神经生物学的形态学研究方法

第一部分神经生物学的形态学研究方法一、研究神经细胞的形态及细胞构筑的方法

（一）尼氏（Nissl）染色法

原理用碱性染料染神经组织

常用染料焦油紫、硫堇、中性红

结果尼氏小体被染色，背景无色。

用途皮质的分层、分区、脊髓灰质的分层、核团的分区、细胞的构筑

（二）高尔基（Golgi）镀银染色法

原理铬银与脂蛋白形成复合物，在细胞

膜系统的间隙内形成结晶

结果整个细胞为黑色

用途显示整个细胞的全貌

二、研究神经径路的方法

（一）溃变法

原理神经元胞体或纤维损伤后远侧部分发生顺行变性（纤维交替膨胀和狭窄，呈念珠状继而呈颗粒状），可用镀银法显示或电镜观察。胞体发生逆行变性（胞体内色质溶解，胞体肿胀，核偏向胞体的一边），可用尼氏法显示。

应用研究纤维联系。

（二）辣根过氧化物酶（HRP）标记法

原理HRP注入神经组织或脏器—逆行、顺行、过节标记—H2O2、色原酶反应—呈色

试剂HRP： 1.游离HRP

2.结合HRP(WGA-HRP、CT-HRP）

色原： 1.二氨基联苯胺(DAB)

2.二盐酸联苯胺(BDHC)

3.邻-联茴香胺(OD)

4.四甲基联苯胺(TMB)

稳定剂:硝普钠、钨酸钠

用途研究脏器的神经支配、中枢内核团间的联系等。还可与免疫组织化学、电镜技术等结合。

（三）荧光素轴突逆行传递标记法

原理将荧光物质注射至神经元的轴突分布区, 经分支的末梢吸收后，循轴突逆行输送至胞体。在荧光显微镜下可看到胞体内呈现荧光标记物。

荧光素Furogold FB-NY GB-NY TB-Bb PI-Bb EB-DAPA

应用研究神经元的轴突分支至不同部位的投射。

（四）放射自显影示踪技术

原理将放射性同位素3H等标记的氨基酸导入神经组织，氨基酸被神经元摄取后在胞体内合成蛋白质，沿轴突顺行运输，分

布于整轴突和末梢，同位素产生的核射线使照相乳胶感光，

根据感光银粒所在部位和黑度判断放射性示踪剂的位置和

数量，从而确定神经纤维的路径。

示踪剂3H -脯氨酸标记终末、跨突触标记

3H -亮氨酸标记终末、纤维

3H -HRP酶蛋白与HRP结合双标记

用途研究神经元的传出路径

（五）2-脱氧葡萄糖放射自显影法

原理2-DG能与葡萄糖竞争和6-磷酸葡萄糖异构酶结合，但不能转化为相应的磷酸果糖，因此滞留在细胞中。将2-DG标记上

放射性同位素，就可追踪中枢神经系统中各种神经结构的代

谢率。

结果在感光底片上，代谢率较高的核团和区域银粒较密。

用途显示处于兴奋状态的神经元链。

（六）植物凝集素标记法

原理凝集素通过神经细胞膜上不同受体的介导而被胞饮入神经元内，经轴突运输至一定部位，再用免疫组化的方法显示。凝集素麦芽凝集素（WGA）可与HRP、荧光素结合

菜豆凝集素（PHA-L）

用途顺行或逆行追踪，研究神经通路。

（七）葡聚糖胺结合生物素

原理葡聚糖胺结合生物素(BDA) 被胞饮入神经元内，经轴突运输至一定部位，再用组化反应或荧光显微镜显示。

用途顺行追踪，研究神经通路。

（八）病毒标记法

原理活病毒导入神经元，增殖，顺次进入各级神经元，用免疫组织化学显示。

病毒疱疹病毒（单纯疱疹病毒Ⅰ型、猪疱疹病毒）

弹状病毒

用途跨突触标记（顺向或逆向）

近年来，用分子生物学方法制作基因重组病毒。将绿色荧光蛋白（GFP）的基因整合入病毒，通过病毒增值，GFP在感染的神经元中表达。在荧光显微镜下观察GFP基因重组病毒在单个神经元范围内顺行或逆行标记，可显示神经元全貌，与Golgi法相似。

三、研究神经肽分布的方法

（一）黄递酶组织化学

原理尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸-黄递酶（NADPH-d）是神经型一氧化氮合成酶(nNOS)的辅酶，两者高度共存。可将底物B-

NADPH氧化成B- NADP，释放H2，使显色试剂硝基四氮唑蓝

(NBT ）还原成DBT,黄色变成蓝色或紫蓝色。

用途研究周围及中枢神经系统nNOS神经元。

（二）诱发荧光组织化学法

原理神经元内含量很微的单胺类物质如多巴胺（DB）、去甲肾上腺素（NA）、肾上腺素（A）和 5-羟色胺（5-HT）与某些醛

类物质在一定条件下发生聚合反应，形成新的环形化合物，

在荧光显微镜下发出较强的不同颜色的荧光。

醛类乙醛酸、多聚甲醛加戊二醛等

用途研究周围及中枢神经系统单胺类神经元。

（二）免疫细胞化学方法

原理用特异抗体加在神经组织切片上孵育，形成抗原-抗体复合物，将之用可见物质（荧光素、HRP、同位素等）标记出来，

在镜下观察。

分类直接法间接法

直接法标记抗体——抗原——显微镜观察

特点：简单、省时、特异性高、非特异性染色轻。敏感性差，一种标记抗体只能检测一种抗原。现少用。

间接法标记抗抗体抗体抗原显微镜观察

特点：只要标记一种抗体就可检测多种抗体。敏感性高，用途较广。目前多用。

非标记抗体过氧化物酶-抗过氧化物酶法（抗酶抗体、PAP法）原理酶抗体（兔）——二抗（羊）——一抗（兔）——抗原

抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶复合物法（ABC 法）

原 理 生物素即维生素H ，它与卵白素有极高的亲合力；生物素

与抗体或多种酶结合后，抗体及酶的活性不受影响。

ABC 复合物——生物素化二抗（羊）——一抗（兔）——抗原

ABC 复合物： HRP-生物素-卵白素

卵白素 酶 生物素 待测抗原 一抗（兔）

A B C 复合物

待测抗原 一抗 二抗