一种产抑菌活性物质乳酸菌的快速筛选方法
收稿日期：２００７－０６－３０
基金项目：湖北省“十一五”重点科技攻关项目（２００６ＡＡ２０５Ａ０１）；湖北省农业科技创新中心资助项目（２００７－６２０－００１－０３）作者简介：张国强（１９８２－），男，山东潍坊人，２００５级硕士研究生，（电话）１３７９７０７９４９５（电子信箱）ｇｕｏｑｉａｎｇ＿ｆｓｅ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ；
通讯作者，杨自文，研究员，博士，（电话）０２７－８７３８９７３２（电子信箱）ｚｗｙａｎｇ＠ｐｕｂｌｉｃ．ｗｈ．ｈｂ．ｃｎ。
文章编号：０４３９－８１１４（２００７）０５－０７４１－０３
第４６卷第５期２００７年９月
湖北农业科学
ＨｕｂｅｉＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ
Ｖｏｌ．４６Ｎｏ．５Ｓｅｐ．，２００７
泡菜发酵是一种具有２０００多年历史的乳酸发酵工艺。泡菜发酵主要是乳酸发酵，发酵过程中会产生大量有机酸，细菌素，益生菌等，可以调节动物和人体肠道微生态平衡，对机体的健康十分有益，并有帮助消化，防止便秘，防止细胞老化，降低胆固醇，抗肿瘤以及调节人体生理机能等保健和医疗作用［１］。当前各国学者致力于将随机的经典式筛选转变为目标明确的理性筛选，创建新的筛选模型与方法［２］。本文设计了一种使用１０ｍＬＥｐ管培养菌液，用
ＣａＣＯ３中和酸法筛选产抑菌活性物质乳酸菌的新型
筛选方法。
１
材料与方法
１．１
样品来源
各地市售泡菜（包括四川、湖北、湖南、江苏、安
徽、福建、甘肃、河南、山东等地）
１．２供试指示菌
大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）；鼠伤寒沙门氏菌
（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｎｉｕｎｓ）；金黄色葡萄球菌
（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃｏｃｕｓａｕｒｅｕｓ）；枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｕｂｔｉｌｉｓ）；蜡状芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓ），以上菌株
均由湖北省生物农药工程研究中心提供。
１．３培养基［３，４］
乳酸菌分离培养基（ＢＣＰ培养基）；乳酸菌筛选
培养基（改良ＭＲＳ培养基）；乳酸菌发酵培养基（改良ＭＲＳ液体）；指示菌生长培养基（ＬＢ液体培养基）；抑菌实验培养基（ＬＢ培养基）。
１．４方法
１．４．１乳酸菌分离与鉴定
取各种液体样品（固体
样品需先剪碎、研磨处理），分别用无菌生理盐水作梯度稀释，选择适宜的稀释浓度梯度（１０４，１０５，１０６）用
Ｌ棒涂布ＢＣＰ平板，３０℃厌氧培养４８ｈ，挑取颜色
变黄特征性菌落，多次划线纯化后保存于ＭＲＳ斜
面试管，并做革兰氏染色镜检，符合乳酸菌形态特征的初步判定为乳酸菌菌株。
１．４．２乳酸菌发酵液制备在灭菌的１０ｍＬＥｐ管
一种产抑菌活性物质乳酸菌的快速筛选方法
张国强１，２，杨自文２，王开梅２
（１．西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西杨凌
７１２１００；２．湖北省生物农药工程研究中心，武汉４３００６４）
摘要：采用１０ｍＬＥｐ管培养菌液，用ＣａＣＯ３中和酸法筛选产抑菌活性物质乳酸菌的新方法，与传统方法相比具有工作量小，检测手段灵敏，筛选效率高等特点，特别适用于筛选微好氧菌及兼性厌氧菌。关键词：乳酸菌；快速筛选；抑菌活性物质；ＣａＣＯ３中和酸法中图分类号：Ｑ９３９．１１＋７；Ｑ９３．３１
文献标识码：Ｂ
ＡＭｅｔｈｏｄｆｏｒＲａｐｉｄＳｃｒｅｅｎｉｎｇｏｆＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓＰｒｏｄｕｃｉｎｇＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃＳｕｂｓｔａｎｃｅ
ＺＨＡＮＧＧｕｏ－ｑｉａｎｇ１，ＹＡＮＧＺｉ－ｗｅｎ２，ＷＡＮＧＫａｉ－ｍｅｉ２
（１．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＦｏｏｄＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＮｏｒｔｈｗｅｓｔＡ＆ＦＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙａｎｇｌｉｎｇ７１２１００，Ｓａｎｘｉ，Ｃｈｉｎａ；
２．ＨｕｂｅｉＢｉｏｐｅｓｔｉｃｉｄｅＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒ，Ｗｕｈａｎ４３００６４，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＡｎｅｗｍｅｔｈｏｄｆｏｒｒａｐｉｄｓｃｒｅｅｎｉｎｇｏｆＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｒｏｄｕｃｉｎｇａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓｕｂｓｔａｎｃｅ：ＣｕｌｔｕｒｉｎｇＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｂｙＥｐｔｕｂｅｓａｎｄｓｃｒｅｅｎｉｎｇＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｂｙＣａＣＯ３ｔｅｓｔｉｓｒｅｐｏｒｔｅｄｉｎｔｈｉｓｐａｐｅｒ．Ｔｈｉｓｋｉｎｄｏｆｍｅｔｈｏｄｉｓｍｏｒｅｃｏｎｖｅｎｉｅｎｃｅ，ｓｅｎｓｉｔｉｖｅａｎｄｅｆｆｅｃｔｉｖｅｔｈａｎｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌｍｅｔｈｏｄ．Ｉｔｉｓｓｕｉｔａｂｌｅｔｏｔｈｅｉｓｏｌａｔｉｏｎｏｆａｅｒｏｂｅａｎｄｆａｃｕｌｔａｔｉｖｅａｅｒｏｂｅ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ；ｒａｐｉｄｓｃｒｅｅｎｉｎｇ；ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓｕｂｓｔａｎｃｅ；ＣａＣＯ３ｔｅｓｔ
中加入含有１％ＣａＣＯ３的改良ＭＲＳ液体５ｍＬ，用接种环挑取选定的出发菌接种入Ｅｐ管，密封，３０℃摇床培养４８ｈ。
１．４．３指示菌菌悬液制备用接种环挑取活化的指示菌１环接种于１０ｍＬＬＢ液体培养基，３０℃摇床过夜培养。倾注培养法测其菌悬液浓度，用无菌生理盐水稀释成１０７个?ｍＬ－１菌悬液，冰箱保存待用［５］。
１．４．４筛选方法在乳酸菌发酵液中加入１％ＣａＣＯ３，３０℃摇床培养４８ｈ。采用牛津杯琼脂扩散法［６］做抑菌试验。将指示菌菌悬液在每个平皿中加入指示菌稀释液１ｍＬ，再将冷至４５℃的灭菌ＬＢ培养基每皿定量加入２０ｍＬ，摇匀，冷却制成含菌平板，在每个平板上均匀放置４个牛津杯。乳酸菌发酵液以１００００ｒ?ｍｉｎ－１离心１０ｍｉｎ，在平板牛津杯里定量加入１００μＬ不同乳酸菌菌株发酵离心上清液，标注菌株号，４℃冰箱放置４ｈ以上，然后３０℃培养箱中静置培养１６ｈ，观察抑菌情况，选取牛津杯周围有明显抑菌圈的菌株作复筛。
过氧化氢作用的排除［７］：挑取乳酸菌发酵产物排除酸后仍有抑菌效果的菌株，接种于５ｍＬＭＲＳ液体，３０℃摇床培养４８ｈ，１００００ｒ?ｍｉｎ－１离心１０ｍｉｎ后，８０℃水浴１０ｍｉｎ，用牛津杯法做对各种指示菌的抑菌试验。
１．４．５与传统筛选方法的比较传统筛选方法主要是初筛先将细菌进行ＭＲＳ液体发酵培养，然后将原始发酵液离心，取上清液活性检测，最后对活性较好的菌株进行复筛，包括排除酸的作用和过氧化氢的作用等。抑菌活性检测主要有点种法、滤纸片法、打孔法和牛津杯琼脂扩散法［６］。酸抑制作用的排除［７］：用乳酸和盐酸分别调蒸馏水、ＭＲＳ液体的ｐＨ值分别为３．０、４．０、４．５、５．０、６．０，用牛津杯法做对各种指示菌的抑菌试验，确定对照ｐＨ值。挑取发酵产物对５种指示菌都有抑菌作用的菌株，接种于５ｍＬＭＲＳ液体，３０℃摇床培养４８ｈ，１００００ｒ?ｍｉｎ－１离心１０ｍｉｎ后，测其ｐＨ值，并用１ｍｏｌ?Ｌ－１ＮａＯＨ和１ｍｏｌ?Ｌ－１ＨＣｌ将其离心发酵上清液调至对照ｐＨ值，用牛津杯法做对各种指示菌的抑菌试验。过氧化氢作用的排除方法同上。
２结果与分析
２．１出发菌的筛选结果
采用平板稀释法和厌氧培养技术，从泡菜中分离、纯化得到３９６株典型菌株，接入Ｅｐ管进行产抑菌活性物质乳酸菌的筛选，检出有抑菌活性的阳性菌株数２９９株，检出率高达７５．５１％。２．２有抑菌作用菌株的筛选结果
通过反复试验，在改良ＭＲＳ发酵液中加入１％ＣａＣＯ３，一方面可以很好的起到中和酸的作用，发酵液最终ｐＨ值在５．０以上，减轻了后期酸作用排除的工作量，另一方面为乳酸菌的良好生长创造了条件，可以维持发酵液ｐＨ值在５．０～６．４之间。采用ＣａＣＯ３中和酸法和牛津杯法抑菌试验，最终筛选出９株活性较好的乳酸菌，菌株编号分别为１７４、１７７、２４０、３１６、３２９、３３３、３７２、３８１和３８６。
ＣａＣＯ３中和酸法已很好排除酸的干扰，挑取对５种指示菌有较好抑菌效果的９株乳酸菌菌株进行过氧化氢作用的排除，结果表明，这９株乳酸菌菌株水浴后抑菌圈的变化很小或几乎没有变化。说明过氧化氢在乳酸菌的代谢产物中只占很少部分。过氧化氢对热不稳定，８０℃水浴１０ｍｉｎ可排除过氧化氢，如果是过氧化氢在起抑菌作用，那么水浴后过氧化氢消失，即没有了抑菌效果，如果还有抑菌效果说明不是过氧化氢的作用，可能是其他活性物质的作用。
２．３传统筛选方法的筛选结果
传统筛选方法主要有点种法，滤纸片法，打孔法和牛津杯法，经过比较最终决定采用牛津杯法。此法可精确掌握样品量，且操作方便，抑菌圈边缘整齐，结果易观察。选取抑菌圈明显的进行记录，结果如表１、表２。表１和表２表明，从泡菜水中可以筛选出抑菌活性物质乳酸菌，而且大量菌株有广谱抑菌作用，尤其是对蜡状芽孢杆菌有显著抑制作用。
用乳酸和盐酸分别调蒸馏水、ＭＲＳ液体培养基表１有抑菌作用的菌株的筛选结果
被抑制的指示菌
对５种指示菌有抑制作用
对４种指示菌有抑制作用
对３种指示菌有抑制作用
对２种指示菌有抑制作用
对１种指示菌有抑制作用
有抑菌作用的菌株数／株
４８
６１
５０
６７
７３
表２发酵上清液对指示菌有抑制作用的菌株
被抑制的指示菌
对大肠杆菌有抑制作用的菌株
对沙门氏菌有抑制作用的菌株
对枯草芽孢杆菌有抑制作用的菌株
对金黄色葡萄球菌有抑制作用的菌株
对蜡状芽孢杆菌有抑制作用的菌株
从平板中挑选出进行检测的菌株
有抑菌作用的
菌株数／株
１４２
１６３
１１０
１７９
２２６
３９６
检出率
％
３５．８６
４１．１６
２７．７８
４５．２０
５７．０７
－
７４２湖北农业科学２００７年
的不同ｐＨ值。用乳酸和盐酸调蒸馏水ｐＨ值为３．０～６．０时都没有抑菌效果；乳酸和盐酸调ＭＲＳ液体培养基ｐＨ值３．０时都有抑菌效果，ｐＨ值４．０时对大肠杆菌、沙门氏菌、蜡状芽孢杆菌都有抑菌效果，而对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌没有抑菌效果，ｐＨ值４．５以上时都没有抑菌效果，故选择ｐＨ值４．５作为酸排除的对照。
挑取对５种指示菌都有抑菌效果的４８株乳酸菌菌株进行酸作用的排除试验，调发酵上清液ｐＨ值为４．５，用牛津杯法进行抑菌试验。指示菌经过１６ｈ培养后观察，乳酸菌ｐＨ值４．５时对照孔周围没有出现抑菌圈，而挑取的４８株菌有１２株周围有较好的抑菌圈，对指示菌在一定程度上有抑制作用，测其发酵上清液ｐＨ值４．０左右，最低时ｐＨ值３．４５，最高时ｐＨ值４．６０，说明乳酸菌产酸能力很强，但排除酸作用后仍有抑菌活性物质存在。
排除酸干扰后，挑取对５种指示菌有较好抑菌效果的１２株乳酸菌菌株进行过氧化氢作用的排除，结果表明，１２株乳酸菌菌株中只有１株水浴后抑菌圈的变化较大，其余几乎都没有变化或变化很小。说明过氧化氢在乳酸菌的代谢产物中只占很少部分。排除过氧化氢作用后仍有１１株活性较好的菌株，编号分别为１１４、１４７、１７４、１７７、２４０、３１６、３２９、３３３、３７２、３８１和３８６。
２．４与传统筛选方法的比较
通过反复验证，新型筛选方法较传统筛选方法有许多优点，两种方法的比较结果如表３。
３小结与讨论
１）传统筛选方法通常是利用原始发酵液，经初筛确定有抑菌作用后再进行复筛，以排除酸的作用和过氧化氢等的作用。而新型筛选方法是在发酵液中加入１％ＣａＣＯ３，一步到位直接排除酸的作用，复筛时只需要排除过氧化氢的影响，简化了步骤，大大提高了筛选效率。
２）新型筛选方法筛选出对５种指示菌均有抑菌作用的菌株９株，而传统筛选方法初筛时确定的菌株４８株，复筛后确定的菌株１１株，包括利用新型筛选方法筛选出的９株。相差别的两株，经酸作用排除，调ｐＨ值５．０时对指示菌失去活性，分析原因可能是传统方法中酸作用排除时，选取ｐＨ值４．５作为对照值，而酸对活性物质起到促进作用或者说活性物质为酸依赖性物质［８］，影响了对抑菌作用的检测。因此选取酸的对照值应为ｐＨ值５．０以上，而ＣａＣＯ３中和酸法弥补了这一缺点，可以使发酵液最终ｐＨ值在５．０～６．４之间。
３）传统筛选方法较适用于好氧菌，而乳酸菌属于微好氧菌或兼性厌氧菌，并且乳酸菌在发酵过程中产生大量有机酸，在确定抑菌活性物质时，排除酸的作用是必要的又是繁重的工作。目前对这种目的菌株尚无方便有效的筛选方法。我们设计的ＥＰ管培养菌液，ＣａＣＯ３中和酸法筛选产抑菌活性物质乳酸菌的方法，操作简单快捷，工作效率高，具有广阔的应用前景。
参考文献：
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表３两种筛选方法的比较
项目
针对性
工作量
发酵液最终ｐＨ值检测灵敏度
筛选效率
新型筛选方法
除严格厌氧菌外都可
使用，尤其适用于兼
性厌氧菌与微好氧菌
一步到位，发酵过程
中主动排除酸的作用
５．０～６．４
灵敏度高
同样工作量，得９株目
标菌，剔除率高
传统筛选方法
较适合好氧菌
复筛时需要排除酸的
作用
３．４～４．６
灵敏度低
相同条件下，得４８株
目标菌，剔除率低
（责任编辑万景辉）张国强等：一种产抑菌活性物质乳酸菌的快速筛选方法
第５期７４３
乳酸菌的筛选
乳酸菌的筛选（初筛） 一、实验目的 对采集的仔猪粪便进行梯度稀释和平板涂布，对猪粪中的肠源菌进行初步的筛选。 二、实验材料 PBS、2mL离心管、MRS肉汤、琼脂、冰袋、保温盒、封口膜、200μL 枪头等。 三、实验步骤 1、实验前准备：用MRS肉汤配置MRS固体培养基（内含有1.5%琼脂，1%CaCO3），121℃灭菌15min后倒平板，备后面涂布使用，2mL 离心管中加入1mLPBS备后面实验使用。 2、采样：使用已灭菌的200μL枪头挑取仔猪猪粪适量，放入事先准备好的2mL加有PBS的离心管中，取样标准为每窝仔猪取5个样品，采完样品后，用封口膜将离心管口封住，并放入准备好的装有冰袋的保温盒中保存。 3、涂布：将采好的样品用螺旋振荡器混匀，取100μL样品混匀液，加入900mL的离心管中进行梯度稀释，取10- 4、10-5梯度菌液进行平板涂布。 4、培养：将涂布好的平板依次标好时间、稀释浓度和样品编号后，置于厌氧培养箱中37℃培养24h。 5、培养完成后，对所涂布的平板进行拍照留底。
乳酸菌的筛选 一、实验目的 利用平板划线的原理，对涂布出的单菌落进行划线纯化。 二、实验原理 平板划线法是指把杂菌样品通过在平板表面划线稀释而获得单菌落的方法。一般是将混杂在一起的不同种微生物或同种微生物群体中的不同细胞，通过在分区的平板表面上作多次划线稀释，形成较多的独立分布的单个细胞，经培养而繁殖成相互独立的多个单菌落。通常认为这种单菌落就是某微生物的“纯种”。实际上同种微生物数个细胞在一起通过繁殖也可形成一个单菌落，故在科学研究中，特别是在菌种鉴定等工作中，必须对实验菌种的单菌落进行多次划线分离，才可获得可靠的纯种。 四、实验步骤 1、MRS培养基的配置：用MRS肉汤按每升48g计算配置，向其中加入1.5%的比例加入琼脂，按1%的比例加入CaCO3后，121℃灭菌15min。 2、倒平板：培养皿灭菌，烘干后，取灭菌的MRS固体培养基倒平板（每个平板倒10mL左右），放入4℃冰箱备用。 3、划线：于超净工作台中，将涂布平板中的单菌落用接种环挑取，按图1中所示的方法与平板上划线。 4、将接种好的平板置于37℃厌氧培养箱中培养24h。 5、培养期间，注意观察菌的生长情况，培养结束后，拍照留底。
菌种筛选方法 (2)
菌种筛选方法 在实际工作中，为了提高筛选效率，往往将筛选工作分为初筛和复筛两步进行。初筛的目的是删去明确不符合要求的大部分菌株，把生产性状类似的菌株尽量保留下来，使优良菌种不致于漏网。因此，初筛工作以量为主，测定的精确性还在其次。初筛的手段应尽可能快速、简单。复筛的目的是确认符合生产要求的菌株，所以，复筛步骤以质为主，应精确测定每个菌株的生产指标,测得的数据要能够反映将来的生产水平。 1 从菌体形态变异分析有时，有些菌体的形态变异与产量的变异存在着一定的相关性，这就能很容易地将变异菌株筛选出来。尽管相当多的突变菌株并不存在这种相关性，但是在筛选工作中应尽可能捕捉、利用这些直接的形态特征性变化。当然，这种鉴别方法只能用于初筛。有人曾统计过3,484个产维生素B2的阿舒假囊酵母(Eremoth ecium ashbyii)的变异菌落，发现高产菌株的菌落形态有以下特点：菌落直径呈中等大小（8-10毫米），凡过大或过小者均为低产菌株；色泽深黄色，凡浅黄或白色者皆属低产菌株。又如，在灰黄霉素产生菌荨麻青霉(Penicillium urticae)的育种中，曾发现菌落的棕红色变深者往往产量有所提高，而在赤霉素生产菌藤仓赤霉（Gibberell a fujikuroi）中，却发现菌落的紫色加深者产量反而下降。 2 平皿快速检测法平皿快速检测法是利用菌体在特定固体培养基平板上的生理生化反应，将肉眼观察不到的产量性状转化成可见的
"形态"变化。具体的有纸片培养显色法、变色圈法、透明圈法、生长圈法和抑制圈法等，见图。这些方法较粗放，一般只能定性或半定量用，常只用于初筛，但它们可以大大提高筛选的效率。它的缺点是由于培养平皿上种种条件与摇瓶培养，尤其是发酵罐深层液体培养时的条件有很大的差别，有时会造成两者的结果不一致。图平皿快速检测法示意图平皿快速检测法操作时应将培养的菌体充分分散，形成单菌落，以避免多菌落混杂一起，引起"形态"大小测定的偏差。 1) 纸片培养显色法将饱浸含某种指示剂的固体培养基的滤纸片搁于培养皿中，用牛津杯架空，下放小团浸有3%甘油的脱脂棉以保湿，将待筛选的菌悬液稀释后接种到滤纸上，保温培养形成分散的单菌落，菌落周围将会产生对应的颜色变化。从指示剂变色圈与菌落直径之比可以了解菌株的相对产量性状。指示剂可以是酸碱指示剂也可以是能与特定产物反应产生颜色的化合物。 2) 变色圈法将指示剂直接掺入固体培养基中，进行待筛选菌悬液的单菌落培养，或喷洒在已培养成分散单菌落的固体培养基表面，在菌落周围形成变色圈。如在含淀粉的平皿中涂布一定浓度的产淀粉酶菌株的菌悬液，使其呈单菌落，然后喷上稀碘液，发生显色反应。变色圈越大，说明菌落产酶的能力越强。而从变色圈的颜色又可粗略判断水解产物的情况。 3) 透明圈法在固体培养基中渗入溶解性差、可被特定菌利用的营养成分，造成浑浊、不透明的培养基背景。将待筛选在菌落周围就
细胞筛选 个人整理
一嘌呤霉素 (一)确定最优筛选浓度 当用于筛选特定细胞的嘌呤霉素合适浓度未知时，需进行滴定，或制定针对那种细胞的嘌呤霉素杀菌曲线。 一般而言，嘌呤霉素浓度范围在2-10微克/毫升时是足以杀灭大多数未转染的哺乳动物细胞系。 1.培养待转染（而不是转染后）的细胞。（筛选的目的是杀灭未转染的细胞） 2.取对数生长期的细胞（一般在铺满培养器皿底部的70%~80%时），用新鲜无抗无血清的培养基制成 1.5×105个/ml的细胞悬液。 3.向96孔培养板中加细胞悬液，每孔100微升（使每孔细胞数在 1.5×104个），然后向每孔加新鲜无抗无血清的培养基适量，培养箱中静置培养过夜。（这样做是为了保证在固定细胞密度下确定最佳G418药物筛选浓度。） 4.第二天用嘌呤霉素浓度分别为0, 2, 4, 6, 8, 10微克/毫升的新鲜无抗无血清培养基溶液替换各孔中的旧的培养基。（每个浓度可用两个复孔，相当于每个浓度测定三次）。（注意： 对于多数细胞种类而言，过量的嘌呤霉素能引起许多非必需的表型的反应。） 5.每日检查细胞活力，根据细胞活力，每三天(即每隔两天)更换含嘌呤霉素的新鲜无抗无血清培养基溶液一次。如细胞生长过快，可以缩短换液时间（每隔一天）。 6.在正常的实验操作规程时，一种细胞最优筛选浓度的确立时间随细胞的生长率和一般生存时间而定，大概需3到14天。在所需时间之后，嘌呤霉素的导
致所有细胞死亡的最小浓度就是应该用于该细胞和该实验的浓度。最优浓度为在3-5天内杀死所有细胞的浓度。 (二)转染细胞 1.第一天： 在60mm培养皿内种植细胞，细胞密度为能使第二天细胞融合能达到70%-80%的密度，CO2孵箱过夜培养。 2.第二天： 准备3ml无抗生素无血清培养基，加入Polybrene使其终浓度为8μg/ml。将已经制备的病毒颗粒 0.5ml加至上述培养基，轻吹混匀。去除60mm培养皿内的旧的培养基，加入含病毒培养基。（Polybrene能够增加病毒感染的效率，然而，有时候Polybrene对细胞有毒性。这时，可以用ProtamineSulfate代替Polybrene） (三)筛选细胞 1.病毒感染后24小时，可以换用含最优浓度puromycin的培养基。 2.如果病毒对细胞有毒性，可以减少感染时间至4-6小时，然后换用新鲜培养基，24-48小时后换加含最优浓度puromycin的培养基。最好设立一个对照皿，不加病毒液，加入Ploybrene，观察Polybrene是否对细胞有毒性；如果Polybrene没有毒性，还可以加入puromycin，作为puromycin是否有效的对照。 3.以后每隔一天换用新鲜含puromycin的无抗生素无血清培养基，以替换含大量死细胞的培养基。直到抗性群落能被识别出（一般是在筛选后10到12天）。 4.待抗性细胞长满以后，细胞转入10cm培养皿，同时，留一部分细胞在原来的60mm平皿内。
乳酸菌菌种的分离筛选方法
乳酸菌菌种的分离筛选方法乳酸细菌是一类能利用发酵糖产生大量乳酸的细菌通称。为兼性厌氧菌，杆状或球状，革兰氏阳性菌，无芽孢，不运动。营养要求高，需要提供丰富的肽类氨基酸维生素。在琼脂表面或内层形成较小的白色或淡黄色的菌落。 通常用作为有益微生物的菌种有乳酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、乳酸片球菌、双歧杆菌、屎肠球菌、戊糖片球菌等。 乳杆菌常用MRS琼脂作半选择培养基。当乳杆菌仅是复杂区系中的部分菌类 时，SL培养基常用作为选择性培养基。对于芽孢乳杆菌常用GYP培养基，链球菌有TYC培养基、MS培养基。M17培养基被用作乳球菌的分离培养基。 嗜酸乳杆菌属于乳杆菌属的一个种。其特性为：杆菌，两端圆，不运动，无 鞭毛。粪肠球菌为革兰氏阳性，圆形或椭圆形。 乳酸片球菌细胞呈球状，直径0.6~1.0μm，在直角两个平面交替形成四联状，一般细胞成对生，单生者罕见，不成链状排列。革兰氏阳性，不运动，兼性厌氧。在MRS培养基上菌落小，呈白色。沿洋菜穿刺线的生长物呈丝状。 乳酸菌在一般琼脂培养基上形成微小菌落，不易观察，所以分离时先富集培养并选择合适的培养基。分离培养基一般添加西红柿、酵母膏、吐温-80等物质，也常常加入醋酸盐，因醋酸盐能抑制部分细菌生长，对乳酸菌无害。 培养基中添加碳酸钙，乳酸溶解培养基中的碳酸钙形成透明圈，作为分离鉴别的依据，通过对生成的乳酸量进行性能鉴定。 乳酸菌生长繁殖时需要多种氨基酸，维生素及微氧，一般菌落比较小。分离培养基一般可添加西红柿酵母膏油酸吐温等物质，均具有促进生长作用。也常常添加醋酸盐抑制有些细菌的生长，对乳酸菌无害。 一.筛选方法： 1.溶钙圈法： 利用一些产酸类细菌在含CaCO3的培养基上产生CaCO3溶解圈，从而筛选出这些产酸类细菌，可用于乳酸菌的筛选。 其中培养基中加入CaCO3的作用是：①鉴别能产生酸的细菌；②中和产生的酸，以维持培养基的PH。 筛选过程：样品预处理→梯度稀释至10-6→选择合适的稀释度涂布→37℃培养
大肠杆菌营养缺陷型菌株的诱变与筛选 山大微生物大实验
山东大学 实验名称：大肠杆菌营养缺陷型菌株 的诱变和筛选 作者：姚健(201000140136) 同组者：刘新强 指导老师：林建群(教授) 实验日期：2013年5月22日-6月1日
微生物大实验报告 大肠杆菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选 山东大学生命基地班姚健 201000140136 摘要：营养缺陷型菌株或称异养型（auxotroph）菌株是许多微生物生理生化以及遗传研究的重要菌株材料。此类菌株不仅在生物研究方面有着很重要的作用，而且在生物工程和生物技术上都有很重要的作用。营养缺陷型菌株的筛选也成为了微生物科学工作者必备的基本实验技能之一。实验采用物理诱变非电离辐射紫外线（15W）为诱变剂，来对大肠杆菌诱发突变，并用抗青霉素法淘汰野生型（富集营养缺陷型），采用点植对照法检出营养缺陷型，划线复证后得到两株营养缺陷型菌，进行生长谱法鉴定，两个平板都长满了菌落，即没有预期的营养缺陷型菌株出现。 Abstract:Auxotrophic bacterias are very important materials in the microbial biochemical and genetical research.Auxotrophic bacterias are important to not only bioresearch but also biotechnology.The screening of auxotrophic bacterias has become one of scientists’ primary experimental skills.We use the ultravioley light as the mutagen to induce the mutation of the E.coli,then weed out the wild type by Penicillin resistance method to gather auxotrophic bacterias,next we check out the auxotrophic bacterias by spot planting.We get two auxotrophic bacterias by marking out，finally we test the type of auxotroph by auxanography.Each bacteria grew well everywhere in the plate indicating that t here’s no auxotrophic bacteria. 关键词：大肠杆菌；营养缺陷型菌株；紫外线诱变；划线复证；生长谱测定；筛选 Key words:Escherichia;auxotrophic bacteria；ultravioley mutation;marking out;auxanography;screening 1引言 筛选营养缺陷型菌株一般具有四个环节：诱变处理、营养缺陷性的浓缩、检出、鉴定缺陷型。本实验选用紫外线为诱变剂来诱发突变，并用青霉素法淘汰野生型，逐个测定法检出缺陷型，最后经生长谱法鉴定细菌的营养缺陷型。 1.1 营养缺陷型 营养缺陷型是指野生型菌株由于某些物理因素或化学因素处理，使编码合成代谢途径中某些酶的基因突变，丧失了合成某些代谢产物(如氨基酸、维生素)的能力，必须在基本培养基中补充该种营养成分，才能正常生长的一类突变株[1]。这类菌株可以通过降低或消除末端产物浓度，在代谢控制中解除反馈抑制或阻遏，而使代谢途径中间产物或分支合成途径中末端产物积累。在氨基酸、核苷酸生产中已广泛使用营养缺陷型菌株；也可用于遗传学分析、微生物代谢途径的研究及细胞和分子水平基因重组研究中作为供体和受体细胞的遗传标记。因此，营养缺陷型在工业上有重要的应用价值。营养缺陷型是由野生型突变产生，营养缺陷型经回复突变恢复野生表型得到原养型。为了获得营养缺陷型菌株，需从诱变处理后的菌液中认真筛选，以便检出突变体，常用的方法有：影印接种法、夹层培养法和青霉素浓缩法等。 1.2 紫外线诱变 诱变育种是人为地采用物理、化学的因素，诱导有机体产生遗传变异，并经过人工选择、鉴定、培育新品种的方法。诱变育种的目标是改变或增加一个满意品种的某一特性，而在其他方面保持不变。诱变育种具有以下特点：1）提高突变率，扩大变异谱；2）适于进行个别性状的改良；3）育种程序简单，年限短；4）变异的方向和性质不定。 紫外线是一种短波光，波长介于100-400nm之间。它是一种非电离辐射诱变剂，照射物体时可使原
高效聚磷菌的筛选
磷矿废水中高效聚磷菌的筛选 近年来我国水体富营养化越来越严重，水体受到污染不仅破坏了环境与动植物的生存也影响了人们的生活和人们的工农业发展。而水体富营养化都与水中的磷含量剧增有关，所以除去水中的磷对治理水体富营养化特别重要，这也是个社会非常关注的问题。我校的南湖水体污染特别严重是我校的美中不足。 关键词：生物去磷聚磷菌筛选环境污染污水处理 目前城市污水处理主要使用生物除磷，它是利用聚磷菌一类的微生物从水中摄取磷，并将磷存于体内，在水低形成高磷的污泥，达到了去磷防水体富营养化的效果。聚磷菌是生物除磷的决定生物，而聚磷菌的工作受到环境的影响，如氧浓度，PH值，温度等，且不同的聚磷菌的聚磷能力不同，所以要想达到高去磷的效果就必须筛选出聚磷效率高的菌种 .实验材料与方法 1.1主要的的仪器设备 摇床，超净工作台，全自动高压灭菌锅，培养箱，电子天平，酸度计，离心机,可见分光光度计，培养皿20个，细菌过滤器，移液枪（100ul和1000ul），量筒（10ml和50ml各一个)，锥形瓶（150ml,250ml和500ml），草酸铵结晶紫，革兰氏碘液，95%的酒精，石碳酸复染红，显微镜，载玻片及盖玻片。 1.2主要的试剂 微生物分离纯化用的试剂均是国产分析纯，主要有牛肉膏，蛋白胨，琼脂，乙酸钠，磷酸氢二钾，硫酸镁，硫酸亚铁，氢氧化钠硫酸铵，钼酸钾，抗坏血酸，酒石酸锑钾，磷酸二氢钾，氢氧化钾过硫酸钾，MOPSHighPurityGrade,Tricine,X--Pi. 1.3样本采集 磷矿废水 1.4培养基及溶液 （1)YG培养液：酵母侵膏1g,葡萄糖1g，K2HPO4 0.3g KH2PO4 0.25g 七水硫酸镁0.2g, 蒸馏水1000ml. （2)MOPS培养基:100ml的10*MOPS 8.370g, tricine 0.717g, 30ml的去离子水，10mol/L KOH调PH到7.4. 总体积44ml. 0.01mol/L, 硫酸亚铁1ml，按下列加：氯化铵（1.9mol/L)5ml, 硫酸钾（0.276mol/L)1ml,二水氯化钙0.02mol/L)0.025ml, 六水氯化镁（2.5mol/L)0.21ml, NaCl(5mol/L)10ml, 微量元素混合液0.02ml, 葡萄糖0.1g, )取25ml置于两个500ml的三角瓶中，向一个三角瓶加0.0087gK2HPO4，成为限磷培养基。另一个加0.1732gK2HPO4成为过磷培养基。两瓶分别加离子水后用细菌过滤器过滤分别装于灭菌的150ml三角瓶中。 （3)LB培养基：酵母清膏5g蛋白胨10g，氯化钠5g，水1000ml，pH7.0~~~7.2 实验方法 1.聚磷菌的筛选： （1)聚磷菌的分离，纯化与保存。将水样充分摇匀后，用移液枪取0.5ml水样于4.5ml的无
耐盐乳酸菌的筛选和鉴定
耐盐乳酸菌的筛选和鉴定
摘要：本实验从酱油厂提供的酱油原醅中分离筛选出耐盐乳酸菌，该菌在18%以上NaCl 浓度的条件下能够正常生长代谢，初步鉴定其为四联球菌属，可用于高盐稀醪酱油酿造目前国内尚无耐盐度达18%的乳酸菌种, 该菌种的成功选育为国内首创。 关键词乳酸菌耐盐筛选鉴定 酱油采用高盐稀醪发酵工艺生产时能有更好的质量和香味。其工艺上需要在酱醅发酵过程中添加酵母菌和乳酸菌。然而酱油的含盐度高达18%，这就需要选育出耐盐菌种。关于耐盐酵母的应用报道已有很多。而乳酸菌方面，目前在国内菌种库内尚无耐盐度达18%的菌种。我们作为酱油大国，筛选出耐盐度达18%的嗜盐乳酸菌的意义则显得十分重大。 本实验主要对高盐稀态发酵工艺酱醅中嗜盐乳酸菌进行分离筛选及鉴定。 1 材料与方法 1.1 材料 酱醅、草酸铵结晶紫液（革兰氏A液）、路哥尔氏碘液（革兰氏B液）、蕃红花红（沙黄）、生理盐水。 1.2 实验方法 1.2.1 分离筛选流程(如图1)
1.2.2 筛选方法 十倍稀释法、平板涂布法、斜面之字划线法、平板四分法划线。1.2.3 鉴定方法 1.2.3.1 革兰氏染色法 1.2.3.2 过氧化氢酶接触酶测定 取一环琼脂斜面的培养物，涂于干净载玻片上，然后加1 滴3% -15% H2O2，若有气泡产生则为阳性反应，无气泡为阴性反应。或将3%-15% H2O2加到斜面的菌苔上观察是否有气泡的产生。 1.2.3.3 生化鉴定管使用方法 挑取待检菌革兰氏染色镜检，将新鲜菌苔接种于普通肉汤中，37摄氏度培养18-24h。各吸取0.05-0.08ml（约1-2滴）的肉汤培养物或菌悬液加入每种微量生化管内，将已接种生化管套上无菌塑料帽直立于三折吸塑短架内，于35-37摄氏度培养箱中培养。 1.2.3.4 高效液相色谱HPLC 测量乳酸含量(图2)
一种产抑菌活性物质乳酸菌的快速筛选方法
收稿日期：２００７－０６－３０ 基金项目：湖北省“十一五”重点科技攻关项目（２００６ＡＡ２０５Ａ０１）；湖北省农业科技创新中心资助项目（２００７－６２０－００１－０３）作者简介：张国强（１９８２－），男，山东潍坊人，２００５级硕士研究生，（电话）１３７９７０７９４９５（电子信箱）ｇｕｏｑｉａｎｇ＿ｆｓｅ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ； 通讯作者，杨自文，研究员，博士，（电话）０２７－８７３８９７３２（电子信箱）ｚｗｙａｎｇ＠ｐｕｂｌｉｃ．ｗｈ．ｈｂ．ｃｎ。 文章编号：０４３９－８１１４（２００７）０５－０７４１－０３ 第４６卷第５期２００７年９月 湖北农业科学 ＨｕｂｅｉＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ Ｖｏｌ．４６Ｎｏ．５Ｓｅｐ．，２００７ 泡菜发酵是一种具有２０００多年历史的乳酸发酵工艺。泡菜发酵主要是乳酸发酵，发酵过程中会产生大量有机酸，细菌素，益生菌等，可以调节动物和人体肠道微生态平衡，对机体的健康十分有益，并有帮助消化，防止便秘，防止细胞老化，降低胆固醇，抗肿瘤以及调节人体生理机能等保健和医疗作用［１］。当前各国学者致力于将随机的经典式筛选转变为目标明确的理性筛选，创建新的筛选模型与方法［２］。本文设计了一种使用１０ｍＬＥｐ管培养菌液，用 ＣａＣＯ３中和酸法筛选产抑菌活性物质乳酸菌的新型 筛选方法。 １ 材料与方法 １．１ 样品来源 各地市售泡菜（包括四川、湖北、湖南、江苏、安 徽、福建、甘肃、河南、山东等地） １．２供试指示菌 大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）；鼠伤寒沙门氏菌 （Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｎｉｕｎｓ）；金黄色葡萄球菌 （Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃｏｃｕｓａｕｒｅｕｓ）；枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）；蜡状芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓ），以上菌株 均由湖北省生物农药工程研究中心提供。 １．３培养基［３，４］ 乳酸菌分离培养基（ＢＣＰ培养基）；乳酸菌筛选 培养基（改良ＭＲＳ培养基）；乳酸菌发酵培养基（改良ＭＲＳ液体）；指示菌生长培养基（ＬＢ液体培养基）；抑菌实验培养基（ＬＢ培养基）。 １．４方法 １．４．１乳酸菌分离与鉴定 取各种液体样品（固体 样品需先剪碎、研磨处理），分别用无菌生理盐水作梯度稀释，选择适宜的稀释浓度梯度（１０４，１０５，１０６）用 Ｌ棒涂布ＢＣＰ平板，３０℃厌氧培养４８ｈ，挑取颜色 变黄特征性菌落，多次划线纯化后保存于ＭＲＳ斜 面试管，并做革兰氏染色镜检，符合乳酸菌形态特征的初步判定为乳酸菌菌株。 １．４．２乳酸菌发酵液制备在灭菌的１０ｍＬＥｐ管 一种产抑菌活性物质乳酸菌的快速筛选方法 张国强１，２，杨自文２，王开梅２ （１．西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西杨凌 ７１２１００；２．湖北省生物农药工程研究中心，武汉４３００６４） 摘要：采用１０ｍＬＥｐ管培养菌液，用ＣａＣＯ３中和酸法筛选产抑菌活性物质乳酸菌的新方法，与传统方法相比具有工作量小，检测手段灵敏，筛选效率高等特点，特别适用于筛选微好氧菌及兼性厌氧菌。关键词：乳酸菌；快速筛选；抑菌活性物质；ＣａＣＯ３中和酸法中图分类号：Ｑ９３９．１１＋７；Ｑ９３．３１ 文献标识码：Ｂ ＡＭｅｔｈｏｄｆｏｒＲａｐｉｄＳｃｒｅｅｎｉｎｇｏｆＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓＰｒｏｄｕｃｉｎｇＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃＳｕｂｓｔａｎｃｅ ＺＨＡＮＧＧｕｏ－ｑｉａｎｇ１，ＹＡＮＧＺｉ－ｗｅｎ２，ＷＡＮＧＫａｉ－ｍｅｉ２ （１．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＦｏｏｄＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＮｏｒｔｈｗｅｓｔＡ＆ＦＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙａｎｇｌｉｎｇ７１２１００，Ｓａｎｘｉ，Ｃｈｉｎａ； ２．ＨｕｂｅｉＢｉｏｐｅｓｔｉｃｉｄｅＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒ，Ｗｕｈａｎ４３００６４，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＡｎｅｗｍｅｔｈｏｄｆｏｒｒａｐｉｄｓｃｒｅｅｎｉｎｇｏｆＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｒｏｄｕｃｉｎｇａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓｕｂｓｔａｎｃｅ：ＣｕｌｔｕｒｉｎｇＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｂｙＥｐｔｕｂｅｓａｎｄｓｃｒｅｅｎｉｎｇＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｂｙＣａＣＯ３ｔｅｓｔｉｓｒｅｐｏｒｔｅｄｉｎｔｈｉｓｐａｐｅｒ．Ｔｈｉｓｋｉｎｄｏｆｍｅｔｈｏｄｉｓｍｏｒｅｃｏｎｖｅｎｉｅｎｃｅ，ｓｅｎｓｉｔｉｖｅａｎｄｅｆｆｅｃｔｉｖｅｔｈａｎｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌｍｅｔｈｏｄ．Ｉｔｉｓｓｕｉｔａｂｌｅｔｏｔｈｅｉｓｏｌａｔｉｏｎｏｆａｅｒｏｂｅａｎｄｆａｃｕｌｔａｔｉｖｅａｅｒｏｂｅ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ；ｒａｐｉｄｓｃｒｅｅｎｉｎｇ；ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓｕｂｓｔａｎｃｅ；ＣａＣＯ３ｔｅｓｔ
营养缺陷型菌株的筛选
营养缺陷型菌株的筛选 采用辐射，化学试剂等因素处理细菌，以提高其变异几率，关键步骤是进行营养缺陷型微生物的筛选工作，营养缺陷型是指通过诱变产生的，由于发生了丧失某酶合成能力的突变，因而只能在加有该酶合成产物的培养基中才能生长的突变株。营养缺陷型的筛选与鉴定涉及下列几种培养基：基本培养基（MM，符号为[-]）是指仅能满足某微生物的野生型菌株生长所需的最低成分的合成培养基。完全培养基(CM，符号为[+])是指可满足某种微生物的一切营养缺陷型菌株的营养需要的天然或半合成培养基。补充培养基（SM，符号为[A]或[B]等）是指在基本培养基中添加某种营养物质以满足该营养物质缺陷型菌株生长需求的合成或半合成培养基。 营养缺陷型菌株不仅在生产中可直接作发酵生产核苷酸、氨基酸等中间产物的生产菌，而且在科学实验中也是研究代谢途径的好材料和研究杂交、转化、转导、原生质融合等遗传规律必不可少的遗传标记菌种。 营养缺陷型的筛选一般要经过诱变、淘汰野生型、检出和鉴定营养缺陷型四个环节。现分述如下： 第一步，诱变剂处理：与上述一般诱变处理相同。
第二步，淘汰野生型：在诱变后的存活个体中，营养缺陷型的比例一般较低。通过以下的抗生素法或菌丝过滤法就可淘汰为数众多的野生型菌株即浓缩了营养缺陷型。 抗生素法有青霉素法和制霉菌素法等数种。青霉素法适用于细菌，青霉素能抑制细菌细胞壁的生物合成，杀死正在繁殖的野生型细菌，但无法杀死正处于休止状态的营养缺陷型细菌。制霉菌素法则适合于真菌，制霉菌素可与真菌细胞膜上的甾醇作用，从而引起膜的损伤，也是只能杀死生长繁殖着的酵母菌或霉菌。在基本培养基中加入抗生素，野生型生长被杀死，营养缺陷型不能在基本培养基中生长而被保留下来。 菌丝过滤法适用于进行丝状生长的真菌和放线菌。其原理是：在基本培养基中，野生型菌株的孢子能发芽成菌丝，而营养缺陷型的孢子则不能。通过过滤就可除去大部分野生型，保留下营养缺陷型。 第三步，检出缺陷型：具体方法很多。用一个培养皿即可检出的，有夹层培养法和限量补充培养法；在不同培养皿上分别进行对照和检出的，有逐个检出法和影印接种法。可根据实验要求和实验室具体条件加以选用。现分别介绍如下：
金龟子绿僵菌选择性培养基的筛选
金龟子绿僵菌选择性培养基的筛选 作者：程子路， 詹儒林， 许天委， 宋妍， 郭立佳， 张世清， 黄俊生 作者单位：程子路,许天委,宋妍,郭立佳,张世清,黄俊生(中国热带农业科学院环境与植物保护研究所,海南儋州,571737)， 詹儒林(中国热带农业科学院环境与植物保护研究所,海南儋州 ,571737;中国热带农业科学院南亚热带作物研究所,广东湛江,524091) 刊名： 江苏农业科学 英文刊名：JIANGSU AGRICULTURAL SCIENCES 年，卷(期)：2007(5) 被引用次数：2次 参考文献(13条) 1.李增智.程双龙.鲁绪祥绿僵菌、黄僵菌对松毛虫的室内杀虫及固体生产试验初报[期刊论文]-安徽农学院学报1985(02) 2.宋漳.景云.蔡和谦应用绿僵菌防治马尾松毛虫初探 1997(02) 3.江英成绿僵菌和白僵菌侵染马尾松毛虫试验比较[期刊论文]-浙江林学院学报 2000(04) 4.Weiner J E B M.Kennedy C Growth and variability in crowded and uncrowded populations of dwarf marigold(tagetes patula) 1990 5.张思玉桫椤群落内主要乔木种群的种间联接性[期刊论文]-应用与环境生物学报 2001(04) 6.张思玉.郑世群永定桫椤群落的结构特征[期刊论文]-植物资源与环境学报 2001(03) 7.尚进.李旭光.石胜友重庆涪陵磨盘沟桫椤种群结构与分布?格局研究[期刊论文]-西南农业大学学报(自然科学版) 2003(03) 8.张跃西.钟章成亚热带次生常绿阔叶林乔木优势种邻体干扰竞争模型的研究 1997 9.张跃西.钟章成亚热带次生常绿阔叶林优势种间的竞争效应与竞争反应[期刊论文]-应用与环境生物学报 2003(04) 10.史红霞.胡明龙球孢白僵菌选择性培养基的筛选和检测应用[期刊论文]-浙江林学院学报 2002(02) 11.王滨.樊美珍球孢白僵菌选择性培养基的筛选[期刊论文]-安徽农业大学学报 2000(01) 12.Veen K H.Ferron P A selective medium for the isolation of Beauveria tenella and of Metarhizium anisopliae 1966 13.樊美珍.李增智绿僵菌在土壤中的延续及控制桃小食心虫的潜力 1996(01) 引证文献(2条) 1.孔琼.袁盛勇.郭亚力.张宏瑞.田学军.李河球孢白僵菌MZ041016菌株及其与化学农药混配对禾谷缢管蚜的毒力测定[期刊论文]-江苏农业科学 2008(4) 2.程辉彩.敦冬梅.张丽萍.张根伟.董超.崔冠慧高毒力杀蝗绿僵菌的紫外线诱变选育[期刊论文]-江苏农业科学2008(3) 本文链接：https://www.360docs.net/doc/0015303431.html,/Periodical_jsnykx200705025.aspx
雏鸡肠粘膜乳酸菌的筛选及其应用.
雏鸡肠粘膜乳酸菌的筛选及其应用 本研究的目的是分离筛选出专门适用于雏鸡生产、具有抗逆性和抑菌特性的乳酸菌,同时探讨该乳酸菌对雏鸡生长性能、盲肠菌群和免疫功能的影响以及人工感染大肠杆菌情况下对雏鸡的保护力,为乳酸菌在雏鸡生产中的应用提供理论依据。由21日龄雏鸡盲肠粘膜上分离筛选得到20株乳酸菌,应用体外法筛选出在pH3.0处理2h后存活率达60%以上,对0.1%-0.3%胆盐有良好耐受性的6株菌。6株菌对大肠杆菌和沙门氏菌均有良好抑制作用,其中以菌株R5、R9、R19抑菌性能最好。传统的碳水化合物发酵方法鉴定这3株菌分别属于嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、卷曲乳杆菌。通过测定3株乳酸菌的生长曲线、发酵液pH值的变化和稳定期各时间点抑菌圈直径,结果表明:R5菌株生长性能和产酸性能优于其他两株菌,最佳发酵时间为培养18h。最终选定R5菌株用作雏鸡生产的益生素菌种。R5菌株pH3.0接种2小时后存活率为68.15%,0.3%胆盐接种2小时后存活率为42.06%,对大肠杆菌和沙门氏菌的抑菌直径分别为21.17mm和 23.2mm。选用120只体重相近1日龄健康的AA肉仔鸡,分成4组,即对照组、抗生素组、商业菌组和试验菌组,每组3个重复,每个重复10只鸡,公母各半。试验期21天。对照组饲喂基础日粮,饮用清水;抗生素组饲喂基础日粮+20mg/kg 土霉素,饮用清水;商业菌组饲喂基础日粮,饮用清水+商业乳酸菌菌液(10~8个活菌/只·日);试验菌组饲喂基础日粮,饮用清水+试验乳酸菌菌液(10~8个活菌/只·日)。试验测定乳酸菌对雏鸡生长性能、盲肠菌群及免疫功能的影响。试验结果表明:整个试验期,对照组、抗生素组、商业菌组和试验菌组肉仔鸡平均日增重分别为27.60g、29.22g、28.71g和29.61g,试验菌组显著高于对照组(p ＜0.05);各组料重比分别为1.55、1.46、1.47和1.48,商业菌组显著低于对照组(p＜0.05)但与试验菌组无显著差异;试验菌组与抗生素组各周龄雏鸡采食量、日增重和料重比无显著差异(p＞0.05);饲喂试验菌、商业菌和土霉素均能不同程度地降低雏鸡的死淘率和腹泻率;21日龄时,试验菌组较对照组盲肠中乳酸菌数量明显增加(p＜0.05),大肠杆菌的数量显著降低(p＜0.05);与对照组和抗生素组相比,饲喂试验菌和商业菌能显著提高雏鸡胸腺指数(p＜0.05);脾脏指数,试验菌组显著高于对照组(p＜0.05),其它各组间差异不显著;试验菌组血清IgA显著高于对照组(p＜0.05),试验菌组、商业菌组和抗生素组血清IgG均显著高于对照组(p＜0.05)。选用60只1日龄健康的AA肉仔鸡,分成3组,即对照组、抗生素组和试验菌组。对照组饲喂基础日粮,饮用清水;抗生素组饲喂基础日粮+0.02%土霉素,饮用清水;试验菌组饲喂基础日粮,饮用清水+乳酸菌液(10~8个活菌/只·日)。试验第15天对所有鸡进行致病性大肠杆菌攻毒试验,每只鸡灌服1ml大肠杆菌菌液(10~9CFU/ml)连续观察一周。结果表明,攻毒后一周对照组、抗生素组和试验菌组死亡率分别为20%、5%和0%。攻毒前(14日龄)试验菌组体重较对照组提高了3.96%,攻毒后一周(21日龄)试验菌组体重较对照组提高了9.13%;料重比方面,抗生素组和试验菌组较对照组分别降低了8.95%和 7.89%。 【相似文献】 【关键词相关文档搜索】：动物营养与饲料科学; 【作者相关信息搜索】：东北农业大学;动物营养与饲料科学;许丽;王晶;
双歧杆菌与乳酸菌筛选培养基
BBL培养基 双歧杆菌选择性培养基成份 蛋白胨15.0g 酵母粉2.0g 葡萄糖20.0g 可溶性淀粉0.5g 氯化钠5.0g 5%半胱氨酸10.0mL 西红柿浸出液400.0mL 吐温80 1.0mL 肝提取液80.0mL 琼脂20.0g 蒸馏水520.0mL pH7.0 MRS培养基 乳酸细菌培养基（MRS） 蛋白胨10.0 g 牛肉膏10.0 g 酵母膏 5.0 g 柠檬酸氢二铵[（NH4）2HC6H5O7] 2.0 g 葡萄糖(C6H12O6·H2O) 20.0 g 吐温80 1.0 mL 乙酸钠（CH3COONa·3H2O） 5.0 g 磷酸氢二钾（K2HPO4·3H2O） 2.0 g 硫酸镁（MgSO4·7H2O）0.58 g 硫酸锰（MnSO4·H2O）0.25 g 琼脂18.0 g 蒸馏水 1 000 mL pH 6.2~6.6 当乳酸菌生长代谢出乳酸后，会使pH下降而使颜色由绿变为黄绿，也由于pH 值降低再加上抗生素及厌氧培养的作用，所以一般的微生物不容易在此培养基上生长，因此十分容易鉴别乳酸菌。 2005-03-10 08:08 消息引用收藏分享 奉上一篇实验，以供参考！ 厌氧菌的分离和培养 目前培养厌氧微生物的简便而又有效的技术包括有：厌氧箱培养技术；厌氧罐培养技术；厌氧袋培养技术；亨盖特厌氧滚管技术。这里介绍的是亨盖特厌氧滚管技术。
亨盖特厌氧滚管技术是美国微生物学家亨盖特（Hungate）于1950年首次提出并应用于瘤胃厌氧微生物研究的一种厌氧培养技术。以后这项技术又经历了几十年的不断改进，从而使亨盖特厌氧技术日趣完善，并逐渐发展成为研究厌氧微生物的一整套完整技术。而且多年来的实践已经证明它是研究严格、专性厌氧菌的一种极为有效的技术。 亨盖特厌样滚管培养技术不仅可用于有益厌氧菌如双歧杆菌等的分离、与活菌培养计数，还可以用于有害***菌（如酪酸菌）或病原菌（如肉毒梭状芽孢杆菌）的分离与鉴定。 1材料 1.1 样品 双歧酸奶（液体）、双歧杆菌制剂（固体）。 1.2 培养基 改良MRS培养基，PTYG培养基。 1.3 仪器和器具 亨盖特厌氧滚管装置一套，厌氧管，厌氧瓶，滚管机，定量加样器。 2 流程 铜柱除氧→预还原培养基→稀释用液制备→稀释样品→滚管→培养→计数 3方法 3.1铜柱系统除氧 铜柱是一个内部装有铜丝或铜屑的硬质玻璃管。此管的大小为40—400mm，两段被加工成漏斗装，外壁绕有加热带，并与变压器相连来控制电压和稳定铜柱的温度。铜柱两端连接胶管，一端连接气钢瓶，一端连接出气管口。由于从气钢瓶出来的气体如N2、CO2和H2等通常都含有O2，故当这些气体通过温度约360℃的铜柱时，铜和气体中的微量O2化合生成CuO，铜柱则由明亮的黄色变为黑色。当向氧化状的铜柱通入H2时，H2与CuO中的氧就结合形成H2O，而CuO又被还原成了铜，铜柱则又呈现明亮的黄色。此铜柱可以反复使用，并不断起到除氧的目的。当然H2源也可以由氢气发生器产生。 3.2 预还原培养基及稀释液的制备
细胞筛选个人整理
细胞筛选 一嘌呤霉素 (一)确定最优筛选浓度 当用于筛选特定细胞的嘌呤霉素合适浓度未知时，需进行滴定，或制定针对那种细胞的嘌呤霉素杀菌曲线。一般而言，嘌呤霉素浓度范围在2-10微克/毫升时是足以杀灭大多数未转染的哺乳动物细胞系。 1.培养待转染（而不是转染后）的细胞。（筛选的目的是杀灭未转染的细胞） 2.取对数生长期的细胞（一般在铺满培养器皿底部的70%~80%时），用新鲜无抗无血 清的培养基制成1.5×105个/ml的细胞悬液。 3.向96孔培养板中加细胞悬液，每孔100微升（使每孔细胞数在1.5×104个），然后 向每孔加新鲜无抗无血清的培养基适量，培养箱中静置培养过夜。（这样做是为了保证在固定细胞密度下确定最佳G418药物筛选浓度。） 4.第二天用嘌呤霉素浓度分别为0,2,4,6,8,10微克/毫升的新鲜无抗无血清培养基 溶液替换各孔中的旧的培养基。（每个浓度可用两个复孔，相当于每个浓度测定三次）。（注意：对于多数细胞种类而言，过量的嘌呤霉素能引起许多非必需的表型的反应。） 5.每日检查细胞活力，根据细胞活力，每三天(即每隔两天)更换含嘌呤霉素的新鲜无 抗无血清培养基溶液一次。如细胞生长过快，可以缩短换液时间（每隔一天）。 6.在正常的实验操作规程时，一种细胞最优筛选浓度的确立时间随细胞的生长率和一
般生存时间而定，大概需3到14天。在所需时间之后，嘌呤霉素的导致所有细胞 死亡的最小浓度就是应该用于该细胞和该实验的浓度。最优浓度为在3-5天内杀死 所有细胞的浓度。 (二)转染细胞 1.第一天：在60mm培养皿内种植细胞，细胞密度为能使第二天细胞融合能达到 70%-80%的密度，CO2孵箱过夜培养。 2.第二天：准备3ml无抗生素无血清培养基，加入Polybrene使其终浓度为8μg/ml。 将已经制备的病毒颗粒0.5ml加至上述培养基，轻吹混匀。去除60mm培养皿内的 旧的培养基，加入含病毒培养基。（Polybrene能够增加病毒感染的效率，然而， 有时候Polybrene对细胞有毒性。这时，可以用ProtamineSulfate代替Polybrene） (三)筛选细胞 1.病毒感染后24小时，可以换用含最优浓度puromycin的培养基。 2.如果病毒对细胞有毒性，可以减少感染时间至4-6小时，然后换用新鲜培养基， 24-48小时后换加含最优浓度puromycin的培养基。最好设立一个对照皿，不加病 毒液，加入Ploybrene，观察Polybrene是否对细胞有毒性；如果Polybrene没有 毒性，还可以加入puromycin，作为puromycin是否有效的对照。 3.以后每隔一天换用新鲜含puromycin的无抗生素无血清培养基，以替换含大量死细 胞的培养基。直到抗性群落能被识别出（一般是在筛选后10到12天）。 4.待抗性细胞长满以后，细胞转入10cm培养皿，同时，留一部分细胞在原来的60mm 平皿内。
菌种筛选方法
常用的菌种的筛选方法如下： （1）施加选择性压力分离法 主要是利用不同种类的微生物其生长繁殖对环境和营养的要求不同，如温度、pH、渗透压、氧气、碳源、氮源等，人为控制这些条件，使之利于某类或某种微生物生长，而不利于其他种类微生物的生存，以达到使目的菌种占优势。而得以快速分离纯化的目的。如可以控制培养时的氧，可将好氧微生物和厌氧微生物分开；通过控制温度，可将嗜热微生物和非嗜热微生物分开；控制pH，可将嗜酸、嗜碱微生物分离等。在分离培养基中也可以加入不同的抗生素或试剂来增加选择性。如在分离放线菌和细菌时，可加入抗真菌抗生素；分离真菌时，可加入抗细菌药物。 （2）随机分离方法 有些微生物的产物对筛选没有直接的选择性指示作用，因此常采用随机分离方法分离。 A、抗生素产生菌的分离抗生素产生菌的分离常用抑菌圈法。实验必须用工具菌：采用抗生素的敏感菌，传统上常用金黄色葡萄球菌和枯草杆菌。 B、抗肿瘤药物产生菌的分离抗肿瘤药物产生菌的分离常用方法：生化诱导法、SOS生色检测法、DNA修复能力突变株。原理是利用DNA的损伤，微生物发生突变。B1、生化诱导法：将大肠杆菌的lacZ基因连接在λ噬菌体的PL启动子下，当DNA损伤时，诱发λ阻遏物CI分解，PL启动子启动lacZ基因转录，测定表达的?-半乳糖苷酶活性，来检测药物的存在。B2、SOS生色检测法：利用当DNA损伤时，可活化yecA蛋白，进而分解噬菌体的阻遏蛋白，再引起sifA基因启动lacZ基因转录，测定表达的?-半乳糖苷酶活性，来检测药物的存在。 C、生长因子产生菌的分离以氨基酸产生菌为例，介绍筛选方法。首先将待试菌接入加了抗真菌的化合物（如亚胺环己酮）的分离培养基中生长，然后采用影印法，将菌落复印到能支持氨基酸产生菌生长的培养基中，培养2-3天后，用紫外线杀司长好的菌落，再往此平板上面铺一层相应营养缺陷型菌株菌悬液，培养16小时后，被杀死的氨基酸产生菌的菌落周围应有一检测菌的生长圈。 （3）目的微生物分离 A、根据形态筛选突变株 B、根据平板菌落生化反应筛选变株透明圈法、呈色圈法、抑菌圈法、浑浊圈法等。①透明圈法：在平板培养基中加入溶解性较差的底物，使培养基混浊。能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明圈，圈的大小初步反应该菌株利用底物的能力。该法在分离水解酶产生菌时采用较多，如脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、核酸酶产生菌都会在含有底物的选择性培养基平板上形成肉眼可见的透明圈。在分离某种产生有机酸的菌株时，也通常采用透明圈法进行初筛。在选择性培养
乳酸菌菌种的分离筛选办法
精心整理 乳酸菌菌种的分离筛选方法 乳酸细菌是一类能利用发酵糖产生大量乳酸的细菌通称。为兼性厌氧菌，杆状或球状，革兰氏阳性菌，无芽孢，不运动。营养要求高，需要提供丰富的肽类氨基酸维生素。在琼脂表面或内层形成较小的白色或淡黄色的菌落。 通常用作为有益微生物的菌种有乳酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、乳酸片球菌、双歧杆菌、屎肠球菌、戊糖片球菌等。 时，SL 培养基、MS 对乳酸菌无害。一.筛选方法： 1.溶钙圈法： 利用一些产酸类细菌在含CaCO3的培养基上产生CaCO3溶解圈，从而筛选出这些产酸类细菌，可用于乳酸菌的筛选。 其中培养基中加入CaCO3的作用是：①鉴别能产生酸的细菌；②中和产生的酸，以维持培养基的PH 。 筛选过程：样品预处理→梯度稀释至10-6→选择合适的稀释度涂布→37℃培养48h →挑选产生溶
钙圈的菌落反复在MRS培养基上划线→挑起单菌落染色，经镜检确认为纯种→挑选革兰氏阳性单菌落→试管穿刺4℃冰箱保存。 2.溴甲酚绿指示剂法： 培养基：MRS培养基（含溴甲酚绿酒精溶液） 筛选过程：同上，不同之处是稀释涂布后长出菌落，挑取使溴甲酚绿变色的菌落。 二.菌种的分离筛选 1.培养基： ★1.1麦芽汁碳酸钙培养基：麦芽汁（10BX）1L预先灭菌碳酸钙5-10g/LPH自然（分离用） ★★1.2吐温 ★1.3 酵母膏（分离用） 1.4 1.5 MgSO 4 1.6 ★★1.7 蛋白胨 葡萄糖、琼 脂18.0g 酸钙, 1.8BCP 乳糖5.0g蛋白胨5.0g酵母膏3.0g0.5℅溴甲酚紫10ml自来水1000ml pH6.5-7.0（分离用） 1.9BCG牛乳营养琼脂：脱脂奶粉10g，溶于50ml水中，加入1.6℅溴甲酚绿酒 精溶液0.07ml，0.075Mpa20min。另取琼脂2.0g，溶于50ml水中，加酵母膏 1.0g溶解后调pH6.5-6.8，0.1Mpa20min.趁热在无菌操作下两者混合均匀， 倒平板，37℃培养24h，检查是否有杂菌。