冰上解冻电感受态细胞添加1-10μl DNA ，冰上培育约5分钟。

2、添加1-3μl DNA ，冰上培育约5分钟。

3、转移DNA/细胞混合物至冷却后的2mm电穿孔容器（无泡）中。

4、加载P1000，准备好300μl LB 或2xYT 。

5、对电穿孔容器进行脉冲（200 欧姆, 25μFd, 2.5 千伏）（检查时间常数，应该在3以上）。

6、立即添加300μl 的LB或2xYT至电穿孔容器中。

7、37°C下培养细胞40分钟至1小时以复原。

8、转移细胞至适当的选择培养基上培养。

高效感受态细胞制备

方法一：

效率非常高，一般可到10*8，好时可到10*9，特别适宜于大片段与文库构建及珍贵材料的连接转化。

实验试剂：

A液：1M，MnCl2：

B液：1M，HEPES，pH=6.2-6.8，用无菌水配，配后不需灭菌；

C液称取CaCl2 0.10g，KCl 1.18g，全部转入细口试剂瓶，然后加入46ml三蒸水，轻轻振荡使所有组分充分溶解。将瓶塞盖上并用牛皮纸、棉线包扎，然后放入灭菌锅121℃高压灭菌备用。

取1管B液（0.6ml），全部加入C液(46ml)中，混匀后，再用1ml移液器加入3.3ml A液，混匀冰浴即可使用。

实验步骤：

1、划线得到单菌落,37℃培养箱培养约17小时。

2、挑取2-4个形态饱满的单菌落接种于装有100ml SOB 培养基的三角瓶,37℃剧烈振荡（300 rpms）培养3-4小时。

3、将培养温度调至18℃剧烈振荡（3280 rpms）培养，其余与普通感受态差不多。

4、每管加入4ml TB缓冲液，轻轻振荡，使菌体重新悬浮。

5、加入280ml DMSO（可用国产分析纯），混匀后分装入1.5ml EP管，冰上静置15分钟。

6、用纱布将所有装有感受态的EP管包好，用棉线系好后放入液氮中速冻，在液氮中静置12小时以上。

7、取出感受态放入-70℃超低温冰箱备用。

注意事项：

1、洁净是最重要的。无菌都无所谓，在操作台上可正常操作。

2、离心力要注意不要超过2500g,建议1500-2000g 5min。

3、涂板不要觉得不匀而多次反复，轻轻在平板上带一下感觉板上大部分地方走过即可，特别在冰箱中保存过或在温箱中温浴2小时以上的板。

4、涂完后建议空气晾干（20-30分钟）这样会减少卫星菌落出现。

5、预冷是必要的。整个过程的低温也并非特别重要。