水污染的生物监测

环境污染生物监测

实验讲义

主编：孟范平马冬冬

二OO九年一月

前言

《环境污染生物监测》是环境科学专业的一门前沿课程。生物监测采用敏感的指示生物或生物标识物阐明环境污染的过程、范围和程度，从生物学角度来揭示环境质量状况。同常规的物理、化学监测手段相比，生物监测具有综合性、灵敏性、连续性、多功能性、简便易行等优点，因而在环境污染监测中发挥着越来越重要的作用。

本课程设置实验的目的是培养环境科学专业的学生综合运用已有的生物化学、环境生物学、环境毒理学、环境微生物学等专业理论知识，熟悉国内外常见指示生物和生物标志物的工作原理和使用方法，丰富学生环境监测专业知识体系，开阔视野，培养利用当地典型指示生物和生物标识物进行环境污染监测的能力。

讲义编写人员近年来先后承担国家863计划、山东省优秀中青年科学家奖励基金项目、青岛市科技攻关项目等多项纵向科研课题，在整理已获得的科研成果基础上，精选了蚕豆根尖微核效应（一般性实验）、乙酰胆碱酯酶提取与活性测定方法（综合性实验）、发光细菌法监测海水生物毒性（一般性实验）、海水镉污染对双壳类金属硫蛋白的诱导（设计性实验）等实验作为本讲义的主要内容，完成这些实验的教学预计至少需要17学时。

建议课程开设过程中进行分组实验，要求每位学生亲自动手实践，善于通过实验现象的观察和实验规律的总结，获得分析问题和解决问题的能力，并独立完成实验报告。

编者

2009年1月

目录

实验一海洋鱼类乙酰胆碱酯酶的提取及活性测定⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅3实验二含镉废水对蚕豆根尖的微核效应⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅9实验三海水的生物毒性监测—发光细菌法⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅15实验四海水镉污染对双壳类金属硫蛋白的诱导⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅19

实验一海洋鱼类乙酰胆碱酯酶的提取及活性测定

（类型：综合性实验）

一、实验目的

动物脑组织中所含的乙酰胆碱酯酶[acetylcholinesterase,AChE(EC3.1.1.7)]对有机磷农药十分敏感，在一定条件下，AChE的活性变化与体系中有机磷农药的浓度存在良好的相关性。通过本实验可掌握鱼类等动物脑组织AChE的提取和活性测定方法，为利用AChE对海水中的有机磷农药进行生物监测积累经验。

二、实验原理

鱼类等动物的脑组织在磷酸盐缓冲液中低温匀浆后，离心得到的上清液即为AChE的提取液。作为底物的碘化硫代乙酰胆碱（ATChI）被AChE分解为乙酸和碘化硫代胆碱，后者与5,5—双二硫代(2—硝基苯甲酸)反应，生成一种黄色络合物，于波长412nm处比色。以酶促反应的初速度来确定酶的活性。

三、实验材料与仪器

（一）实验材料

1、冰冻的鲅鱼(Scomberomorus niphonius Curier)或鲜活的黄鱼(Hexagrammos otakii)2条。

2、0.1mol·L-1（pH8.0）磷酸盐缓冲液（含1%Triton X-100）

先配制1mol·L-1的NaH2PO4和1mol·L-1的Na2HPO4溶液，分别移取1mol·L-1 NaH2PO4溶液6.8ml和1mol·L-1Na2HPO4溶液93.2ml于容量瓶中，然后加入10ml聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100)，用重蒸水稀释至1000ml。置于4℃保存。

3、75mmol·L-1碘化硫代乙酰胆碱溶液

准确称取2.1689g碘化硫代乙酰胆碱（ATChI，MW=289.18），用0.1mol·L-1（pH 8.0）磷酸盐缓冲液稀释定容至100ml。置于4℃保存。

4、10mmol·L-15,5-双二硫代(2-硝基苯甲酸)溶液：准确称取0.3964g的5,5-双二硫代(2-硝基苯甲酸)（DTNB，MW=396.34），用0.1mol·L-1（pH8.0）磷酸盐缓冲液

稀释定容至100ml。置于4℃保存。

（二）实验器材

百分之一电子天平1台；托盘天平1台；水浴锅1台；玻璃匀浆器1只；高速冷冻离心机1台；紫外可见分光光度计（配10mm比色皿）1台；100μl标准移液枪；冰箱1台；旋涡混合器1只。

25ml或50ml量筒1支；10ml量筒1支；手术剪刀1把；镊子1把；定性滤纸1盒；小表面皿1只；离心管2支；5ml小试管。

四、实验步骤

1、酶的提取（粗酶液制备）

（1）取2条鱼，用剪刀将鱼头背面剪开，剥去头顶骨，用镊子取出鱼脑组织，用滤纸吸去表面的血丝，并用镊子轻轻除去非脑组织，将鱼脑放入铝箔上，在电子天平上称得鱼脑的净重W。

（2）将称重后的鱼脑迅速用镊子置于玻璃匀浆器中，按匀浆比（质量体积比）1：4加入预冷的含1%Triton X-100的磷酸盐缓冲液（pH8.0，0.1mol·L-1），冰浴匀浆。

（3）将匀浆液转入一支离心管中，另一支离心管中加入一定量的蒸馏水，将两支离心管（分别加入匀浆液或蒸馏水）放在托盘天平两端的烧杯中，通过向后一支离心管添加或吸出蒸馏水，调节其重量与前一支离心管相等。注意：为保护离心机正常运转，两支离心管的重量必须平衡！

（4）将上述两支重量已调节平衡的离心管对称放入离心机转头四周的离心杯内，在4℃下离心（12000r/min）30min，匀浆液离心得到的上清液即为粗酶液，置于4℃下冷藏保存，备用。

2、酶活测定

（1）打开分光光度计电源，将波长调至412nm，预热至少15min。

（2）在装有3.00ml磷酸盐缓冲液（0.1mol·L-1，pH8.0）的小试管中，加入20μl粗酶液，混匀，30℃保温10min。

（3）依次加入100μl的DTNB溶液和20μl的ATChI溶液，充分混匀，反应体系的总体积为3140μl。