SDS-PAGE操作方法
蛋白质电泳操作步骤
SDS-PAGE电泳操作步骤：试剂配制：（实验中采用均为分析纯）（1）丙烯酰胺贮液（4℃下棕色瓶中储存，试剂尽量勿存储过久）丙烯酰胺贮液（T=30%，C=3%）称取29.1 g丙烯酰胺和0.9 g甲叉双丙烯酰胺，用双蒸水溶解，定容至100 ml，过滤备用。
(试剂有毒，操作中注意防护)（2）浓缩胶缓冲液（1 mol/L Tris-HCl，pH 6.8）（4℃下棕色瓶中储存，试剂尽量勿存储过久）6.06 g Tris溶解于35 ml双蒸水中，用浓盐酸调节pH至6.8，再用双蒸水定容至50 ml。
（3）分离胶缓冲液（1.5 mol/L Tris-HCl，pH 8.8）（4℃下棕色瓶中储存，试剂尽量勿存储过久）18.16 g Tris溶解于75 ml双蒸水中，用浓盐酸调节pH至8.8，再用双蒸水定容至100 ml。
（4）10% SDS（5）10% 过硫酸铵（APS）：使用前新鲜配制，低浓度APS一般当天用当天配制，勿过夜使用。
（6）尿素（7）TEMED(N，N，N’，N’-四甲基乙二胺)（8）电极缓冲液(1×) （棕色瓶中4℃储存，一般使用3-4次）0.025 mol/L Tris，0.192 mol/L甘氨酸，0.1% SDS，pH 8.3（9）电极缓冲液(2×) （棕色瓶中4℃储存，一般使用3-4次）0.050 mol/L Tris，0.384 mol/L甘氨酸，0.1% SDS，pH 8.3（10）样品缓冲液（pH 6.8）（4℃下棕色瓶中储存，试剂尽量勿存储过久）1.6 ml浓缩胶缓冲液（pH 6.8）+ 4 ml 10% SDS + 0.6 g二硫苏糖醇(DTT) +2.5 ml 87%甘油+0.1 mg溴酚蓝，用双蒸水稀释到20 ml.（11）考玛斯亮蓝R-250染色方法：a．固定液20%三氯乙酸b．脱色液250 ml乙醇，80 ml冰醋酸，加水稀释至1000 ml。
c．染色液称取0.29 g考玛斯亮蓝R-250溶于250 ml上述脱色液中样品处理：处理完样品应尽快使用，若存储，须于-20℃下。
SDS-PAGE蛋白加样缓冲液(2×)
北京雷根生物技术有限公司 SDS-PAGE 蛋白加样缓冲液(2×)简介：SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液即SDS-PAGE Sample Loading Buffer(2×)，是一种经过改良的以溴酚蓝为染料的蛋白上样缓冲液。
Leagene SDS-PAGE Sample Loading Buffer(2×)常用于SDS-PAGE 蛋白样品的上样，含少量DTT ，但不含有毒物质β-巯基乙醇。
组成：操作步骤(仅供参考)：1、 在室温或不超过37℃的水浴中溶解SDS-PAGE 蛋白加样缓冲液(2×)。
水浴溶解后立即室温存放，尽量避免长时间置于水浴中。
2、 取适量的蛋白样品和SDS-PAGE Sample Loading Buffer(2×)等量混合，充分混匀。
3、 沸水浴加热，以充分变性蛋白。
4、 冷却到室温后，直接上样到SDS-PAGE 胶加样孔内即可。
5、 通常电泳至蓝色染料到达PAGE 胶的底部附近即可停止。
注意事项：1、 Leagene SDS-PAGE Sample Loading Buffer(2×)中含少量DTT ，有轻微刺激性气味，但不含由毒物质β-巯基乙醇。
2、 SDS-PAGE Sample Loading Buffer(2×)必须完全溶解后再使用。
有效期： 12个月有效。
亦可4℃短期保存。
相关：编号 名称 PE0024 PE0024 Storage SDS-PAGE Sample Loading Buffer(2×) 5×1ml 10ml -20℃ 使用说明书 1份编号名称 DH0006苏木素伊红(HE)染色液 PE0018SDS-PAGE 凝胶配制试剂盒 TC1213 总胆固醇(TC)检测试剂盒(COD-PAP 单试剂比色法)。
SDS-PAGE蛋白加样缓冲液(5×)
北京雷根生物技术有限公司 SDS-PAGE 蛋白加样缓冲液(5×)简介：SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液即SDS-PAGE Sample Loading Buffer(5×)，是一种经过改良的以溴酚蓝为染料的5倍浓缩的蛋白上样缓冲液。
Leagene SDS-PAGE Sample Loading Buffer(5×)常用于SDS-PAGE 蛋白样品的上样，含少量DTT ，但不含有毒物质β-巯基乙醇。
组成：操作步骤(仅供参考)：1、 在室温或不超过37℃的水浴中溶解SDS-PAGE 蛋白加样缓冲液(5×)。
水浴溶解后立即室温存放，尽量避免长时间置于水浴中。
2、 取适量的蛋白样品和SDS-PAGE Sample Loading Buffer(5×)混合，充分混匀。
3、 沸水浴加热，以充分变性蛋白。
4、 冷却到室温后，直接上样到SDS-PAGE 胶加样孔内即可。
5、 通常电泳至蓝色染料到达PAGE 胶的底部附近即可停止。
注意事项：1、 Leagene SDS-PAGE Sample Loading Buffer(5×)中含少量DTT ，有轻微刺激性气味。
2、 SDS-PAGE Sample Loading Buffer(5×)必须完全溶解后再使用。
3、 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
有效期： 12个月有效。
亦可4℃短期保存。
相关：编号名称 PE0025 PE0025 PE0025 StorageSDS-PAGE Sample Loading Buffer(5×)1ml 5×1ml 10ml -20℃ 使用说明书 1份编号名称 DC0032Masson 三色染色液 PE0080Tris-HCl 缓冲液(1mol/L,pH6.8) TC1243 甘油三脂(TG)检测试剂盒(GPO-PAP 单试剂比色法)。
(完整版)SDS-PAGE蛋白电泳方法
SDS-PAGE一. 实验原理SDS 是一种阴离子表面活性剂，在蛋白质溶液里加入 SDS 和巯基乙醇后，巯基乙醇能使蛋白质分子中的二硫键还原， SDS 能使蛋白质的氢键、疏水键打开并结合到蛋白质分子上，形成蛋白质-SDS 复合物。
在一定条件下，SDS 与大多数蛋白质的结合比例为 1.4:1。
由于十二烷基磺酸根带负电，使各种蛋白质的SDS-复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。
SDS与蛋白质结合后，还引起了蛋白质构象的改变。
蛋白质-SDS复合物的流体力学和光学性质表明，它们在水溶液中的形状，近似于雪茄烟形的长椭圆棒，不同蛋白质的 SDS 复合物的短轴长度都一样，约为 1.8nm ，而长轴则随蛋白质的 Mr 成正比的变化。
基于上述原因，蛋白质-SDS 复合物在凝胶电泳中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只与椭圆棒的长度有关，也就是蛋白质 Mr 的函数。
二. 试剂器材30%凝胶贮液(100mL)：称取试剂Acr 29.2g和Bis 0.8g置于100mL烧杯中，向烧杯中加入约60mL双蒸水，充分搅拌溶解后加双蒸水定容至100mL，置于棕色瓶内4℃贮存，每过1-2个月应重新配制；注意：丙稀酰胺具有很强的神经毒性，并可通过皮肤吸收，其作用有积累性，配制时应戴手套和口罩等。
分离胶缓冲液(1.5 mol/L Tris-HCl，pH 8.8，100mL)：称取Tris 18.2g 溶于约80mL 双蒸水，用6mol/L的HCl 调整pH值至8.8，加双蒸水定容到100mL，4℃ 贮存；堆积胶缓冲液(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8，100mL)：称取Tris 6.0g溶于约80mL双蒸水，用1mol/L的HCl 调整pH值至6.8，加双蒸水定容到100mL，4℃ 贮存；电泳缓冲液(1L)：称取试剂Tris 3.03g和甘氨酸 14.4g置于500mL烧杯中，向烧杯中加入约400mL双蒸水充分溶解，再加入10%SDS溶液1.0mL，以双蒸水定容至1L (自然pH值为8.3，无需再调)，4℃ 贮存，可重复使用5-6次；2×加样缓冲液(10mL)：取下列试剂置于10mL塑料离心管中0.5mol/L Tris-HCl缓冲液(pH6.8) 2.0mL10%SDS溶液 4.0mL甘油 2.0mL巯基乙醇 2.0mL溴酚蓝 0.02g，混匀后1mL分装，-70℃可贮存6个月；10%AP：称取(NH4)2S2O3 1.0 g，溶于10.0mL双蒸水中，分装成每份1mL，-20℃贮存；TEMED：分装成每份1mL，4℃避光贮存；水饱和正丁醇(100mL)：在玻璃瓶中加入50mL双蒸水和50mL正丁醇，振摇。
SDS-PAGE电泳操作规范
聚丙烯酰氨凝胶电泳一简介作用原理：聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。
它有两种形式：非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native-PAGE）及SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）；非变性聚丙烯酰胺凝胶，在电泳的过程中，蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。
而SDS-PAGE仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。
该技术最初由shapiro 于1967年建立，他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂（SDS即十二烷基磺酸钠）后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小（可以忽略电荷因素）。
二作用SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。
而强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇(DTT)能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。
在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。
SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统，与连续缓冲系统相比，能够有较高的分辨率。
浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。
当样品液和浓缩胶选TRIS/HCl缓冲液，电极液选TRIS/甘氨酸。
电泳开始后，HCl解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。
蛋白质带负电荷，因此一起向正极移动，其中氯离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。
电泳开始时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成以稳定的界面，使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层。
此鉴定方法中，蛋白质的迁移率主要取决于它的相对分子质量，而与所带电荷和分子形状无关。
SDS-PAGE电泳的标准操作规程
SDS-PAGE电泳的标准操作规程（编号：039）1、目的及适用范围SDS-PAGE电泳的分离原理，是根据大多数蛋白质都能与阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠（SDS）按重量比结合成复合物，使蛋白分子所带的负电荷远远超过天然蛋白分子的净电荷，消除了蛋白分子的电荷效应，使蛋白按分子大小分离，主要用于蛋白质分子量的测定、蛋白质混合组分的分离和蛋白质亚基组分的分析等方面。
2、主要仪器恒压或恒流电源、垂直板、制胶模具3、试剂及配制方法试剂配制方法或要求H2O 电阻率不低于18.2 MΩ.cm1.5 M Tris-HCl 1.5 moL/L Tris-HCl缓冲液，pH 8.830% Acrylamide 30% 丙烯酰胺溶液（避光保存）10% SDS 10% SDS溶液10% APS 10% 过硫酸铵溶液（临用前配制）TEMED TEMED溶液1 M Tris-HCl 1 moL/L Tris-HCl缓冲液，pH 6.815.1g、甘氨酸94 g、SDS 5 g，水稀释至1 L，pH 8.35×电极缓冲液 Tris2×Loading buffer 100 mM Tris-HCl（pH6.8）、4% SDS、0.2% 溴酚蓝、20% 甘油，用于非还原SDS-PAGE电泳，如用于还原SDS-PAGE电泳，则再加2% β-巯基乙醇5×Loading buffer 250 mM Tris-HCl（pH6.8）、10% SDS、0.5% 溴酚蓝、50% 甘油，用于非还原SDS-PAGE电泳，如用于还原SDS-PAGE电泳，则再加5% β-巯基乙醇考马斯亮蓝染色液 0.1%考马斯亮蓝R250、25%异丙醇、10%冰醋酸，水稀释至1 L考马斯亮蓝脱色液醋酸100 mL、乙醇50 mL、水850 mL4、操作步骤4.1 制胶：取合适的密封垫片和两块已清洁的干燥的玻璃板，组装成灌胶的模具，按下表制成分离胶，灌入模具内一定高度（一般离玻璃板上端3.5 cm），小心加水或异丙醇封顶（约0.5 cm高），室温下聚合（温度不同，聚合时间不同，20℃大约需30 min）。
SDS-PAGE标准操作规程
SDS—PAGE标准操作规程一、试剂（一)储存液(1)2M Tris-HCl （pH8.8),100ml称取24.2g Tris碱；加50ml蒸馏水;缓慢的加浓盐酸至pH8.8（约加4ml）；让溶液冷却至室温，pH将会升高;加蒸馏水至100ml.(2)1M Tris—HCl（pH6.8）,100ml称取12。
1g Tris碱；加50ml蒸馏水；缓慢的加浓盐酸至pH6。
8（约加8ml）；让溶液冷却至室温，pH将会升高；加蒸馏水至100ml.(3)10%(w/v)SDS，100ml。
室温保存称取10g的SDS；加蒸馏水至总量为100ml.(4)50%（v/v）甘油，100ml倒取50ml 100%的甘油；加入50ml蒸馏水。
(5)1%(w/v)溴酚蓝，10ml称取100mg溴酚蓝；加蒸馏水至10ml，搅拌直到完全溶解；过滤除去聚合的染料。
（二)工作液(1)30％（w/v)丙烯酰胺/0。
8%（w/v）双丙烯酰胺30g丙烯酰胺0.8g双丙烯酰胺注意：未聚合的丙烯酰胺是一种皮肤刺激物和神经毒素，操作时必须戴手套在通风柜操作，加蒸馏水至100ml,缓慢搅拌直至丙烯酰胺粉末完全溶解，过0.45μm滤膜。
可在4℃存放数月。
(2)4×Tris-Cl/SDS (pH8。
8 1。
5M Tris-Cl Containing 0.4%SDS)91g Tris base2g SDS加水300ml,用1N HCl调pH至8.8,再加水至500ml过0.45μm滤膜，4℃存放(3)4×Tris-Cl/SDS (pH6.8 0.5M Tris—Cl Containing 0.4%SDS)6。
05g Tris base0.4g SDS加水40ml，用1N HCl调pH至6。
8，再加水至100ml过0.45μm滤膜，4℃存放(4)10％过硫酸铵APS0.1g过硫酸铵1ml蒸馏水长期不用应-20℃干燥分装保存，临用前再加D。
SDS-PAGE凝胶电泳操作
SDS-PAGE凝胶电泳操作一、常规试剂的配制1. 30% 聚丙烯酰胺贮液：丙烯酰胺 150g，甲叉双丙烯酰胺4g，双蒸水500ml，滤纸过滤后，棕色瓶避光4℃保存；2.1.5mol/L，pH 8.8 Tris-HCl分离胶缓冲液：18.15g Tris，用1mol/L HCl定容至100ml，棕色瓶避光4℃保存；3. 1.0mol/L，pH 6.8 Tris-HCl分离胶缓冲液：12g Tris，用1mol/L 调pH至100ml，棕色瓶避光4℃保存；4. 10% SDS溶液：10g SDS加水定容至100ml，完全溶解室温保存；5. 10% AP溶液：0.1g AP（过硫酸铵）加水定容至1ml，用前新鲜配制；6. 1×SDS-PAGE电泳缓冲液：25mM Tris（3.0285g/L），192mM甘氨酸（14.41g/L），0.1%SDS （1g/L），pH 8.30；7. 染色液：0.25g 考马斯亮蓝R-250溶解于45ml甲醇，45ml水，10ml冰醋酸，过滤除去杂质；8. 脱色液：45ml甲醇，45ml水，10ml冰醋酸；9. 固定液：50ml甲醇，40ml水，10ml冰醋酸；10. 2×SDS-PAGE上样缓冲液：10% SDS 0.4ml，0.375M Tris-HCl（pH 6.8）0.333ml，甘油0.2ml，1% 溴酚兰10μL，β-疏基乙醇100μL，加水定容至1ml，分装后-20℃保存。
二、样品的处理1. 蛋白含量较低的酶制剂或原料样品（1）粉剂（或颗粒）样品称取样品1g，加入3-5ml蒸馏水进行搅拌溶解1h（搅拌时间可根据实际情况进行增减），4000rpm离心10min，取离心上清液等体积加入20%的三氯乙酸聚沉30min，离心，弃去离心上清液，用70%的丙酮溶液洗涤沉淀，4000rpm离心10min，重复洗涤3-5次，将丙酮洗涤液吹干，加入适量（1-3ml）PBS溶解沉淀，溶解液即可用于电泳实验。
SDS-PAGE分离蛋白技术
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白技术SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)是对蛋白质进行量化,比较及特性鉴定的一种经济,快捷,而且可重复的方法,该法主要依据蛋白质的分子量对其进行分离.【实验目的】掌握用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离不同蛋白质的方法.【实验原理】SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是蛋白分析中最经常使用的一种方法.它是将蛋白样品同离子型去垢剂十二烷基硫酸钠(SDS）及巯基乙醇一起加热，使蛋白变性，多肽链内部及肽键之间的二硫键被还原，肽键被打开，打开的肽键靠疏水作用与SDS结合而带负电荷，电泳时在电场作用下，肽链在凝胶中向正极迁移。
不同大小的肽链由于在迁移时受到的阻力不同，在迁移过程中逐渐分开，其相对迁移率与分子量的对数间成线形关系。
【实验器材与试剂】一,仪器垂直板电泳槽及配套的玻璃板,梳子,电泳仪,干式恒温培养器,微波炉等.二,材料蛋白样品,蛋白标准品,EP管三，试剂1,1.5mol/L Tris-HCL Ph8.8（已加SDS）2,0.5mol/L Tris-HCL pH6.8（已加SDS）3,10％SDS4,30％丙烯酰胺（Acr/Bis）溶液：29.2g丙烯酰胺（Acr）+0.8g甲叉双丙烯酰胺(Bis)，用双蒸水定容至100ml，过滤备用，4℃下存放。
5,10％过硫酸铵（AP）（-20℃存放）6, 2×样品缓冲液0.5mol/L Tris-HCL Ph6.8 2ml甘油 2ml20％SDS 2ml0.1％溴酚蓝 0.5mlβ-巯基乙醇 2~1.0ml双蒸水 2.5ml7, 5×电泳缓冲液T ris 7.5gGly 36gSDS 2.5g双蒸水溶解，定容至500ml，使用时稀释5倍。
8，染色液：0.2考马斯亮蓝R250+84ml95％乙醇+20ml 冰醋酸，定容至200ml，过滤备用9，脱色液：V（乙醇）:V(冰醋酸)：V（水）=7.5:7.5:85【实验内容】一，聚丙烯酰胺凝胶的配制1，分离胶（10％）的配制：双蒸水 4.0ml30％Acr/Bis 3.3ml1.5mol/LTris-HCL2.5ml10％SDS 0.1ml10％AP 0.1ml取1ml上述混合液，加TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)10μL封底，余加TEMED 4μL，混匀后灌入玻璃板间，以水封顶，注意使液面齐平，凝胶完全聚合需30~60min2，浓缩胶（4％）的配制：双蒸水 1.4ml30％Acr /Bis 0.33ml1mol/L Tris-HCL 0.25ml10％SDS 0.02ml10％AP 0.02mlTEMED 2μL将分离胶上的水倒去，加入上述混合液，立即将梳子插入玻璃板间，完全聚合15~30min。
SDS-PAGE电泳实验步骤
垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质一、实验目得学习ＳDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳法(ＳDS—ＰAGＥ)测定蛋白质得分子量得原理与基本操作技术、二、实验原理蛋白质就是两性电解质,在一定得ｐH条件下解离而带电荷。
当溶液得pH大于蛋白质得等电点(pＩ)时,蛋白质本身带负电,在电场中将向正极移动;当溶液得pH小于蛋白质得等电点时,蛋白质带正电,在电场中将向负极移动;蛋白质在特定电场中移动得速度取决于其本身所带得净电荷得多少、蛋白质颗粒得大小与分子形状、电场强度等。
聚丙烯酰胺凝胶就是由一定量得丙烯酰胺与双丙烯酰胺聚合而成得三维网状孔结构、本实验采用不连续凝胶系统,调整双丙烯酰胺用量得多少,可制成不同孔径得两层凝胶;这样,当含有不同分子量得蛋白质溶液通过这两层凝胶时,受阻滞得程度不同而表现出不同得迁移率。
由于上层胶得孔径较大,不同大小得蛋白质分子在通过大孔胶时,受到得阻滞基本相同,因此以相同得速率移动;当进入小孔胶时,分子量大得蛋白质移动速度减慢,因而在两层凝胶得界面处,样品被压缩成很窄得区带。
这就就是常说得浓缩效应与分子筛效应。
同时,在制备上层胶(浓缩胶)与下层胶(分离胶)时,采用两种缓冲体系;上层胶ｐＨ=6、7—6。
8,下层胶pH=8.9;Tris—HCＩ缓冲液中得Triｓ用于维持溶液得电中性及pＨ,就是缓冲配对离子;ＣI－就是前导离子。
在pH6.８时,缓冲液中得Gly—为尾随离子,而在pH＝8、９时,Gly得解离度增加;这样浓缩胶与分离胶之间ｐH得不连续性,控制了慢离子得解离度,进而达到控制其有效迁移率之目得。
不同蛋白质具有不同得等电点,在进入分离胶后,各种蛋白质由于所带得静电荷不同,而有不同得迁移率、由于在聚丙烯酰胺凝胶电泳中存在得浓缩效应,分子筛效应及电荷效应,使不同得蛋白质在同一电场中达到有效得分离。
如果在聚丙烯酰胺凝胶中加入一定浓度得十二烷基硫酸钠(SDS),由于SDＳ带有大量得负电荷,且这种阴离子表面活性剂能使蛋白质变性,特别就是在强还原剂如巯基乙醇存在下,蛋白质分子内得二硫键被还原,肽链完全伸展,使蛋白质分子与SDS充分结合,形成带负电性得蛋白质—SDS复合物;此时,蛋白质分子上所带得负电荷量远远超过蛋白质分子原有得电荷量,掩盖了不同蛋白质间所带电荷上得差异、蛋白质分子量愈小,在电场中移动得愈快;反之,愈慢。
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1 SDS-PAGE教程 1 SDS-PAGE原理 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠）， SDS会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与1.4 g去污剂结合。当分子量在15 KDa到200 KDa之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：log MW = K – bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。 SDS-PAGE [Laemmli法] 这种方法帖出来，大家是不是感觉非常的陌生呢？其实这种发方法很普遍，现在大部分的实验室都是用Laemmli法跑电泳的。如今实验室中用的最多的蛋白电泳是源于Laemmli于1970年发表在nature上的一篇文章中的方法，这篇文章很特别,不仅被引用的次数较多，而且该篇并不是专门阐述蛋白电泳方法上的提出和改进问题，而是对噬菌体头部包装过程中的蛋白进行分析过程中用到电泳分析方法而已，所以阐述如何操作的文字只有那么一小段（但相当经典），这是SDS-PAGE（不连续系统）的首次成功应用。现在我们在实验室进行的SDS-PAGE试剂的配方仍然是沿用了它的数据,许多论文在描述其SDS-PAGE时引用Laemmli方法，目前常用的具有浓缩胶和分离胶的不连续SDS-PAGE的基础的确来自Laemmli方法，但也略有差别例如一些缓冲液的具体组成。你也许会恍然大悟：原来我们用的就是Laemmli！ 2 SDS-PAGE各试剂配制方法 30%聚丙烯酰胺溶液-----30%（w/v）Acrylamide 【组分浓度】 各种组分名称 体积(mL)或质量(g) 备注 30%Acr-Bis(29:1) 100 mL 实验室配制时用量(100 mL) 29% Acrylamide(丙烯酰胺) 29 g 29.2 g 1% BIS(N,N’-亚甲丙烯酰胺) 1 g 0.8 g 【配制方法】 将29克丙烯酰胺和1克N,N’-亚甲丙烯酰胺溶于总体积为60ml温热（37℃左右）的去离子水中，充分搅拌溶解，补加水至终体积为100ml。0.45µm微孔滤膜过滤除菌和杂质，储于棕色瓶，4℃避光（用铝箔纸包扎起来）保存。严格核实pH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。如有沉淀，可以过滤。 【保存条件】
4℃避光（用铝箔纸包扎起来）保存 【注意事项】
丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可通过皮肤吸收，其作用具有累积性。称量丙烯酰胺和N,N’-亚甲丙烯酰胺时应戴手套和面具。可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能含有少量未聚合材料。
1 M Tris-HCl（pH6.8）(浓缩胶buffer) 【组分浓度】1 M Tris-HCl 名称 用量 备注 3
Tris 12.1g 去离子水 80ml 浓盐酸 9ml (36%的浓盐酸)预实验已确定
去离子水 加入去离子水定容至100ml后，室温保存 【配制方法】 称量12.1 g Tris碱溶于80 mL的去离子水，充分搅拌溶解，加约9 mL的浓HCl调节至所需要的pH值，将溶液定容至100 mL，高温高压灭菌后，室温保存。应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高1℃，溶液的pH值大约降低0.03个单位。 【保存条件】
室温保存。 【注意事项】
对人体有刺激性，请注意适当防护。
1.5 M Tris-HCl（pH 8.8）(分离胶buffer) 【组分浓度】1.5 M Tris-HCl 名称 用量 备注 Tris 18.17 g 去离子水 80 mL 浓盐酸 3 mL (36%的浓盐酸)预实验已确定
去离子水 加入去离子水定容至100 mL后，室温保存 【配制方法】100 mL 称量18.17 g Tris碱溶于80 mL的去离子水中，充分搅拌溶解，加约3 mL浓HCl调节至所需要的pH值，将溶液定容至100 mL，高温高压灭菌后，室温保存。 【保存条件】
室温保存 【注意事项】
应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高1℃，溶液的pH值大约降低0.03个单位。
10% 十二烷基硫酸钠SDS溶液-----10%(w/v)SDS 【组分浓度】10% (w/v) SDS 名称 用量 备注 SDS 1 g 去离子水 8 mL 加入去离子水定容至10 ml后，室温保存 【配制方法】 称取2 g高纯度的SDS置于100~200 mL烧杯中，加入约16 mL的去离子水，于68 ℃加热溶解，滴加浓盐酸调节pH至7.2，定容至20mL后，室温保存。 【保存条件】
室温保存 【注意事项】
对人体有害，请注意防护。
10% 过硫酸铵溶液-----10% (w/v) APS 【组分浓度】10% (w/v) 过硫酸铵(APS) 4
名称 用量 备注 过硫酸铵 0.1 g 去离子水 1 mL 现配现用 【配制方法】 称取0.1 g过硫酸铵置于1.5 mL离心管，加1 mL去离子水吹打溶解，亦可以加倍，即称取1 g过硫酸铵，加入10 mL的去离子水后搅拌溶解。4 ℃保存。 【保存条件】
4℃保存 【注意事项】
10%过硫酸铵溶液在4℃保存时，可使用2周左右，超过期限会失去催化作用。
5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液----- 5×Tris-Glycine buffer （SDS-PAGE电泳缓冲液） 【组分浓度】 各种组分名称 配制不同体积所需各成分的体积(mL)或质量(g) 1000ml 500ml 0.125M Tris 15.1g 1.25M glycine(甘氨酸) 94.0g 0.5%(W/V)SDS 5.0g 【配制方法】 称取15.1 g Tris，94.0g甘氨酸（glycine），5.0gSDS，用800mL蒸馏水或去离子水溶解，充分搅拌溶解，定容至1000 mL，室温保存。得0.125 mol/L Tris-1.25 mol/L甘氨酸电极缓冲液。临用前稀释5倍。 【保存条件】
室温保存，两年有效。 【注意事项】
配制好的电泳液使用时间不宜超过两周。 电泳缓冲液可以回收，回收后可再使用1-2次，但为了取得最佳的电泳效果，应使用新电泳液。
5×SDS-PAGE加样缓冲液----- 5×SDS-PAGE Loading Buffer 【组分浓度】0.25 M Tris-HCl (pH 6.8)；
10% (W/V)SDS； 0.5% (W/V) BPB(溴酚蓝)； 50% (V/V) 甘油； 5% (W/V) β-巯基乙醇(2-ME)或0.5 M DTT(二硫苏糖醇) 各种组分名称 配制用量 备注 总体积 10 mL 1 M Tris-HCl (pH 6.8) 2.5 mL SDS 1 g BPB(溴酚蓝) 50 mg 甘油 5 mL （0.5 mL/份）分装，室温保存，使用前加25 μL 2-ME/小份，保存一个月左右。 β-巯基乙醇(2-ME) 0.5 mL 【配制方法】 量取1.25 mL 1 M Tris-HCl（pH 6.8），0.5 g SDS，25 mg BPB，2.5 mL甘油，置于10 mL塑料离 5
心管中，加去离子水溶解后，定容至5 mL，小份（0.5 mL/份）分装，于室温保存。使用前将25 μL的2-ME加入到每小份中。加入2-ME的Loading Buffer可在室温下保存一个月左右。 【保存条件】
-20℃保存，至少一年有效。 【注意事项】
SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)中含少量DTT或β-巯基乙醇，有轻微刺激性气味，必须完全溶解后再使用。二者作用相似，但DTT 的刺激性和毒性都低于β-巯基乙醇，且粉末的稳定性也高于β-巯基乙醇。DTT的最佳工作pH范围为7.1-8.0，但DTT价格略高一些。蛋白巯基还原实验DTT的常用工作浓度是1-10 mM。 摘自Takara 商品目录--实验室常规试剂配制方法
TEMED原液直接使用 考马斯亮蓝R-250染色液 【组分浓度】0.1%(w/v)考马斯亮蓝R-250，25%(v/v)异丙醇，10%(v/v)冰醋酸 各种组分名称 配制不同体积所需各成分的体积(mL)或质量(g) 1000 ml 备注 考马斯亮蓝R-250 1.0 g 可以多加点，最好在摇床上摇摇，多溶解些。
异丙醇 250 mL 搅拌溶解，可用甲醇或乙醇替代。甲醇固定效果好，但甲醇难闻且对身体有害。乙醇浓度太大会使胶皱缩。
冰醋酸 100 mL 搅拌均匀
去离子水 650 mL 搅拌均匀，滤纸快速过滤除去颗粒物，室温保存 考马斯亮蓝R250染色，染色时间控制在0.5-1h。（注意：（1）保存考马斯亮蓝R250可回收使用，可保存很长时间，但一般不超过6个月；（2）染色时间过长难以脱色，过短染色效果不佳；） 考马斯亮蓝染色脱色液 【组分浓度】10%(v/v)醋酸，5%(v/v)乙醇 名称 用量 备注 冰醋酸 100 mL 乙醇 250 mL 一般加的量与染色液相同，只是不加R-250
去离子水 650 mL 充分混匀后使用 脱色（三个小时后应换次脱色液，再重新加入脱色液且约需脱色24小时，直到背景清晰为止） （1）蒸馏水中冲洗2-3次 （2）7％冰乙酸固定 （3）7％冰乙酸 10％乙醇83ml蒸馏水脱色 （4）7％冰乙酸保存（要检测脱色后的胶，则需保存于7％冰乙酸中） 蒸馏水冲洗→7％冰乙酸（关键步骤），10％乙醇脱色
脱色液：7％冰乙酸 ，10％乙醇，83ml蒸馏水 7％冰乙酸保存（蒸馏水冲洗后用7％冰乙酸保存且约二～四天后再照胶，条带更为清晰）。 银氨染色用凝胶固定液（质谱用） 【组分浓度】 50% (V/V) 甲醇，10% (V/V) 醋酸
名称 用量 备注 甲醇 500 mL