第二章菌种选育与构建

二、诱变育种中的几个原则
指利用物理或化学诱变剂处理微生物群体细胞，促进其突变 率显著提高，然后设法从中选取少数符合育种目的的突变株。 2个主要环节： 诱变（随机）
选用合适的诱变剂和诱变剂量处理大量均匀 、分散的微生物细胞，以引起绝大多数细胞 致死的同时，使存活个体中的突变频率大大 提高。
设计有效的筛选方法，将少量正变株中的 优良菌株挑选出来。
（五）突变株的筛选
1. 初筛（以量为主） 方法需简便、快速
2步
初筛 复筛
（1）利用形态变异：需预先测定形态与产量的相关性 （2）根据平板颜色反应直接挑选 透明圈法（蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶）； 抑菌圈法（抗生素）； 变色圈法（柠檬酸）、显色圈（氨基酸）； 沉淀圈法（外毒素） 透明圈直径（H）/菌落直径（C）：产量高低（初筛指标） 2. 复筛（以质为主，定量测定） 摇瓶培养，直接检测所需产物
定向培养:采用特定的有利于目的微生物富集的
条件，进行培养。
当不可能采用定向培养时，则可设计在一个分
类学中考虑，
不能提供任何有助于筛选产生菌的信息，这
时只能通过随机分离的办法
定向培养的方法
物理方法：加热、膜过滤等
但主要是通过培养的方法
定向培养的富集方法
1、底物
3、培养时间
2、pH条件
4、培养温度
目的：克服表型延迟 表型延迟（phenotypic lag）：表型的改变落后于基因型改变的 现象. 分离性延迟的原因: 对数生长期中，单核细胞常出现双核 分离性延迟： 突变的基因经DNA复制和细胞分裂后变成纯 现象，多核细胞的核也成倍增加，诱变对数期的细胞时，突 合状态，表型才能表现出来。 变通常发生在一个核上，故其变异或非变异的细胞必须经过 生理性延迟: 生理性延迟的原因: 当变异细胞由杂合状态变为纯合状态 生理性延迟： 由杂合状态变为纯合状态，突变表型仍不能 一代或几代繁殖才能分离，这种纯种变异细胞出现的推迟现 时,由于杂合期所合成的非变异的蛋白或酶仍然发挥作用,必 象称为分离延迟现象。 表现出来。 须经过细胞多代分离后,才能将这些非变异的酶稀释掉,最终 达到变异后应该表现的形态,如营养缺陷型突变株的筛选过 程。
３、霉菌的杂交育种
准性生殖过程：不通过有性生殖的基因重组过程． 异核体的形成：两不同性状细胞（菌丝）连接，导致一 细胞存在两个不同遗传型核。 杂合二倍体形成；异核体偶尔发生不同核的融合，形成 杂合核，为双倍体。 菌丝成斑点、扇面——扇变。 体细胞重组：杂合二倍体只具有相对稳定性，繁殖过程 发生染色体交换，单倍化，形成各种分 离子。 准性生殖的单倍体化是一个渐变过程，需要多次分 裂，形成双倍体、非整倍体、单倍体等分离子。
优良菌种应具备的特征
对菌种的要求
天然菌种的生产性能较低，一般需要进行选育。
1.生产力：能在廉价的培养基上迅速生长，所需的代谢产
物的产量高，其它代谢产物少
2.操作性：培养条件简单，发酵易控制，产品易分离 3.稳定性：抗噬菌体能力强，菌种纯，不易变异退化 4.安全性：是非病源菌，不产有害生物活性物质或毒素
另一种是我们生产上希望看到的，对生产有利，这种突 变成为正突变。
自然选育在工业生产上的意义 问题： 高产菌株是正突变高，还是负突变高？
回复突变：高产菌株在传代的过程中，由于自然突变导致 高产性状的丢失，生产性能下降，这种情况我们称为回复 突变
自然选育虽然突变率很低，但却是工厂保证稳产高产的 重要措施。
方法：末端产物结构类似物筛选；（未突变者 死，突变为抗者，生并产菌落） 营养缺陷型回复突变株筛选。 （活性复，结构改变）
３、组成型突变株筛选
诱导型依赖诱导物。组成型不依赖诱导物。
突变发生在调节基因或操纵基因,解除对 诱导物的依赖,可获组成型突变株。 筛选方法：设计条件使组成型优势生长， 或通过菌落分辨。
实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选 文献:产生菌为中性牙孢杆菌，嗜碱牙孢杆菌、放线菌及霉菌 →80度30分钟处理 ↓ 0.0075%曲利本蓝＋1%CMC（羧甲基纤维素），pH10.5 培养3～4天，选择有凹陷圈的菌落 采样（造纸厂） 26株为组成型 从285个土样中获得62株 36株为诱导型
例：醛肟水解酶的筛选
如：氟乙酸抑制顺乌头酸酶，氟乙酸敏感突变型， 顺乌头酸酶活性极低，更敏感，异柠檬酸产量 少，柠檬酸积累。
三、杂交育种
长期诱变会使菌种生活能力下降。 借助有性重组，使不同菌株的遗传物质 得以交换（获优良性状集中的重组体）。 1.细菌的杂交育种
方法：转化、转导、F因子转导、R因子转移、接 合。获部分合子。 出发菌株需带遗传标记：营养缺陷、抗生素抗性、 温敏、发酵性能
③显色反应法
不含诱导物平板培养——加底物——分解（有颜色变 化）——检出。
４.抗（敏感）性突变株筛选
包括：抗生素、金属离子、温度、噬菌体 ①抗生素抗性突变：提高产量； ②抗噬菌体突变：消除噬菌体污染；
（与噬菌体存在与否无关）
③条件抗性突变：如温度，可提高产量；
（温度敏感突变，高温呈营养缺陷表型）
④物敏突变：
--Journal of biotechnology 94(2002), 65-72
培养基中含0.05% of Z-PAOx
每隔2-3天移去一半培养物，补充新鲜培养基 不断分析样品，2-3个月后Z-PAOx降低后，稀释分离条菌落
五、目的微生物富集方法的研究进展
目前土壤中能够培养的微生物不到总数的1%。微生物的
项目三 微生物菌种的选育和构建
微生物发酵的一般流程
培养基配制 种子扩大培养 空气除菌 发酵设备
培养基灭菌
发酵生产
下游处理
主要内容
微生物优良生产菌种的特征 自然突变选育 诱变选育
原理 基本方法 放线菌 霉菌 酵母菌
杂交育种
细菌
原生质体融合 基因工程技术
基因表达系统 利用大肠杆菌的基因表达系统 利用酵母菌的基因表达系统 基因工程菌的稳定性
在产量变异工作中，常采用相对杀菌率为70~75%, 甚至 30~70%的剂量。
UV的剂量: 固定UV功率和照射距离,以照射时间长短来 确定剂量多少。
3. 诱变处理方法
单因素处理或多因素的复合处理： ①同一诱变剂的重复使用； ②两种或多种诱变剂的先后使用； ③两种或多种诱变剂的同时使用.
（四） 中间培养（CM，培养过夜）
多样性及资源的开发仍然是今后若干年的研究重点。
分子生物学的实验手段，在微生物鉴别及特定目标产物
的筛选方面发挥了着越来越重要的作用。如:16SRNA同 源性分析，基因序列分析及DNA/DNA杂交技术等
任务二 诱变育种
诱导微生物发生突变进行的菌种选育，包 括诱变和筛选两个步骤。 原理：染色体畸变；基因突变。
土样的采取 → 预处理
→ 培养
→ 菌落的选择
→ 产品的鉴定
目的：高效地获取一株高产目的产物的微生物 问题： 如何使样品中所含微生物的可能性大 如何在后续的操作中使这种可能性实现
自然状态下，碱基对发生自然突变的机率为10-8～10-9 自然突变有两种情况： 一种是我们生产上所不希望看到的，表现为菌株的衰 退和生产质量的下降，这种突变成为负突变。
２、放线菌的杂交育种
基因重组过程近似细菌，育种方法与霉菌相似．
放线菌的遗传体系和杂交原理：
异核现象：同一细胞（菌丝）含不同基因型的核。无 重组体出现。 接合现象：发生部分染色体转移（交换），形成部分 合子。整+部分、部分+部分。 异核系的形成：部分合子产生的无性繁殖系。能在基 本或选择培养基上生长。 （单交换，二体区） 重组体的形成：异核系不稳定，可经过双交换形成重 组子，产生重组子孢子。
霉菌的杂交技术
诱变获具标记的亲本。 异核体的形成：基本培养基上，强迫进行 营养互补。还可用多种方法。 双倍体检出：可从扇面上挑孢子分离。 分离子检出：杂合二倍体单孢子平板分 离，检菌落斑点或扇面，斑点处挑孢 子至斜面，再纯化鉴别。
放线菌的杂交方法
混合培养法：两互补缺陷型亲株混合培养，制孢 子悬液，选择性平板分离。 平板杂交法：一亲株培养，形成孢子，影印至已 分别铺有另几种孢子的平板上，获 孢子后再影印至选择平板上。 玻璃纸转移法：两亲本需要双标记，混合带纸培 养，未长气生菌丝时，纸移至一选 择平板，获异核系。解剖镜下，小 针收集小菌丝，于完全平板涂布， 获分来自百度文库子。
筛选（定向）
（一） 出发菌株（original strain）
出发菌株指用于诱变育种的起始菌株。 出发菌株的选择标准： • 具有有利性状（如高产、生长速度快、营养要求粗放、 标记明显等）； • 对诱变剂敏感 出发菌株的来源： •野生型菌株； •从生产中选育的自发突变菌株； •诱变获得的高产菌株
（二） 菌悬液的制备
自然选育操作步骤： 一般习惯上将自然选育称为菌种的分离纯化。 单细胞(孢子)悬液的制备
平板分离
挑选单菌落(注意形态的观察) 发酵试验
二、采样时要注意的问题
气候、水分、空气
来源要广
结合产品的特点
标签：地点、时间、气候等
三、目的微生物富集的一些基本方法
富集的目的： 让目的微生物在种群中占优势，使筛选变 得可能。 富集的三种方案：
等一切能提高目的微生物相对生长速 度的手段，培养（固体、液体；分批 连续）后使目的微生物在种群中占优 势。
四、菌落的选出
从产物角度出发
在培养时以产物的形成有目的的设计培养基
利用简单、快速的鉴定方法，如抗生素
从形态的角度
菌落的外观形态，是微生物的一个重要表征。如多糖 产生菌在适当的培养基上生长，从具有粘液性的菌落外观 上就可以初步识别。
利用微生物自然突变进行的菌种选育。 原因：多因素低剂量的诱变效应； 互变异构效应 结果：负变大于正变，应经常分离纯化 方法：菌悬液→平板分离→上摇瓶→检测→ 选种→保藏

优点：简单易行，可与生产同步进行。 缺点：频率低，10-8—10-9 /次分裂。
任务一 自然选育 一、菌种自然选育的一般过程
1. 选用单细胞或单孢子悬液（均匀、分散） 目的：①使每个细胞能均匀接触诱变剂； ②减少表型延迟现象（诱变后性状的分离及退化现象） 2. 同步培养（生理状态一致） 3. 菌龄：对诱变剂最敏感时期 4.菌悬液的制备方法 营养细胞：对数期 孢子或芽孢：萌发前期
物理诱变：生理盐水配制 化学诱变：缓冲液配制 酵母菌，霉菌的孢子：106个/mL 细菌，放线菌孢子：108个/mL
优良菌种应具备的特征
选择生产菌种应注意的因素
1.原料方面：广，转化率高； 2.产物方面：目的产物含量高，副产物少； 3.菌体方面：生长快、繁殖力强，耐受力强， 抗污染、抗噬菌体能力强，遗传特性稳定 4. 设备方面：产泡沫少，适宜大罐生产。
（培养条件异，周期短，需氧量小，抗污染能力强）
一、自然选育
１、营养缺陷型突变株筛选
酶缺陷，结果造成中间产物积累；
解除协同反馈，使另一分支末端产物积累； 渗漏型突变（酶未完全丧失活性，下降），末 端产物少，中间产物积累。
２、抗反馈阻遏和抗反馈抑制 突变株筛选
调节基因或操纵基因突变，产生的阻遏 蛋白与终产物不能结合或结合； 结合，但不发生作用； 结构基因突变，使结构酶无结合能力但 有催化活性；
①加诱导酶合成抑制物
②交替培养法 ③显色反应法
筛选方法
①加诱导酶合成抑制物
如：加邻硝基-β-D-岩藻糖苷，抑制-β半乳糖苷酶合成。 诱导型不能利用乳糖，不长；组成型产酶，能利用乳糖， 生长，被富集。
②交替培养法
含诱导物（乳糖）中培养——组成型快——不含诱导 物（葡萄糖）中培养——诱导型失酶——反复。
5. 菌悬液的浓度
（三）诱变剂的选择及处理方法
1. 诱变剂的选择（高效，简便） 物理诱变剂：频度低、大损伤，难修复，且操作简便； 化学诱变剂：频度高，点突变，易回复突变，操作麻烦。 ( NTG——超诱变剂）
UV是最常用的一种诱变剂
2. 剂量的选择 常以杀菌率来表示相对剂量（剂量-存活率曲线） 最适剂量：在提高突变率的基础上，既能扩大变异幅度， 又能使变异向正突变范围移动的剂量。 突变率随剂量的增加而提高，但到达一定程度后，再提 高剂量, 反而会使突变率下降。 正变较多出现在偏低剂量中，而负变较多出现在偏高剂 量中。
影响诱变的因素：
出发菌株（有一定生产能力，形态、生理强壮） ； 诱变剂的种类（单一或复合）与剂量（不宜过高和过 低，致死率：70-80％）。 诱变剂：能提高基因突变频率的物理、化学、生物因子。 筛选比诱变更重要。
筛选的方法：通过选择/鉴别培养基加以识别。
初筛→复筛→确定最佳发酵条件（负变多，正变少）