甾体类化合物的生物转化技术
微生物生物转化甾体化合物生产雄烯二酮研究进展
微生物生物转化甾体化合物生产雄烯二酮研究进展作者：梁建军，汪文俊来源：《湖北农业科学》 2012年第7期梁建军，汪文俊（中南民族大学生命科学学院，武汉４３００７４）摘要：雄烯二酮（ＡＤ）和雄二烯二酮（ＡＤＤ）是甾体激素类药物重要的中间体，目前以微生物植物甾醇生物转化生产ＡＤ（Ｄ）是研究的热点，综述了微生物生物转化植物甾醇生产雄烯二酮的研究进展。
关键词：雄烯二酮（ＡＤ）；雄二烯二酮（ＡＤＤ）；甾体化合物；生物转化；Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐ．中图分类号：Ｑ９３９．９文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０12）07－1309-03雄烯二酮（ＡＤ）、雄二烯二酮（ＡＤＤ）是甾体激素类药物不可替代的中间体，几乎所有甾体激素药物都可以以ＡＤ（Ｄ）为起始原料进行生产。
以廉价的甾体化合物制备ＡＤ（Ｄ）受到越来越多的重视，植物甾醇如β－谷甾醇、菜油甾醇烷和菜油甾醇等价格低廉，自发现分支杆菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）可以选择性降解甾体化合物侧链生产１７酮－甾体化合物以来，植物甾醇已成为制备ＡＤ（Ｄ）的首选原料。
１ＡＤ（Ｄ）生产的原料采用具有甾体结构且廉价的原料生产甾体类化合物，这些化合物都有甾体环戊烷多氢菲母核结构。
薯蓣皂甙在２０世纪７０年代以后很长的一段时期占据着主导地位，由于需求日增，薯芋资源日渐枯竭，其利用率较低、成本高而使得商业化利润降低，人们开始开拓新的资源。
植物甾醇主要来源于油脂的生产废渣及其他工业废物，如豆油、油菜子、制糖废渣、工业废物及造纸废水［１-３］。
表１列出了可利用不同甾体化合物为底物生产ＡＤ（Ｄ）的微生物。
２生物转化甾体化合物生产ＡＤ（Ｄ）的方法２．１水相中微生物生物转化方法甾体化合物在水中溶解度极低，限制了微生物利用其进行生物转化的能力。
细胞壁和细胞膜作为底物进入胞浆的屏障会极大地影响生物转化的产率［８，９］。
万古霉素、氨基乙酸、卵磷脂、鱼精蛋白、多粘菌素Ｂ九肽、乙胺丁醇、杆菌肽和聚乙烯亚胺等都可以引起Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ相关菌株的细胞壁缺失［８－１０］。
甾体类化合物
表9-1 天然甾体化合物的种类及结构特点
名称
A/B
B/C
C/D
C17-取代基
植物甾醇
顺、反
反
反
8～10个碳的脂肪
烃
胆汁酸
顺
反
反
戊酸
C21甾醇
反
反
昆虫变态激素
顺
反
强心苷
顺、反
反
顺
C2H5
反
8～10个碳的脂肪
烃
顺
不饱和内酯环
蟾毒配基
顺、反
反
甾体皂苷
顺、反
反
反
六元不饱和内酯
环
反
含氧螺杂环
甾体生物碱
4
天然甾体化合物的结构特点
（cardiac glycosides） 一、强心苷概述
是生物界中存在的一类对心脏有显著生理活性的甾体苷类， 是由强心苷元与糖缩合的一类苷。
它们主要分布于夹竹桃科、玄参科、百合科、萝摩科、 十字花科等十几个科的一百多种植物中。常见的有毛花洋地黄、 紫花洋地黄、黄花夹竹桃、毒毛旋花子、铃蓝、海葱、羊角拗 等。
17
（2）α-去氧糖： 常见于强心苷类，是区别于其 它苷类成分的一个重要特征。
有2，6-二去氧糖如D-洋地黄毒糖等；2，6-二
去氧糖甲醚如L-夹竹桃糖、D-加拿大麻糖等。
CH3 O H, OH
CH3 O H, OH
HO OH
HO OCH3
D-洋地黄毒糖 D-加拿大麻糖
16
CH3
O
OH H , OH
CH3 HO
O
H , OH
HO
OH
OHOH
D-鸡纳糖 D-弩箭子糖
CH3 O H , OH
第七章 甾体化合物
第 七 章 甾体类化合物甾体——化学结构中都具有甾体母核----环戊烷骈多氢菲。
甾体类在结构中都具有环戊烷骈多氢菲的甾核。
甾类是通过甲戊二羟酸的生物合成途径转化而来。
天然甾类化合物的分类 C 21甾: 是含有21个碳的甾体衍生物。
以孕甾烷或其异构体为基本骨架。
C 5、C 6——多具双键C 17——多为α-构型,少为β-构型 C 20——可有>C=O 、-OHC 11——可有α-OHC-3、8、12、14、17、20——可能有β-OH 强心苷 ： 是存在于植物中具有强心作用的甾体苷类化合物，由强心苷元和糖缩合而产生的一类苷。
海洋甾体化合物 ：不少海洋甾体化合物具有显著的抗肿瘤活性。
海洋甾体化合物具有活性强、结构复杂的特点。
第一节 强心苷（考点；结构类型，甲乙型） 强心苷是存在于植物中具有强心作用的甾体苷类化合物，由强心苷元和糖缩合而产生的一类苷。
强心苷是治疗室率过快心房颤动的首选药和慢性心功能不全的主要药物。
第一节、 结构和分类1.基本结构：强心苷是由强心苷元与糖二部分构成。
一.强心苷元部分：强心苷元是由甾体母核与C 17取代的不饱和内酯环组成 。
（1）苷元母核 ： 苷元母核A 、B 、C 、D 四个环的稠合构象对强心苷的理化及生理活性有一定影响。
2.结构类型：根据C 17位侧链的不饱和内酯环不同分为：甲型：C 17位侧链为五元环的△αβ-γ内酯 （五元不饱和内酯环）； 乙型：C 17位侧链为六元环的△αβ-γδ -γ内酯（六元不饱和内酯环） 这两类大都是β-构型，个别为α-构型，α-型无强心作用。
二、糖部分 根据C 2位上有无-OH 分为α-OH （2-OH ）糖及α-去氧糖（2-去氧糖）两类。
后者主要见于强心苷。
强心苷中，多数是几种糖结合成低聚糖形式再与苷元的C 3-OH 结合成苷，少数为双糖苷或单糖苷。
糖和苷的连接方式有三种： Ⅰ型:苷元-(2,6-去氧糖)X -(D-葡萄糖)Y Ⅱ型:苷元-(6-去氧糖)X -(D-葡萄糖)Y Ⅲ型：苷元-（D-葡萄糖）Y X=1-3; Y=1-2 一般初生苷其末端多为葡萄糖。
微生物甾体羟化技术及其应用
收稿日期：２００５—０９一１２ 作者简介：胡海峰．男．生于１９６７年，研究员，主要从事微生物药物的研究与开发。
万方数据
微生物甾体羟化技术及其应用胡海峰等
·７７·
菌的生长细胞或静息细胞迸行的。无论酶的来源如 何，甾体羟化酶都是一种细胞色素Ｐ４５０依赖的金属 酶，其反应式如下：
ＲＨ＋ＮＡＤＰＨ＋０２＿ＲＯＨ＋ＮＡＤＰ＋＋ＯＨ。 由于这些酶能将１ｍｏＵＬ Ｏ：引入底物，因此被 定义为单氧化酶。这种细胞色素ｉ０４５０依赖的单氧 化酶广泛的存在于几乎所有形式的生命体中，以游 离或膜结合的形式存在。羟基形成机制根据同位素 示踪实验的研究结果证实转化到甾体上的羟基是直 接取代甾体碳架上的氢原子，并且取代过程中没有 产生立体构象的变化，也不是先通过形成烯的中问 体来完成的，也就是说羟基取代的立体构象是由原 来氢原子所占的空问位置决定。经“０：、ＤＯ：及 Ｈ，Ｏ”分别实验确定，羟化作用的氧不来自水中的氢 氧基，而是来自空气中的氧，这一点从理论上说明工 业上用黑根霉转化甾体时需要充分供氧的原因。黑 根酶的羟化反应与温度有密切关系，最佳生长温度 ２６～２８℃，超过３２℃不再生长，主要不发生羟化作 用。黄曲霉（Ｒｎ－４０５）的转酮酶缺陷突变株ＡＦ９６１２ 的最佳培养温度，最佳发酵温度都在２８℃，其中发 酵温度对转化率的影响很显著，升高２℃，转化率下 降１５％～２０％【６ Ｊ。从ＣｙｔＰ４５０类单加氧酶催化机制 看，羟化反应与温度关系密切可能与Ｃｙｔ］？４５０单加 氧酶本身活性中心氨基酸残基对热敏感有关。 １．３弪化反应的研究进展 甾体的羟化发展很快，并在甾体工业上取得了 巨大成果，目前人们在这方面的工作主要在于怎样 进一步降低成本。甾体的水不溶性是困扰整个甾体 工业的问题，解决这一问题的方法主要有３种：第 一，使用有机溶剂，如甲醇、ＤＭＦ、ＤＭＳ０等，但由于 这些溶剂对微生物存在毒性，其浓度往往控制在较 低的范围；第二种解决方式就是环糊精的应用， Ｃｈｉｎｃｈｏｌｋａｒ等研究了在Ｂ．环糊精（１３－ＣＤ）存在时 ＣｕｒｒｕｌａｒｉｖＶＫＭＦ６４４对１１－脱氢皮甾醇（Ｒｅｉｃｈｓｔｅｉｎ Ｓ 化合物，简称化合物ｓ）的１１Ｂ羟化，当化合物Ｓ与 Ｂ—ｃＤ比率为Ｉ．０：０．６时，氢化可的松的产率为 ７０％～７５％（底物浓度为４９／Ｌ），而未使用１３一ＣＤ的 产率只有４０％～５０％【”；第三种解决方法是固定化 细胞等新技术的应用，例如Ｐｅｔｚｌｏｄｔ等首次用Ｐｅｎｉ— ｃｉｌｌｉｚ，＿＿ｍ ｒａｉｓｔｒｉｃｋｉｉ进行１９一去甲基一１３－乙基雄甾４—烯一 ３，１７双酮（ＧＤ）的１５ｄ羟化，其１５ｄ羟化衍生物是 生产口服避孕药△５－Ｄ－十八甲基炔诺酮ｇｅｓｔｏｄｅｎｅ 的重要中间体；将Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｒａ ｒａｉｓｔｒｉｃｋｉｉ４７７固定在藻 酸钙凝胶上制成固定化细胞，在４０ｄ中进行了１０批
甾体
紫外线
H2C
HO
存在于：人体皮肤，受紫外线照射破裂转化成维生素D3
胆甾醇在酶催化下氧化成7-脱氢胆甾醇。7-脱氢胆 甾醇存在于皮肤组织中，在日光照射下发生化学反应， 转变为维生素D3： 维生素D3是从小肠中吸收Ca2+离子过程中的关键 化合物。体内维生素D3的浓度太低，会引起Ca2+离子 缺乏，不足以维持骨骼的正常生成而产生软骨病。
一类对心脏有显著生理活性的甾体苷类，是由 强心苷元（cardiac aglycones）与糖缩合的一类 苷。
它们主要分布于夹竹桃科、玄参科、百合科、萝摩科、
十字花科等十几个科的一百多种植物中。常见的有毛 花洋地黄（Digitalis lanata ）、紫花洋地黄（Digitalis
purpurea ）、黄花夹竹桃（Peruviana peruviana）、毒毛 旋花子（Strophanthus kombe ）、铃蓝（Convallaria keiskei ）、海葱（Scilla maritime ）、羊角拗 （Stropanthus divaricatus）等
1、加强心肌的收缩，使脉动加速； 2、治疗心力衰竭与心律紊乱等症； 3、强心苷毒性大，不易控制。
强心苷的结构与活性的关系
大量的研究证明，强心苷的化学结构对其生理活性
有较大影响。强心苷的强心作用取决于苷元部分， 主要是甾体母核的立体结构、不饱和内酯环的种类 及一些取代基的种类及其构型。糖部分本身不具有 强心作用，但可影响强心苷的强心作用强度。
4．三氯醋酸反应(Rosen-heim反应) 将样品溶于 氯仿，加25%的三氯乙酸乙醇溶液，呈红色至 紫色。 5．五氯化锑反应(三氯化锑或五氯化锑反应) 将样品溶液点于滤纸上，喷20%三氯化锑或五 氯化锑的氯仿溶液（不含乙醇和水），于 60℃～70℃加热3～5分钟，样品斑点呈现灰蓝、 蓝、灰紫等颜色。
甾族类药物
PART SIX
代谢工程改造微生物
代谢工程（Metabolic engineering）是指利用多基因重组技术有目的的对细 胞代谢途径进行修饰、改造，改变细胞特性，并与细胞基因调控、代谢调控 及生化工程相结合，为实现构建新的代谢途径生产特定目的产物而发展起来 的一个新的学科领域。可以说是基因工程的高级阶段。
代谢工程改造微生物
新金色分枝杆菌（Mycobacterium neoaurum ST-095），其产物 AD与 ADD 的摩尔比 为 2:1。经过传统的诱变选育，前期获得了一株诱变菌株命名为 M.neoaurum JC-12， 其产物 AD 与 ADD 的摩尔比为 1:10。
参考文献 [1]邵明龙.代谢工程改造微生物合成甾体药物中间体 ADD 和 TS [D].无锡: 江南大学,2016. [2]叶 丽 , 史济平.甾体微生物转化在制药工业中的应用[J].工业微生 物,2001,31(4):40-48. [3] 阳葵; 李晓静; 冯霞; 尹强; 赵海燕 .底物的分散和溶解对甾体微生物酶反 应的影响 [J].微生物学通报,2001,28(6):68-71
甾醇侧链降解 甾醇侧链降解主要是指利用微生物及其产生的酶系，经过 一系列的酶促反应，将甾醇 C17 位的支链进行断裂分解， 生成雄甾-4-烯-3,17-二酮（AD）和雄甾-1,4-二烯-3,17-二 酮（ADD）等甾体药物中间体的过程。 甾体脱氢反应 主要是指甾体母核上的脱氢，具体脱氢反应位点主要包括 C1,2 位，C4,5 位，C7,8 位，C9,11 位，C14,15 位， C16,17 位等。目前，甾体结构上 A 环 C1,2 位点上的脱氢 是国内外学者研究的热点，这是因为 C1,2 位点上引入双 键之后，其抗炎的效果和作用能够成倍地提高，这也是皮 质激素如氢化强的松与其同系列甾体药物生产的关键步骤。
第九章_甾体类化合物(1)
12
11
二、强心苷的结构与分类 1 19 C 13
17
D
16
8
15
(一) 苷元部分的结构
2
A 10
9
B
14
3
7
4 56
天然存在的强心苷元甾体衍生物（环戊烷多氢
菲的衍生物），是C17侧链为不饱和内酯环的
甾体化合物。
热；或取样品溶于氯仿，加冰乙酸、乙酰氯、氯 化锌煮沸，反应液呈现紫红→蓝→绿的变化。
4．Rosenheim反应
将样品溶于氯仿，加25%的三氯乙酸乙醇 溶液，呈红色至紫色。
5．三氯化锑或五氯化锑反应
将样品溶液点于滤纸上，喷20%三氯化 锑或五氯化锑的氯仿溶液（不含乙醇和 水），于60℃～70℃加热3～5分钟，样品 斑点呈现灰蓝、蓝、灰紫等颜色。
A/B 环为顺式稠合的甲型强心苷元，必须具 C3-β羟基，否则无活性。
如β洋地黄毒苷元有毒性而表洋地黄毒苷元 无毒性。
A/B环为反式稠合的甲型强心苷元，无论C3是 β-羟基还是α-羟基均有活性
2、不饱和内酯环
1) C17连接不饱和内酯环及其β—构型是不 可缺少的。
2) 若异构化为α—型或开环或不饱和内酯环 被氧化或双键位移，均无活性或活性显著降 低。
C/D
C17-取代基
反
8~10 个碳的脂肪烃
反
戊酸
顺
C2H5
反
8~10 个碳的脂肪烃
顺
不饱和内酯环
反
六元不饱和内酯环
反
含氧螺杂环
甾体母核的其他位置上也可以有羟基、羰基、双 键等功能团
羟基化甾体的生物合成
羟基化甾体的生物合成羟基化甾体是一类特殊的化学物质，具有许多重要的生物学功能。
主要有以下几项：1. 调节体温：羟基化甾体具有亲水性，能够保持体内的湿度和热量，起到调节体温的作用。
2. 调节体内水平衡：羟基化甾体对于体内的水分平衡很重要，它能够维持体内的pH值和离子平衡，从而维持体内水平衡。
3. 阻止细胞死亡：羟基化甾体具有抗氧化作用，能够有效阻止细胞死亡。
4. 促进细胞增殖：羟基化甾体可以促进基因的表达，从而促进细胞增殖。
5. 保护和维护心血管系统：羟基化甾体有助于改善血液循环，保护和维护心血管系统的健康。
6. 促进肝脏新陈代谢：羟基化甾体有助于肝脏新陈代谢，它们能有效减少体内有害物质的吸收和生产。
7. 促进消化系统功能：羟基化甾体有助于促进消化系统的功能，能够降低胃酸分泌量，促进食欲。
以上就是羟基化甾体在生物学上的主要功能。
它们十分重要，而研究如何利用这类物质实现基因治疗、抗衰老、药物运输以及其他的生物学功能，也开始成为当前热门的研究课题。
在生物合成领域，特别是生物合成羧酸类物质方面，已经取得了非常重要的进展。
一、研究表明，可以通过基因编辑技术来进行羟基化甾体的生物合成。
通过基因编辑，可以改变基因的表达，从而实现羟基化甾体的构建。
基因编辑能够精准地控制基因的表达，从而有效促进羧肽的合成，实现细胞膜和细胞表面有效调节的目的。
二、另外，还可以通过化学反应实现羟基化甾体的生物合成。
可以将复杂的有机分子与活性基团进行反应，形成羟基化甾体。
化学反应主要依赖于酶作用，从而实现羟基修饰。
三、可以通过生物合成技术来进行羟基化甾体的合成。
生物合成技术主要利用细菌、真菌、植物细胞等生物制备羟基甾体，细胞中需要添加必要的碳源、氧气、氮源等物质，维护其稳定性。
四、最后，还可以通过化学合成和生物化学的方法来实现羟基化甾体的生物合成。
通过这种方法，可以添加有机化合物，改变其形状，从而实现羟基甾体的合成。
通过以上四种方法，可以有效的实现羟基化甾体的生物合成。
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基
形式 □农业、生物新品种
□矿产新品种
□其他应用技术
本
□电子信息 □能源环保 □装备制造 □√生物技术与新医药
2、创新要点 利用有高效转化能力的菌种，建立甾体的一步发酵或半合成技术，开
发绿色的产物萃取技术及原位随程提取新工艺。
3、效益分析 建立植物甾醇生物化工生产线，转化合成 4-AD、NAD 等产品，投入
建设资金 3000～5000 万元，预计年产值在 2.0 亿元以上。
4、推广情况 天津药业集团有限公司；浙江仙居君业药业有限公司；河南利伟生物
甾体类化合物的生物转化技术
完成单位
药学院
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许正宏 职称/职务 许正宏 职称/职务
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合作方式
□√自主开发生产产品 □√技术
□ 其它
情 所属领域
□新材料 □农业食品科技 □海洋技术 □其他
况
技术成熟 □研制阶段
□√试生产阶段
□小批量生产阶段
程度 □批量生产阶段 □其他
一、简要综述
国家高技术研究发展计划（863 计划）。
果简介
二、具体介绍 1、项目简介
主要针对我国甾体药物原料来源单一、初加工污染严重、甾体药物合 成路线长等问题，重点开展薯蓣皂苷元清洁生产、植物甾体生物转化 4AD 以及屈螺酮化学合成路线的生物替代等技术研究，旨在大幅度降低原料、 能耗及生产成本。