宏基因组学的研究进展

宏基因组学的研究状况及其发展

摘要：宏基因组学是近年来发展起来的一门新兴学科，主要技术包括从环境样品中提取微生物混合基因组DNA、利用可培养的宿主菌建立宏基因组文库及筛

选目的基因。该技术可以克服传统培养技术的不足，是研究未培养微生物、寻找新功能基因和开发获得新资源的重要新途径。目前宏基因组学已广泛应用于各个领域，并在医药、农业、能源开发、环境修复、生物技术、生物防御等方面有了较深入的研究。

关键词：宏基因组学、宏基因组、基因组文库构建、文库筛选、未培养微生物、研究进展

随着微生物学的发展，微生物基因组全序列测定计划正在全球被快速地推行，但现有技术条件下，自然界存在的可培养微生物不到总数的1％，阻碍了该计划

的发展，使得绝大多数的微生物资源不能被开发和利用。21世纪初，随着测序能力的提高和基因组学的发展，科学家提出了一种研究不可培养微生物基因组的新思路——直接对含有各种不可培养的微生物的群体进行基因组序列的测定。这类研究称为Metagenomics，前缀“Meta”源于希腊语。意思是“超越”。科学家选择它来表示这种基因组研究超越了传统意义上分析单一物种的基因组学，将研究对象定为由种类众多的微生物组成的整个菌落。国内的研究者也据此将该术语翻译为“宏基因组学”。

1 宏基因组的概念

宏基因组 (也称微生物环境基因组、宏基因组学、元基因组学、生态基因组学) 是由Handelsman等1998年提出的新名词, 其定义为“the genomes of the total microbiota found in nature”，即生境中全部微小生物遗传物质的总和。它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因, 目前主要指环境样品中的细菌

和真菌的基因组总和。而所谓宏基因组学就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象, 以功能基因筛选和测序分析为研究手段, 以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究方法。一般包括从环境样品中提取基因组 DNA, 克隆DNA到合适

的载体,导入宿主菌体,筛选目的转化子等工作。宏基因组文库既包含了可培养的又包含了不能培养的微生物基因，避开了微生物分离培养的问题，极大地扩展了微生物资源的利用空间，增加了获得新的生物活性物质的机会，为新的医药产业和发现新的生物技术提供丰富的基因文库，并利于环境微生物有机群体的分布和功能的研究。

2 宏基因组学的研究过程

2．1 宏基因组文库的构建

宏基因组文库的构建沿用了分子克隆的基本原理和技术方法，并根据具体环境样品的特点和建库目的采用了一些特殊的步骤和策略。一般包括样品总DNA的

提取、与载体连接和克隆到宿主中。

2．1．1样品总DNA的提取

宏基因组文库构建的关键之一是获得高质量的目的样品的总DNA。目的样品

的采集是第一步，除了需严格遵循取样规则外，取样中应尽量避免对样品的干扰，缩短保存和运输的时间，使样品能更好地代表自然状态下的微生物原貌。

根据提取样品总DNA前是否分离细胞，提取方法可以分为原位裂解法和异位

裂解法。原位裂解法主要是通过去污剂处理(如SDS)、酶解法(如蛋白酶K)、机械

破碎法(如珠打)、以及高温或冻融法等直接破碎样品中的微生物细胞而使DNA得以释放。由于无须对样品微生物进行复苏，且黏附于颗粒上的微生物细胞亦能被裂解，所得DNA能更好地代表样品微生物的多样性，而且此法操作容易，成本低，DNA提取率高；但由于机械剪切作用较强，所提取的DNA片段较小(1～50 kb)，且腐殖酸类物质也难以完全去除。该法通常适用于构建小片段插入文库(质粒或λ

噬菌体为载体)的DNA提取。异位裂解法则先采用物理方法(如尼可登介质密度梯度离心法)将微生物细胞从样品中分离出来，然后采用较温和的方法抽提DNA(如低熔点琼脂糖包埋裂解，脉冲凝胶电泳回收DNA法)。此法处理条件温和，可获得大片段DNA(20～500 kb)，纯度高；但操作繁琐，成本高，得率也较低，有些微生物在分离过程中可能丢失，温和条件下一些细胞壁较厚的微生物DNA抽提不出来。该法通常适用于构建大片段插入文库(柯斯质粒或者细菌人工载体为载体)

的DNA提取。

2．1．2载体

宏基因组文库的构建需要适宜的克隆载体，通常用于DNA克隆的载体主要包括质粒、粘粒和细菌人工染色体等。质粒一般用于克隆小于10 kb的DNA片段，适用于单基因的克隆与表达。粘粒(大部分是用pWE l5载体，插入片段在40 kb左右)和细菌人工染色体(插入片段可达350 kb)已被广泛地用于大插入片段文库的构

建中，以期获得由多基因簇调控的微生物活性物质的完整的代谢途径；该法已成功的用于抗菌素紫色杆菌素的合成等。另外，构建能容纳40kb外源DNA插入片段的fosmid文库也有报道。

2．1．3 宿主

选择适宜的宿主细胞是重组基因高效克隆或表达的前提之一。宿主的选择主要考虑到转化效率、宏基因的表达、重组载体在宿主细胞中的稳定性以及目标性状的筛选等。对于任何宏基因组来源的基因来说，大肠杆菌(E.coli)依然是最理想的克隆和表达宿主。近年来也有报道使用其他宿主菌，如被用来鉴定与新抗生素生物合成相关的基因的变铅青链霉菌和其他的革兰氏阴性菌。也可以用穿梭粘粒或BAC载体将构建于大肠杆菌的文库转入其他宿主，如链霉菌或假单胞菌属中。一些缺陷突变体也可作为宿主来进行文库的功能筛选。

2．2 宏基因组文库的筛选

根据其研究目的，宏基因组文库的筛选通常有两种方法：功能筛选和序列筛选。功能筛选法根据重组克隆产生的新活性进行筛选，可用于检测编码新型酶的全部新基因或者获取新的生物活性物质。该法对全长基因及功能基因的产物具有选择性。其最大的缺点是要依靠宿主菌株的表达，且受检测手段的局限，工作量大，效率低，往往分析成千上万个克隆仅能获得不到10个活性克隆。利用该方法已成功分离了一些降解酶、抗生素抗性和抗生素编码基因。序列筛选法根据已知相关功能基因的保守序列设计探针或PCR引物，通过杂交或PCR扩增筛选阳性克隆子。用这种方法有可能筛选到某一类结构或功能的蛋白质中的新分子。其优点是不必依赖宿主菌株来表达克隆基因，已建立的杂交或PCR扩增技术可用于筛选工作中，且基于DNA的操作有可能利用基因芯片技术而大大提高筛选效率。其缺点是必须对相关基因序列有一定的了解，较难发现全新的活性物质，也很难获得全序列。

3 宏基因组学的应用研究进展

3.1 宏基因组学在海洋药物研究中的应用

海洋药物开发受着一些因素的限制，包括活性天然产物的痕量存在、活性物

质难于化学合成、海洋微生物难于培养等。已有的研究显示，超过95％的海洋微生物在现有实验条件下不能人工培养，传统的活性物质筛选方案无法涉及这些未培养微生物，这影响了海洋活性天然产物的应用范围。Schroder等以海绵为例提出了一些化学合成、体细胞培养等解决方法，这些方法提高了生物材料的产量，然而仍没有从根本上解决生物量缺乏和未培养微生物等方面的瓶颈问题。宏基因组学的诞生为解决这个问题提供了新的途径。

目前，已应用宏基因组学技术研究了多种海洋次生代谢产物合成途径。其中最为经典的研究是海洋聚酮类和非核糖体肽类的生物合成基因簇，从而解开了像Bryostatin A，Barbamide，Pederin等抗肿瘤活性物质的生物合成面貌，对海洋微生物宏基因组学和抗肿瘤药物的研发提供了新的思路。

3.2 宏基因组学在发现新基因方面的应用

由于自然界中大多数微生物物种及其生物量是未知的，因此从构建的任一宏基因组文库中鉴定出的大多数基因将都是新基因。因此即使是对一个相对较小的宏基因组文库进行筛选，所获得的序列与已公布的数据库中的序列的相似性也很低。例如，Tyson等人对一个群落结构相对简单的嗜酸生物膜的宏基因组进行测序，从76 Mbp中鉴定出的新基因超过了4 000个。Venter等人构建了马尾藻海的微生物群落宏基因组文库，用随机鸟枪法进行测序，所测的序列超过10亿bp，从中鉴定了1．2x106个新基因，有力地证明了该方法是发现新基因的有效手段。利用宏基因组文库，已发现的新基因主要有生物催化剂基因、抗生素抗性基因以及编码转运蛋白基因等。

3.3 宏基因组在开发新的微生物活性物质中的应用

近些年来，由于极高的重复发现率，利用纯培养技术从环境微生物中筛选到新活性物质的机率显著下降。宏基因组学则为新的微生物活性物质的开发提供了新思路。目前通过采用土壤、海水、海洋浮游生物、海绵、甲虫、人唾液等环境样品，成功构建了宏基因组文库，筛选到多种新的生物活性物质如各种酶类及一些次生代谢产物等，包括几丁质酶、4-羟基丁酸代谢酶系、脂酶，酯酶、淀粉酶、蛋白酶、β-葡萄糖苷酶、β-内酰胺酶、酰胺酶、腈水解酶、果胶酶、氧化还原酶、琼脂糖酶、核酸酶、生物素合成酶系、膜蛋白、色素(如靛红)、抗菌抗肿瘤活性物质(如紫色杆菌素)及抗生素抗性基因(如N-酰基酪氨酸合成酶基因)等；并且在此基础上获得了新酶的许多特征信息。例如，Lorenz等人利用质粒pUC l8构建了德国Heidelberg附近pH值为8的碱性土壤宏基因组文库，从50 000个克隆子中筛选到120个具有脂酶/酯酶活性的阳性克隆，pH值和热稳定性等生化特性研究表明，120个阳性克隆的最适pH值范围分别在5～9、热稳定性在40～95℃，在生化特性方面显示出极大的差异。同样，Yun等选用pUC l9为克隆载体构建大肠杆菌基因组文库，对其表达出的酶蛋白进行特征分析，发现该酶具有独特的转糖基作用，同时还具有仪α-淀粉酶、葡聚糖转移酶和新普鲁兰酶的共同特征。因此，可以相信，将宏基因组文库筛选和基因改组等基因工程技术结合起来，在开发新的微生物活性物质方面具有巨大潜力。

3.4 宏基因组在生物降解作用方向的研究

随着工业的快速发展及人类对资源的大量开发和利用，给环境带来了严重的污染问题，微生物是适应环境能力最强的物种，探索污染环境微生物适应性及其获得适应性的途径，可以更好地揭示生物与环境之间的生态学意义，为污染环境的生物修复提供理论依据。利用微生物的生物修复潜能解决环境污染问题是目前环境治理的一个重要研究方向。细菌可能通过改变启动子结构或激活启动子之间

不活泼的核心序列来参与专一性底物降解过程，或通过抑制非必需因子及较强蛋白质分子的精细调节作用来降解异型生物复合物。研究结果表明，某些细菌对有机污染物具有生物矿化作用，Janssen等发现细菌的脱卤素反应可催化碳卤结合物的分裂，而碳卤结合物的分裂是环境污染物---卤素化合物需氧矿化的关键一步，采用基因突变使细菌沉默的基因发挥催化功能或使其作用的底物范围改变，而增强细菌分解有机合成卤素的能力。环境微生物中具有大量的未知的脱卤素序列片段，利用宏基因组方法可以筛选出具有降解能力的目的克隆，达到清除有毒污染物以净化环境的目的。此外，某些细菌具有固定污染水中的重金属能力。随着对环境细菌宏基因组研究的不断深入，人类可获得大量的降解基因，通过遗传工程的方法，设计新的代谢途径，构建出具有多降解基因的工程菌，这将对治理环境污染的生物修复有着重大的意义。

4 展望

从环境宏基因组中获得功能基因，不仅可以用于新药的研发，而且在新的工业用酶等生物活性物质的筛选及在解决环境污染的生物修复等问题方面都具有广阔的前景，是基因工程研究的一个主要方向。目前，运用宏基因组技术对海洋病毒已有较深人的研究，而对土壤病毒所开展的研究还很少。构建环境cDNA文库，促进真菌资源的开发应用研究，也将是宏基因组学的主要研究内容之一。尽管目前存在表达的外源基因量少、缺乏高效的筛选方法等不足，但是随着新的科技方法的不断发展，应用范围将会越来越广泛。另外，宏基因组学研究涉及领域广、工作量巨大，单个人员或实验室很难建立起所有环境样本的取样、建库、筛选等一系列方法体系，或在短期内获得环境样品基因库中的所有靶标。因此，如能整合建立起各种环境样品宏基因组信息的共享数据库，同时加强与分子生物学、计算机科学、生物信息学等学科的交叉融合，相信宏基因组学技术必将在未来环境污染治理和修复研究领域中发挥更大的作用。

参考文献：

1.吴家睿.漫谈宏基因组学.SCIENCE，2006,58（5）.

2.张辉，崔焕忠.宏基因组学及其研究进展.中国畜牧兽医，2010，37（3）.

3.冯美琴.宏基因组学的研究进展.安徽农业科学，2008,36(2):415-416.

4.周通，牛荣丽，林秀坤.宏基因组学在海洋药物研究中的应用.中国海洋药物杂志，2006,25（2）.

5.张慧妮，田宝玉，江贤章，黄钦耿，柯崇榕，杨欣伟，黄建忠.宏基因组在发现新基因方面的应用.生物技术，2009，19（4）.

6.张薇，高洪文，张化永.宏基因组技术及其在环境保护和污染修复中的应用.生态环境，2008,17(4):1696-1701.

7.贺纪正，张丽梅，沈菊培，等．宏基因组学的研究现状和发展趋势．环境科学学报，2008，28(2)：209-218．

8.沈菊培，张丽梅，郑袁明，朱永官，贺纪正.土壤宏基因组学技术及其应用.应用生态学报.2007,18,(1):212-218.