creloxp转基因小鼠制作
转基因小鼠的制备方法
转基因小鼠的制备方法1. 确定转基因目标首先需要确定要制备的转基因小鼠的目标。
这可能包括表达某一特定基因、缺失或激活某一基因、或者将外源基因导入小鼠基因组中。
确定目标可以指导后续制备转基因小鼠的方案和步骤。
2. 选择转基因制备方法根据目标确定适合的转基因制备方法。
常用的制备方法包括基因敲除、转基因导入、RNA干扰等技术。
选择合适的方法可以提高转基因小鼠制备成功率和效率。
3. 筛选合适的人工受精方法在制备转基因小鼠的过程中，需要进行人工受精。
选择合适的人工受精技术可以增加诞生的转基因小鼠数量和通过率。
4. 获取合适的基因材料获取适合用于转基因制备的基因材料，如合成的DNA、质粒DNA等。
同时需要对基因材料进行检测和纯化，确保其纯度和有效性。
5. 操作动物实验室在制备转基因小鼠的过程中，需要操作动物实验室，按照严格的操作规程进行。
这包括对实验室环境、设备的维护和消毒，以及对动物进行规范的喂养和饲养。
6. 采集卵巢和精子制备转基因小鼠的过程中需要采集卵巢和精子，所以需要进行手术操作。
手术前需要对手术器械和手术区域消毒和准备，同时需要准确的手术技术和配合的团队，以确保手术的成功率和安全性。
7. 受精与移植将采集到的卵巢和精子进行人工受精，通过一定的操作步骤，将受精卵移植到雌鼠子宫中。
这个过程需要对移植操作技术的掌握和实验设备的准备，同时要考虑动物的生理状态和应对可能出现的并发症。
8. 生成基因编辑电子对于基因敲除和编辑的转基因小鼠制备，需要经过足够长的时间养护和观察，以鉴定是否成功。
为了确保小鼠的转基因性，可以通过检测其DNA进行验证。
9. 鉴定转基因小鼠通过PCR、Southern印迹和Western印迹等技术对转基因小鼠进行鉴定，以确保其基因表达状态符合预期。
检测结果对于小鼠繁殖和应用阶段的进行具有重要的指导意义。
10. 培育和应用转基因小鼠在检测合格后，需要对转基因小鼠进行养育和观察。
同时对于其应用也需要依据对小鼠目标的不同，进行个性化的实验设计和数据处理。
基于CreLoxP系统建立软骨组织特异性印第安刺猬蛋白基因敲除小鼠模型
室，山西省太原市 030001；2美国布朗大学医学院骨科/罗德岛州医院骨科，RI02903美国罗德岛州)
DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.1248
ORCID: 0000-0002-4599-4091(袁涛)
文章快速阅读：
Ihh 条件性基因敲除小鼠动物模型的建立
♂：基因型 Co12alCreERT2 小鼠
Corresponding author: Zhang Min, Associate professor, Second Affiliated Hospital of Shanxi Medical University, Shanxi Key Laboratory of Bone and Soft Tissue Injury Repair, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China
《中国组织工程研究》 Chinese Journal of Tissue Engineering Resea第安刺猬蛋白 基因敲除小鼠模型
·研究原著·
袁 涛1，王勇卓1，黄远章1，席 刚1，魏 垒1，2，张 民1 (1山西医科大学附属第二临床医学院，骨与软组织损伤修复山西省重点实验
印第安刺猬蛋白：Indian hedgehog，Ihh
Yuan Tao, Master candidate, Second Affiliated Hospital of Shanxi Medical University, Shanxi Key Laboratory of Bone and Soft Tissue Injury Repair, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China
♀：基因型 Ihhfl/fl 小鼠
基因敲除小鼠的制作方法
基因敲除小鼠的制作方法基因敲除小鼠是一种常用的遗传工具，在科学研究中被广泛应用于功能基因组学和疾病模型研究。
基因敲除是指通过特定技术手段，将小鼠体内的目标基因完全沉默或失活，从而研究该基因在发育、生理以及疾病机制中的功能。
本文将介绍基因敲除小鼠的制作方法，包括设计目标基因的敲除载体、胚胎干细胞的筛选和注射、外显子敲除策略的选择等。
1.设计目标基因的敲除载体敲除载体是嵌入目标基因的重要工具。
它通常包含正向与反向的同源臂（homology arms）以及选择标记（如抗生素抗性基因）。
同源臂的长度通常在2-5 kb之间，确保在同源重组时准确而有效地替代目标基因。
此外，敲除载体中还应该包含可诱导甲基化的Cre-loxP重组体系或者FLP-FRT重组体系，以用于后续的基因定向敲除或基因重新组装。
2.筛选胚胎干细胞胚胎干细胞是从内胚层发育而来的多潜能细胞，可以分化为整个鼠体的各种组织和器官。
敲除载体首先需要通过电转或霰粒枪等手段转染到胚胎干细胞系中。
转染后，胚胎干细胞需要进行抗生素筛选，以过滤未转染的细胞。
为了确保目标基因的敲除率，可以使用增强绿色荧光蛋白（eGFP）等标记基因，通过荧光显微镜观察转染细胞的表达情况。
3.敲除载体注射到小鼠受精卵中一旦确认胚胎干细胞中存在敲除载体，接下来就是将胚胎干细胞植入小鼠受精卵。
这个步骤一般由经验丰富的研究人员或者专业公司进行。
首先，选择合适的受精卵（通常为C57BL/6J小鼠品系），然后利用显微操作技术，将敲除载体注射到受精卵的核酸注入腔。
注射后，将受精卵转入对应营养液中培养一定时间，以期达到最佳着床率。
4.敲除鼠胚移植到配子体内经过培养后，将敲除的胚胎植入雌性激素准备好的代孕小鼠（通常为白色的株系，如ICR）。
移植后，将代孕小鼠继续养育，直至分娩。
5.验证敲除小鼠的敲除效果通过提取敲除小鼠的DNA，可以利用PCR、Southern blot和DNA测序等技术验证敲除效果。
flox cre小鼠基因型鉴定流程
floxed cre 鼠标代表一种基因工程的菌株，其特征是有loxP站点侧绕特定基因或基因。
将这种肌肉模型基因化的目的是明确确认软体基因
和cre rbinase基因的存在。
这种验证是研究人员不可或缺的先决条件，因为它直接影响到鼠标的phenotypic和行为特征。
基因分解程
序要求从老鼠身上提取DNA，然后扩大特定的DNA区域，然后对肽
进行分析，以确定浮离基因和cre基因是否存在。
在格诺泰平的微妙舞蹈中，第一个崇敬的步子始于从高尚的老鼠中温
柔地提取DNA。
一种小的供奉组织，无论是从耳朵还是从尾部，在经过温柔的处理以释放体内生命的精髓之前，都要以庄严的敬意来收集。
为此使用了一系列神秘的脱氧核糖核酸提取包和神圣协议，每项选择
都以虔诚的考虑为目的，考虑加固基因组仪式的具体需要。
珍贵的DNA被解放后，它被测量和稀释到一个统一的标准，确保每个片段携带相同的乙醚浓度，与宇宙的和谐共振。
基因分解程序的随后阶段，需要扩大含有loxP和cre序列的特定
DNA区域。
这一关键过程通常通过聚合酶链式反应（PCR）加以执行，这种反应使用精细设计的基本素，有选择地与上述区域结合。
随后，PCR产品通过agarose凝胶电泳检查，目的是可视化放大DNA碎片
的存在。
正乌将表现为与PCR产品预期大小相匹配的波段，表示浮离基因和cre基因的存在。
反之，负值将显示无带，表明目标基因的缺乏。
通过应用测序法或替代分子方法，可能有必要对基因组结果进行
后续核查。
增强子驱动的Cre转基因小鼠的构建及Cre基因的表达鉴定
增强子驱动的Cre转基因小鼠的构建及Cre基因的表达鉴定王立良;王淼;张玉建;王浩;刘勇;邵一鸣【期刊名称】《生物技术通讯》【年(卷),期】2010(021)003【摘要】目的:探索将增强子应用于构建Cre转基因小鼠品系,为以条件基因敲除为基础的基因功能研究提供更多的工具.方法:通过PCR方法从小鼠的细菌人工染色体扩增UH增强子片段,构建含有Hsp68基础启动子、增强子UH、Cre重组酶基因和SV40 polyA的转基因载体pLW400,将3.3 kb的转基因片段通过显微注射导入小鼠受精卵;为了检测Cre在转基因小鼠中的表达,将转基因一代小鼠与纯合子ROSA26报告小鼠(R/R)交配,收集第14 d胚胎期(E14)的舌组织进行LacZ染色检测鉴定.结果:经鉴定,31只子代小鼠中有6只携带外源基因,整合率为19.4%;与R/+对照相比,E14期的双基因型Cre,R/+舌组织为阳性结果(蓝色).这表明Cre基因在转基因小鼠舌组织内得到表达,并在体内介导ROSA26基因座loxP位点间的重组,且有效删除了2个loxP之间的片段,从而启动了LacZ基因的表达.结论:构建了UH 增强子-Hsp68Cre的转基因小鼠,在舌肌中特异表达Cre基因,提示增强子可以被选择应用于Cre转基因小鼠的构建;为舌肌的发育和再生研究奠定了基础.【总页数】6页(P304-309)【作者】王立良;王淼;张玉建;王浩;刘勇;邵一鸣【作者单位】中国疾病预防控制中心,性病艾滋病预防与控制中心,北京,100176;University of Pennsylvania,Philadelphia,PA 19104-6160,USA;ApoCell Biosciences,Inc.,Houston,TX 77054,USA;Baylor College ofMedicine,Houston,TX 77030,USA;中国疾病预防控制中心,性病艾滋病预防与控制中心,北京,100176;中国疾病预防控制中心,性病艾滋病预防与控制中心,北京,100176【正文语种】中文【中图分类】Q789【相关文献】1.Tet-on和Cre/loxP双调控肝靶向表达Cre重组酶转基因小鼠的制备和功能评价[J], 赵亚;康健;招明高;汪爱勤;尹文;马玉;黄豫晓;兰海云;孙梦宁;吕欣;杨敬;雷迎峰;张建敏2.消化道细胞表达Cre重组酶转基因小鼠的功能鉴定 [J], 仇玮祎;王友亮;时令;孙岩松;滕艳;杨晓3.心脏和软骨细胞特异性表达Cre重组酶转基因小鼠的基因型鉴定 [J], 侯宁;王剑;李文龙;张继帅;杨晓4.平滑肌细胞特异表达Cre重组酶转基因小鼠Cre重组酶的表达分布 [J], 杨蕾蕾;吴壮;程萱;徐军;杨晓5.Cre重组酶表达载体的构建及其在转基因小鼠胰腺中的表达 [J], 周江;杨晓;程萱;程静;黄翠芬因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
制备转基因小鼠的原理
制备转基因小鼠的原理
制备转基因小鼠的原理是通过基因工程技术将外源基因导入小鼠的基因组中。
具体步骤如下：
1. 选择目标基因：根据研究需求选择要导入小鼠基因组的外源基因。
这个外源基因可以来自其他物种，也可以是已存在于小鼠中但表达量较低的基因。
2. 构建质粒：将选择的目标基因与载体DNA（如质粒）连接。
质粒通常含有特定的启动子、终止子和选择性标记基因（如抗生素抗性基因），以便检测和筛选成功导入外源基因的小鼠。
3. 体外培养：将构建好的质粒导入细胞培养物中，利用细胞的自身复制和修复机制，使质粒与小鼠细胞的染色体发生重组，将外源基因导入到小鼠的基因组内。
4. 选择性筛选：为了筛选成功导入外源基因的细胞，可以添加抗生素等选择性标记物质，只有带有外源基因的细胞能够存活下来。
5. 胚胎干细胞注射：将筛选出的带有外源基因的细胞注射到小鼠的早期胚胎中。
这些细胞会参与胚胎发育，在小鼠的成体组织中形成细胞系，继续表达外源基因。
6. 交配和繁殖：将带有外源基因的小鼠进行交配和繁殖，使外源基因在小鼠种群中得以传递和稳定遗传。
通过以上步骤，外源基因成功导入小鼠基因组，并表达在小鼠的细胞和组织中，从而达到制备转基因小鼠的目的。
Cre-loxp系统
Cre-loxp系统Cre-lox系统介绍及使⽤汇总由于Cre-lox系统具有操作简单、重组率⾼的优点，如今已经成为体内外遗传操作的强有⼒⼯具。
利⽤Cre-lox系统，可以在特定细胞、组织或整个⽣物体，甚⾄在特定时间点敲除或表达某个基因，实现对特定基因的时空特异性操作，这对基因功能的研究和⼈类疾病动物模型的建⽴都具有深刻影响。
1.什么是Cre-lox系统？从名字就能知道这套系统的两个主要组成部分：(1)Cre重组酶环化重组酶（Cre,cyclizationrecombinase），是酪氨酸位点特异性重组酶之⼀，能催化两个DNA 识别位点之间的位点特异性重组。
Cre重组酶来源于P1噬菌体，由343个氨基酸组成，能特异性地识别Lox位点。
除Cre以外，此类重组酶还有Flp（flipase）和Dre（D6特异性重组酶）。
(2)Lox位点Cre重组酶识别的回⽂DNA位点，也叫loxP(locusofX-overP1)位点，长34bp，其特征结构为ATAACTTCGTATA?-NNNTANNN-TATACGAAGTTAT。
两边反向互补的13个碱基为Cre重组酶的识别序列，中间的8个碱基为重组发⽣位置，这也决定了loxP的⽅向。
N表⽰可变碱基，不同的碱基选择可形成不同的Lox位点，除了野⽣型loxP，常见的还有Lox2272，Lox511，Lox5171等等，这些突变Lox位点也能被Cre重组酶识别，但是只有两个序列相同的Lox位点之间才能发⽣重组。
在同⼀个DNA分⼦上，根据Lox位点的位置与⽅向，可能会发⽣3种不同的重组事件：（1）切除：当两个Lox位点在同⼀染⾊体上且⽅向相同时，将切除同向Lox位点之间的DNA序列（也叫Lox侧翼序列，Flox序列）。
（2）反转：当两个Lox位点位于同⼀染⾊体上且⽅向相反时，两个Lox位点之间的序列发⽣序列反转，即颠倒。
（3）易位：如果两个Lox位点位于不同的染⾊体上且⽅向相同，则易位事件将导致DNA ⽚段的交换。
逆转录病毒转导的重组酶Cre在体外对LoxP标记的小鼠骨髓细胞DNA重组
逆转录病毒转导的重组酶Cre在体外对LoxP标记的小鼠骨髓细胞DNA重组陆群;吴补领;周学东;王冀姝;韩骅【期刊名称】《第四军医大学学报》【年(卷),期】2003(024)009【摘要】目的: 研究逆转录病毒体系转导的重组酶Cre在体外对LoxP标记的基因组进行重组的能力. 方法: 用逆转录病毒表达Cre,体外感染条件性基因剔除(即LoxP标记的基因)小鼠来源的原代培养的骨髓细胞. 从被感染的骨髓细胞中提取基因组DNA,利用PCR的方法显示LoxP标记的基因组长度的剪切前后改变,从而反映Cre在体外对LoxP标记的基因组的重组力. 结果: 被表达有Cre的逆转录病毒感染后的骨髓细胞,其特定的基因组长度发生了预期的变化,被标记的片段部分发生缺失. 结论: 在体外,用逆转录病毒体系转导重组酶Cre能够有效地对LoxP标记的基因组进行重组. 为用这一方法在体外研究特异基因对细胞生物学行为的影响奠定基础.【总页数】3页(P785-787)【作者】陆群;吴补领;周学东;王冀姝;韩骅【作者单位】四川大学华西口腔医学院,四川,成都,610041;第四军医大学口腔医学院牙体病科,陕西,西安,710033;四川大学华西口腔医学院,四川,成都,610041;第四军医大学基础部医学遗传学与发育生物学教研室,陕西,西安,710033;第四军医大学基础部医学遗传学与发育生物学教研室,陕西,西安,710033【正文语种】中文【中图分类】R595.1【相关文献】1.心外膜细胞标记基因介导的Cre重组酶在双转基因小鼠心脏的表达 [J], 曾彬;武智晓;张静;易欣;马乐乐2.Tet-on和Cre/loxP双调控肝靶向表达Cre重组酶转基因小鼠的制备和功能评价[J], 赵亚;康健;招明高;汪爱勤;尹文;马玉;黄豫晓;兰海云;孙梦宁;吕欣;杨敬;雷迎峰;张建敏3.重组酶Cre在体外对LoxP标记的基因组进行重组的初步研究 [J], 陆群;吴补领;张洪伟;王冀姝;韩骅;余擎;苏凌云4.利用Loxp/Cre重组酶体系构建脂肪组织GGPPS特异性缺失的小鼠模型 [J], 薛晓萌; 刘健5.利用Cre蛋白质转导重组酶诱导DNA重组 [J], SunilK.Joshi;曹洪战因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
基因定点条件性过表达小鼠技术实验流程
基因定点条件性过表达⼩⿏技术实验流程
条件性过表达主要通过染⾊体位点特异性重组酶系统实现，如Cre-loxP、Flp-FRT、Dre-Rox系统等，其中最常⽤的是Cre-loxP系统。
构建Rosa26-(SA/pCAG)-loxP-Stop-loxP-cDNA-pA重组载体，将条件性过表达结构插⼊到Rosa26基因intron1中。
通过与不同Cre⼩⿏进⾏交配，从⽽使⽬的基因稳定过表达于特异性组织和细胞中，⽽在其他组织中不表达。
基因定点条件性过表达技术优势
避免随机整合转基因⼩⿏模型中出现的多拷贝数、多位点插⼊、表达不稳定等问题;
通过与不同Cre⼩⿏交配，从⽽实现在空间上外源基因稳定的可调控表达，避免全⾝性过表达产⽣的异常表型;
可⽤于基因或蛋⽩功能的过表达研究，或基因敲除表型的rescue实验。
基因定点条件性过表达实验流程。
基因工程小鼠肿瘤模型构建方法
基因工程小鼠肿瘤模型构建方法
（1）敲除小鼠（CRቤተ መጻሕፍቲ ባይዱSPR/Cas9）：基因的完全敲除，风险是有可能胚胎致死。（2）条件性敲除小鼠（Cre/LoxP）：基因的条件性敲除，可选择在特定的组织和特定的时间进行基因敲除或敲入。推荐指数：★★优点：可对小鼠基因进行操作，模拟基因突变的肿瘤发生过程。缺点：贵操作复杂，周期长。适用研究：基因突变导致的肿瘤发病机制，肿瘤发生转移和药物研究。获取方法：可以自己构建（难度大），也可以购买已有的商业化小鼠或定制。
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除了没把具体的同源臂标出来，同源重组方法添加进/置换的片段（打靶载体）
在第二行
第一行是野生型的
重组进去后就成了第三行
flp能剪掉frt括起来的片段
cre能减掉loxp括起来的片段
鉴定用的两个探针能去识别相应的位置，这些位置都在特定酶切位点间
由于插入/删除的关系 相应的酶切产物大小不同
探针弹出来的片段大小也就不同
从而确定是否成果实现了片段的插入/删除
neo是个新霉素抗性删选 筛选完了后用frt/flp去掉以免对后续实验产生不可
预知的影响