Oligo合成的一种优化方法
race技术原理和操作
RACE（rapid amplification of cDNA ends）技术的原理和操作近年来随着生物技术的不断发展，出现了许多克隆新基因的方法和手段，如图谱克隆技术、转座子标签技术、mRNA差异显示技术、基因组减法技术以及cDNA文库筛选技术等。
但上述方法大多具有实验周期长、技术步骤烦琐且工作量大等特点。
cDNA末端快速扩增技术（rapid amplification of cDNA ends，RACE）是一种基于PCR从低丰度的转录本中快速扩增cDNA的5'和3'末端的有效方法，以其简单、快速、廉价等优势而受到越来越多的重视。
经典的RACE技术是由Frohman等（1988）发明的一项技术，主要通过RT-PCR技术由已知部分cDNA序列来得到完整的cDNA 5' 和3' 端，包括单边PCR和锚定PCR。
该技术提an 出以来经过不断发展和完善，克服了早期技术步骤多、时间长、特异性差的缺点（Frohm 等，1995：Schaefer，l995： Chen，1998： Bespalova等，1998： Matz等11999）。
对传统RACE技术的改进主要是引物设计及RT-PCR技术的改进：改进之一是利用锁定引物（lock docking primer）合成第一链cDNA，即在oligo(dT)引物的3' 端引入两个简并的核苷酸[5'-Oligo(dT)16-30MN-3'，M=A/G/C；N=A/G/C/T]，使引物定位在poly(A)尾的起始点，从而消除了在合成第一条cDNA链时oligo(dT)与poly(A)尾的任何部位的结合所带来的影响；改进之二是在5' 端加尾时，采用poly(C)，而不是poly(A)；改进之三是采用RNase H-莫洛尼氏鼠白血病毒（MMLV）反转录酶或选择嗜热DNA 聚合酶可能在高温（60℃~70℃）有效地逆转录mRNA，从而消除了5' 端由于高CC含量导致的mRNA 二级结构对逆转录的影响；改进之四是采用热启动PCR（hot start PCR）技术和降落PCR（touch down PCR）提高PCR反应的特异性。
多片段拼接法克隆人表皮生长因子受体2基因
Hans Journal of Biomedicine 生物医学, 2022, 12(1), 1-8Published Online January 2022 in Hans. /journal/hjbmhttps:///10.12677/hjbm.2022.121001多片段拼接法克隆人表皮生长因子受体2基因陈婉煜，刘君怡，李国庆，刘媛媛，陈华波*湖北文理学院，基础医学院，湖北襄阳收稿日期：2021年10月16日；录用日期：2021年12月23日；发布日期：2021年12月30日摘要鉴于从cDNA库中克隆长基因较困难的现实，采取分步扩增与DNA组装相结合的方式，提出一种长基因克隆解决方案。
以克隆人表皮生长因子受体2基因为例，先分别扩增出该基因的三个片段F1、F2和F3。
通过重叠延伸PCR融合前两个片段得到F12，再利用双片段连接法将F12与F3一起连接插入载体以构建完整基因。
从双片段连接物中筛选出上百个菌落，经检测和序列测定，得到一个序列完全准确的克隆。
对于难以直接克隆的长基因，可先扩增其各个片段，再将它们拼接成完整基因。
其中双片段连接法可突破严格的酶切位点要求对单片段顺序连接的限制，再辅以重叠延伸PCR融合法，即可实现多个基因片段的正确拼接。
关键词基因克隆，重叠延伸PCR，双片段连接法，人表皮生长因子受体2基因Cloning of Human Epidermal GrowthFactor Receptor 2 Gene by MultiFragment AssemblyWanyu Chen, Junyi Liu, Guoqing Li, Yuanyuan Liu, Huabo Chen*Basic Medical College, Hubei University of Arts and Science, Xiangyang HubeiReceived: Oct. 16th, 2021; accepted: Dec. 23rd, 2021; published: Dec. 30th, 2021AbstractIt was difficult to clone long genes from cDNA library due to a series of factors, such as mRNA in-stability and the low efficiency of reverse transcription. Combining partial amplification with DNA assembly, an optimal solution was proposed for cloning lone gene that was difficult to amplify *通讯作者。
cdna产物浓度低oligo浓度正常的原因
cdna产物浓度低oligo浓度正常的原因产物浓度低，oligo浓度正常的原因可能有以下几个方面：1.反应条件不理想：反应温度、时间或其他反应条件不适当，导致反应效率低。
例如，在PCR反应中，如果反应温度过高或过低，酶活性可能会下降，导致产物浓度较低；或者反应时间太短，循环数不足，也会影响产物的积累。
2.引物设计不合理：引物序列的特异性和互补度对产物浓度有显著影响。
如果引物序列的特异性不高，可能会引起非特异性扩增，使产物浓度降低。
另外，引物互补度也会影响PCR的选择性和效率，过高或过低的互补度都可能导致产物浓度低。
3.酶的活性受抑制：PCR反应中使用的酶如果受到抑制物的影响，如PCR抑制物、RNA酶或其他抑制剂，可能会导致产物浓度降低。
4.反应体系中的杂质：反应体系中存在的杂质和污染物（如DNA残留、金属离子、盐等）可能对PCR反应有影响，干扰DNA合成和扩增过程，导致产物浓度低。
5.DNA模板质量差：DNA模板可能存在降解、失活或含有抑制物质，阻碍了扩增过程，导致产物浓度低。
因此，在PCR反应中，选择合适质量和纯度的DNA模板至关重要。
6.实验技术操作不规范：PCR反应中需要严格控制实验操作条件，包括样品混合、反应物加入顺序、反应体系的均匀性等。
如果实验操作不规范，可能会导致产物浓度低。
针对产物浓度低，oligo浓度正常的问题，可以考虑采取以下措施：1.优化反应条件：对反应温度、时间和循环数等条件进行优化，选择最适合的反应条件，提高反应效率和产物积累量。
2.重新设计引物：对引物序列进行优化设计，提高特异性和互补度，减少非特异性扩增。
3.检查酶的活性：确保使用的酶具有高活性和稳定性，不受抑制物的干扰。
4.去除反应体系中的杂质：通过纯化DNA模板、使用高质量的试剂和消除污染物等方法，减少反应体系中的杂质影响。
5.考虑增加DNA模板的浓度：对于产物浓度低的问题，可以尝试增加DNA模板的浓度，以提高产物的积累量。
PCR和RT-PCR区别
PCR和RT-PCRPCR和RT-PCR基础PCR基础聚合酶链式反应（PCR）过程利用模板变性，引物退火和引物延长的多个循环来扩增DNA序列。
这是一个指数增长的过程，因为上一轮的扩增产物又作为下一轮扩增的模板，使其成为检测核酸的一种非常灵敏的技术。
一般，经过20-30个循环得到的扩增产物就足够在溴化乙锭染色的凝胶上观察到。
反应包括几个成分（表1）。
模板可以为纯化的基因组或质粒DNA；由RNA转化得到的cDNA；或未经纯化的粗制生物样品，如细菌克隆或噬菌斑。
引物确定了扩增产物的序列和长度。
最常用的热稳定聚合酶是Taq DNA聚合酶。
这种酶适用于常规扩增，但是使用其他热稳定聚合酶会改善结果。
扩增反应还包括缓冲液，三磷酸脱氧核苷及镁离子。
镁离子浓度影响酶的活性、引物退火、模板和PCR产物的熔点（Tm），忠实性以及引物二聚体的形成等。
在随后的章节中将讨论这些成分、循环参数以及其他参与作用的因子相互间各种作用对于成功PCR的影响。
表1.反应成分Component Final ConcentrationTemplate 10^4-10^6 copies of DNA templatePrimer 1Primer 210X Reaction buffer 1XMagnesiumdNTP mix 200 mM each dNTPThermostable DNA polymerase 1-4 units/100 ml reactionRT-PCR基础RT-PCR将以RNA为模板的cDNA合成同PCR结合在一起，提供了一种分析基因表达的快速灵敏的方法。
RT-PCR用于对表达信息进行检测或定量。
另外，这项技术还可以用来检测基因表达差异或不必构建cDNA文库克隆cDNA。
RT-PCR比其他包括Northern印迹、RNase保护分析、原位杂交及S1核酸酶分析在内的RNA 分析技术，更灵敏，更易于操作。
RT-PCR的模板可以为总RNA或poly(A)+选择性RNA。
rtpcr原理
RT-PCR是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。
首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。
RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。
作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。
RT-PCR用于对表达信息进行检测或定量。
另外，这项技术还可以用来检测基因表达差异或不必构建cDNA文库克隆cDNA。
RT-PCR比其他包括Northern印迹、RNase保护分析、原位杂交及S1核酸酶分析在内的RNA分析技术，更灵敏，更易于操作。
逆转录反应可以使用逆转录酶，以随机引物、oligo(dT)或基因特异性的引物（GSP）起始。
RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。
在两步法RT-PCR中，每一步都在最佳条件下进行。
cDNA的合成首先在逆转录缓冲液中进行，然后取出1/10的反应产物进行PCR。
在一步法RT-PCR中，逆转录和PCR在同时为逆转录和PCR优化的条件下，在一只管中顺次进行。
逆转录酶（reverse transcriptase）是存在于RNA病毒体内的依赖RNA的DNA聚合酶，至少具有以下三种活性：1、依赖RNA的DNA聚合酶活性：以RNA为模板合成cDNA第一条链2、 Rnase水解活性：水解RNA杂合体中的RNA；3、依赖DNA的DNA聚合酶活性：以第一条DNA链为模板合成互补的双链cDNA.用于反转录的引物可视实验的具体情况选择随机引物、Oligo dT 及基因特异性引物中的一种。
对于短的不具有发卡结构的真核细胞mRNA，三种都可。
RT-PCR实验有三步：抽提RNA，RT，PCR。
试验前注意：1. 做RT前必需测RNA浓度，逆转录体系对RNA量还是有一些要求，常用500ng或1ug2. RT按要求做，一般不会出太大问题。
引物设计技巧及优化_生工生物技术讲座
引物设计需考虑的问题 ¾ 引物错配：
• 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相 似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3’端出现3 个以上的连续碱基，如GGG 或CCC，也会使错误引发机率 增加。
¾ 引物特异性：
• 引物设计完成以后，应对其进行Primer-BLAST检测。如 果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了 。 • 设计跨内含子的引物，为了将从基因组DNA和cDNA扩增 的条带区分开来 。
¾ 合适长度：
• 18-24 bp适合普通PCR扩增。 • 30-35 bp适合多重PCR扩增。
¾ 产物大小：
• 300-1000 bp适合普通PCR，避免> 3 kb • 50-150 bp适合real-time PCR，避免> 400 bp
引物设计需考虑的问题
¾ 序列Tm值:上下游引物的Tm值（melting temperature）是 寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50 %寡核 苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm值 5~10 ℃。若按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估计引物的 Tm值。 ¾ 合适的Tm值： • 52 ℃ - 60 ℃ 。 • 65 ℃以上避免。 • 75 ℃ - 80 ℃来扩增高GC含量的片段。 ¾ 上下游引物Tm值的错误： • 上下游引物Tm值错误，可能导致扩增失败。 • 上下游引物Tm值相差最好 < 3 ℃ 。
5
氧化 :缩合反应时核 苷酸单体是通过亚 磷酯键与连在CPG 上的寡核苷酸连接， 而亚磷酯键不稳定， 易被酸、碱水解， 此时常用碘的四氢 呋喃溶液将亚磷酰 转化为磷酸三酯， 得到稳定的寡核苷 酸。
常见问题及解答 ¾ 怎样溶解引物？
基因文库构建的过程、原理及方法
基因⽂库构建的过程、原理及⽅法基因⽂库构建的过程、原理及⽅法1 cDNA ⽂库的构建1.1 cDNA ⽂库构建的基本原理与⽅法cDNA ⽂库是指某⽣物某发育时期所转录的全部 mRNA 经反转录形成的 cDNA ⽚段与某种载体连接⽽形成的克隆的集合。
经典 cDNA ⽂库构建的基本原理是⽤ Oligo(dT) 作逆转录引物，或者⽤随机引物，给所合成的 cDNA 加上适当的连接接头，连接到适当的载体中获得⽂库。
其基本步骤包括：RNA 的提取(例如异硫氰酸胍法，盐酸胍—有机溶剂法，热酚法等等，提取⽅法的选择主要根据不同的样品⽽定)，要构建⼀个⾼质量的 cDNA ⽂库，获得⾼质量的 mRNA 是⾄关重要的，所以处理 mRNA 样品时必须仔细⼩⼼。
由于RNA 酶存在所有的⽣物中，并且能抵抗诸如煮沸这样的物理环境，因此建⽴⼀个⽆ RNA 酶的环境对于制备优质 RNA 很重要。
在获得⾼质量的 mRNA 后，⽤反转录酶 Oligo(dT) 引导下合成 cDNA 第1链， cDNA 第2链的合成(⽤ RNA 酶 H 和⼤肠杆菌 DNA 聚合酶 I，同时包括使⽤ T4 噬菌体多核苷酸酶和⼤肠杆菌 DNA 连接酶进⾏的修复反应)，合成接头的加⼊、将双链DNA 克隆到载体中去、分析 cDNA 插⼊⽚断，扩增 cDNA ⽂库、对建⽴的 cDNA ⽂库进⾏鉴定。
这⾥强调的是对载体的选择，常规⽤的是λ噬菌体，这是因为λ DNA 两端具有由12个核苷酸的粘性末端，可⽤来构建柯斯质粒，这种质粒能容纳⼤⽚段的外源 DNA。
1.2 cDNA 全长⽂库经典 cDNA ⽂库的构建虽然⾼效、简便，但⽂库克隆的⽚段⼀般较⼩，单个克隆上的 DNA⽚段太短，所能提供的基因信息很少，⼤多需要⼏个克隆才能覆盖⼀个完整的全基因的 cDNA。
为了克隆到真正的 cDNA 全长，建⽴富含全长的 cDNA⽂库具有重要意义。
为此，必须克服仅⽤ mRNA 的 PolyA 尾合成以及由普通逆转录酶作⽤特点所导致的局限性。
RT-PCR及其产物电泳分析ppt课件
④ 循环次数 PCR循环次数取决于模板DNA的浓度，一般为25－35次，PCR产物可达最大值 。
20
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PCR体系的优化
➢ PCR反应成分浓度的优化 ① Taq DNA聚合酶：1～2.5U/100μL反应液。 ② dNTP浓度：20～200μmol/L，且四种底物浓度相等，以减少错误掺入的机
3
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RT反应试剂 （1）引物： Oligo(dT)16，寡聚胸甘酸16个，要求mRNA有poly(A)尾巴（mRNA 1-4%） （2）逆转录酶 ： 鼠白血病病毒莫洛尼株 （MMLV）、鸟类成髓细胞瘤病毒（AMV ） （3）RT反应缓冲液：常用5×浓度。 （4）底物：即四种dNTP的混合物溶液，常用10×浓度（2 mmol/L或2.5 mmol/L）。 （5）模板 （6）RNasin
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实验原理
RT反应：在逆转录酶作用下，以mRNA为模板合成cDNA（complementary DNA）分子 的过程。 PCR反应：PCR扩增是模拟天然DNA复制过程，利用DNA聚合酶在体外扩增一对引物 之间特异性DNA片段的方法。其主要热循环过程可分为三个步骤：（1）变性；（2）退 火；（3）延伸 。 RT-PCR: 以RT反应产物cDNA分子为模板进行特异性PCR扩增的过程，是检测基因表 达最常用的方法。
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结果分析
M
1 23
观察结果： ① 是否有扩增产物。 ②如有拖尾或有几条区带,说明有非特异性扩增 。 ③分子量标准电泳后区带是否分开。 ④与分子量标准比较，PCR产物的长度是否正确 。 ⑤PCR产物的产量。 ⑥引物二聚体。
降落PCR
降落PCR的原理及常见问题解答回答：Touchdown PCR是指每隔一个循环降低1°C反应退火温度，直至达到“Touchdown”退火温度，然后以此退火温度进行10个左右的循环。
该方法最初出现是为了避开确定最佳退火温度而进行的复杂的反应优化过程。
正确和非正确退火温度之间的任何差异将造成每个循环PCR产物量的两倍差异（每摄氏度造成4倍差异）。
因此相对于非正确产物，正确的产物可以得到富集该方法的另一个应用是在确定已知序列肽的DNA序列。
具体过程如下：使用两套与已知序列肽两末端可能配对的简并引物，这只需要知道一段长为13个氨基酸的肽段序列，5’和3’引物各长18个碱基（6个氨基酸），两者之间有一个碱基以上的间隔。
使用简并引物即可以进行“Touchdown PCR”。
由这种方法将获得大量的产物，但因为由肽序列可以知道引物之间的确切距离，所以可以根据产物的大小来选择所需要的产物。
该方法的优点在于可以富集引物与模板正确配对的产物。
如果克隆和测需一打PCR 产物，将可以确定肽的正确编码序列，设计进行杂交的寡核苷酸等。
该技术特别适用于由S er，Lys和Arg（每个有6个密码子）构成的多肽。
提问：降落PCR的优点？回答：综合比较普通PCR技术和最大耐受量聚合酶链反应，认为前者程序简单，省时，一般的PCR扩增仪都可完成，但缺点是退火温度不适当时容易出现假阳性;而最大耐受量聚合酶链反应虽然程序复杂，需要扩增仪有较大的内存，但能非常有效地降低或避免假阳性，且不在理想的工作条件（比如最佳镁离子浓度）下也可扩增出产物。
这就是降落PCR技术的优点吧。
不过我认为。
如果能用普通PCR技术扩出来的话，尽量用普通的聚合酶链反应，虽然降落聚合酶链反应比较省事省力，但是，它在一个很宽的退火温度里扩增，乱七八糟的条带肯定比较多哈。
虽然，电泳可能看不到。
降落PCR的一个优点是可以增加某些基因的特异性,不仅我自己在扩基因的艰难历程中,发现了这一优点,而且也推荐给周围的人,如果常规PCR循环程序的基因扩增效果不佳,我就来热启动加降落PCR.在非特异性背景较高的情况下,这招的确有效,但不绝对。
race技术原理和操作
RACE（rapid amplification of cDNA ends）技术的原理和操作近年来随着生物技术的不断发展，出现了许多克隆新基因的方法和手段，如图谱克隆技术、转座子标签技术、mRNA差异显示技术、基因组减法技术以及cDNA文库筛选技术等。
但上述方法大多具有实验周期长、技术步骤烦琐且工作量大等特点。
cDNA末端快速扩增技术（rapid amplification of cDNA ends，RACE）是一种基于PCR从低丰度的转录本中快速扩增cDNA的5'和3'末端的有效方法，以其简单、快速、廉价等优势而受到越来越多的重视。
经典的RACE技术是由Frohman等（1988）发明的一项技术，主要通过RT-PCR技术由已知部分cDNA序列来得到完整的cDNA 5' 和3' 端，包括单边PCR和锚定PCR。
该技术提出以来经过不断发展和完善，克服了早期技术步骤多、时间长、特异性差的缺点（Frohman等，1995：Schaefer，l995：Chen，1998：Bespalova等，1998：Matz等11999）。
对传统RACE技术的改进主要是引物设计及RT-PCR技术的改进：改进之一是利用锁定引物（lock docking primer）合成第一链cDNA，即在oligo(dT)引物的3' 端引入两个简并的核苷酸[5'-Oligo(dT)16-30MN-3'，M=A/G/C；N=A/G/C/T]，使引物定位在poly(A)尾的起始点，从而消除了在合成第一条cDNA链时oligo(dT)与poly(A)尾的任何部位的结合所带来的影响；改进之二是在5' 端加尾时，采用poly(C)，而不是poly(A)；改进之三是采用RNase H-莫洛尼氏鼠白血病毒（MMLV）反转录酶或选择嗜热DNA 聚合酶可能在高温（60℃~70℃）有效地逆转录mRNA，从而消除了5' 端由于高CC含量导致的mRNA 二级结构对逆转录的影响；改进之四是采用热启动PCR（hot start PCR）技术和降落PCR（touch down PCR）提高PCR反应的特异性。