微生物实验指导书

实验一普通光学显微镜的使用及其对微生物一般形态的观察

一、实验目的

1．了解普通光学显微镜的构造及其各部分的作用。

2．掌握普通光学显微镜的正确使用和维护方法。

3．通过低倍镜、高倍镜观察藻类、酵母培养液和新鲜活性污泥中微生物的一般形态。

二、实验原理

普通光学显微镜由机械部分和光学部分组成。

图1-1 双目生物显微镜

1．机械部分：

（1）镜筒：位于镜臂上端的空心圆筒，是光线的通道。镜筒的上端可插入目镜，下面与转换器相连。

（2）转换器：位于镜筒下端，是一个可以旋转的圆盘。有3~4个孔，用于安装不同放大倍数的物镜。

（3）载物台：载物台是放置标本的方块平台，中央有透光孔，载物台上面有玻片夹持器，侧面有移动手轮，可纵向和横向移动标本。

（4）调焦手轮：包括粗调手轮和微调手轮，可使载物台上下升降，调节物镜和标本之间的距离。

2．光学部分：

（1）目镜：放在镜筒上，配有10倍（10×）、16倍（16×）两种。

（2）物镜：装在转换器的孔上，有低倍镜（4、10）、高倍镜（40）和油镜（100），是显微镜中最主要的部分。各种镜头上都刻有放大倍数和数值孔径（A

N ）及所要求盖玻片厚度等主要参数。物镜的性能由数值孔径决定，并且还依赖于物镜的分辨率。

（3）聚光器：由聚光镜和孔径光阑组成。聚光镜的作用是把光线聚集在标本上，增强照明度。孔径光阑是用来调节对比度的，使物镜和聚光器的数值孔径相符合。当孔径光阑开启到物镜出瞳的70~80%时，就可以得到足够对比度的良好图象。如果开得太大，超过物镜的数值孔径，就会产生光斑；如果开得太小，则分辨率下降，降低物像的清晰度。

（4）电光源：在显微镜的下部，提供观察标本时所用光源。

三、实验器材

1．普通光学显微镜（双目生物显微镜）

2．载玻片、盖玻片若干

3．玻璃棒、滴管

4．滤纸、擦镜纸

5．藻类、酵母培养液，新鲜活性污泥

四、实验方法

１．低倍镜的操作

（１）首先把目镜放入镜筒上，将物镜（4、10、40、100）旋紧在转换器上。

（2）标本放在载物台上，用玻片夹持器挟紧。并用移动手轮移动所要观察的目的物到圆孔的正中央。

（３）打开电源开关，调整聚光器，使光路对准载物台中央的光孔，光亮度要适宜。

（４）旋动转换器，将10倍物镜对准光孔。

（5）用粗调焦手轮使物镜与标本距离至最小，同时要侧脸观察，以免压坏标本玻片或损坏物镜。

（6）调节瞳距。

（7）眼睛接近目镜观察，左（右）手用移动手轮轻轻移动玻片夹持器，右（左）手用粗调焦手轮将载物台下移（向内旋转调焦手轮），如果见到目的物，但不是十分清楚，再用细调焦手轮调节，至目的物清晰为止。

（8）如果粗调焦手轮旋得太快，超过焦点，必须从第（5）步重调，不要在正视目镜的情况下调粗调手轮，防止没有把握的旋转使物镜与载玻片相撞碰坏。

注：观察时两眼同时睁开，双眼不感觉疲劳。

2．高倍镜的操作

（1）使用高倍镜前，先用低倍镜观察（操作方法同低倍镜的操作）。

（2）旋动转换器，换用高倍镜（40）观察，如果高倍镜触及载玻片应立即停止旋动，说明原来低倍镜观察没有调准焦距，目的物没有找到，须用低倍镜重新调节。如果调节正确，换用高倍镜时基本可以看到目的物，如果模糊，用微调焦手轮稍微调节一下就清晰可见。

3．微生物形态观察

取一干净的载玻片，用滴管或玻璃棒在培养液内沾一滴菌液，用干净的盖玻片覆盖在滴液上（注意不要有气泡）即成标本片，用低倍镜和高倍镜观察。记录微生物的形态特征。

四、实验记录及结果

表1-1微生物的形态观察记录

项目放大倍数

低倍镜观察

高倍镜观察

五、思考题

1．镜检标本时，为什么要先用低倍物镜观察？

2．画一个细胞结构的示意图。

实验二微生物的计数（酵母菌的显微镜直接计数）

一、实验目的

1．了解并掌握常用的血球计数板的构造。

2．学会一般的显微镜直接计数方法。

二、实验原理

测定微生物数量方法很多，通常采用的有显微镜直接计数法和平板计数法。

镜检计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液，如有杂菌或杂质常不易分辨。菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板；一般细菌则采用彼得罗夫·霍泽（Petroff Hausser）细菌计数板。两种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察。而血球计数板较厚，不能使用油镜，故细菌不易看清。

血球计数板是一块特制的厚载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个方格网（图2-1）。每个方格网共分9大格，其中间的一大格（称为计数室）常被用作微生物的计数。计数室的刻度有两种：一种是大方格分为16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格；另一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格。但是不管计数室是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即每个大方格都由400个小方格组成（图2-2）。

每个大方格边长为1mm，则每一大方格的面积为1mm2，每个小方格的面积为1／400mm2，盖上盖玻片后，盖玻片与计数室底部之间的间隙为0.1mm，所以每个计数室（大方格）的体积为0.1mm3。使用血球计数板直接计数时，先要测定每个小方格（或中方格）中微生物的数量，再换算成每毫升菌液（或每克样品）中微生物细胞的数量。

图2-1 血球计数扳的构造

a.平面图（中间平台分为两半，各刻有一个方格网)）图2-2 血球计数板计数网的分区和分格

b.侧面图（中间平台与盖玻片之间有0.1毫米的间隙）

三、实验器材

1．双目生物显微镜1台 2．血球计数板1块 3．新鲜酵母培养液

4．盖玻片、擦镜纸、滤纸

四、实验方法

1．取洁净的血球计数板一块。 2．将酵母菌液摇匀，用滴管吸取少许，将菌液直接滴加在计数室上，然后加盖盖玻片(勿使产生气泡)。

3．静置约5分钟，先在低倍镜下找到计数室后，再转换高倍镜观察计数。

4．计数时用16中格的计数板，按对角线方位，取左上、左下、右上、右下的4个中格(即100小格)的酵母菌数。如果是25中格计数板，除数上述四格外，还需数中央1中格的酵母菌数(即80小格)。由于菌体在计数室中处于不同的空间位置，要在不同的焦距下才能看到，因而观察时必须不断调节微调手轮，方能数到全部菌体，防止遗漏。如菌体位于中格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。

5．凡酵母菌的芽体达到母细胞大小一半时，即可作为两个菌体计算。每个样品重复分数2次，取其平均值，按下述公式计算出每毫升菌液所含酵母菌细胞数。

每毫升菌液含菌数＝

80

80小格内总数

×400×10×1000×（稀释倍数）

6．血球计数板用后，在水龙头上用水柱冲洗干净，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免损坏网格刻度。洗净后自行晾干。

表2-1实验记录

项目 计次

各 中 格 菌 数

每毫升菌液总菌数 1

2 3 4 5 1 2 平 均

—— ——

——

——

——

五、实验结果及分析

按上面的公式求出每毫升菌液总菌数和平均值，分析产生误差的原因。

实验三微生物的大小测定

一、实验目的

1.加深几大类微生物实际大小的概念

2.掌握测量微生物的大小（长×宽）的一般技术

二、实验原理

微生物细胞的大小是微生物重要的形态特征之一，也是分类鉴定的依据之一。由于菌体很小,只能在显微镜下来测量。用于测量微生物细胞大小的工具有目镜测微尺和镜台测微尺。

目镜测微尺是一块圆形玻片，其中央刻有精确等分的刻度。测量时，将其放在目镜中的隔板上来测量经显微镜放大后的细胞物象。由于不同的显微镜放大倍数不同，同一显微镜在不同的目镜、物镜组合下，其放大倍数也不相同，而目镜测微尺是放在目镜的隔板上，每格实际表示的长度不随显微镜的总放大倍数的放大而放大，仅与目镜的放大倍数有关，只要目镜不变，它就是定值。而显微镜下的细胞物象是经过了物镜、目镜两次放大成象后才进入视野的。即目镜测微尺上刻度的放大比例与显微镜下细胞的放大比例不同，只是代表相对长度，所以使用前须用置于镜台上的镜台测微尺校正，以求得在一定放大倍数下实际测量时的每格长度。

三、实验器材

1.双目生物显微镜1台

2.目镜测微尺1个

3.镜台测微尺1个

4.载玻片、盖玻片、滤纸

5.酵母、绿藻培养液，新鲜活性污泥

6.玻璃棒、滴管

四、实验方法

1.目镜测微尺的校正

把目镜上的透镜旋下，将目镜测微尺的刻度朝下轻轻地装入目镜的隔板上，把镜台测微尺置于载物台上，使刻度朝上。镜台测微尺是一与载玻片大小相同的玻璃片，中央有一个圆形的盖玻片，中央刻有1mm长的标尺，等分为100格，每格为0.01mm即为10 um。先用低倍镜观察，对准焦距，视野中看清镜台测微尺的刻度后，然后转换成高倍镜，同时转动目镜，使目镜测微尺与镜台测微尺的刻度平行，移动移动手轮，使两尺重叠，再使两尺的“0”刻度完全重合，定位后，仔细寻找两尺第二个完全重合的刻度。计数两重合刻度之间目镜测微尺的格数和镜台测微尺的格数。因为镜台测微尺的刻度每格长10微米，所以由下列公式可以算出目镜测微尺每格所代表的长度：

表3-1目镜测微尺校正记录

项目实验数目镜测微尺格数

（A）

镜台测微尺格数

(B)

目镜测微尺每格长度

μm

1

2

平均————————

A

B

目镜测微尺每格长度×10μm

注：当更换不同放大倍数的目镜或物镜时，必须重新校正目镜测微尺每一格所代表的长度。

2.微生物个体大小的测量 校正好目镜测微尺后，取出镜台测微尺放回盒内 ，放回原处。此时不要再随意变动目镜和物镜放大倍数，微生物个体大小的测定只能在这特定的情况下进行。

取一干净的载玻片滴一滴水样，盖上盖玻片，首先使用低倍镜找到目的物，然后转换成高倍镜进行测量，用目镜测微尺测出微生物长、宽各占几格(不足一格的部分估计到小数点后一位数)，测出的格数乘上目镜测微尺每格代表的长度，即等于该微生物的大小，记录，寻找同类生物个体测量3次，求出平均值。

表3-2 微生物个体大小测量记录

单位：μm

项 目 次 数

1 2 3 平 均

五、实验结果及分析

求出所观察的微生物个体大小的平均值，讨论与理论值的误差原因。

实验四培养基的制备及灭菌

一、实验目的

1．熟悉玻璃器皿的洗涤和灭菌前的准备工作。

2．掌握培养基的制备方法。

3．掌握高压蒸汽灭菌技术。

二、实验原理

培养基是按照微生物生长发育的需要，用不同组分的营养物质调制而成的营养基质。人工制备培养基的目的，在于给微生物创造一个良好的营养条件。把一定的培养基放入一定的器皿中，就提供了人工繁殖微生物的环境和场所。自然界中，微生物种类繁多，由于微生物具有不同的营养类型，对营养物质的要求也各不相同，加之实验和研究上的目的不同，所以培养基在组成原料上也各有差异。但是，不同种类和不同组成的培养基中，均应含有满足微生物生长发育的水分、碳源、氮源、无机盐和生长素以及某些特需的微量元素等。此外，培养基还应具有适宜的酸碱度(pH值)和一定缓冲能力及一定的氧化还原电位和合适的渗透压。

根据制备培养基对所选用的营养物质的来源，可将培养基分为天然培养基、半合成培养基和合成培养基三类。按照培养基的形态可将培养基分为液体培养基和固体培养基。根据培养基使用目的，可将培养基分为选择培养基、加富培养基及鉴别培养基等。

固体培养基是在液体培养基中添加凝固剂制成的，常用的凝固剂有琼脂、明胶和硅酸钠，其中以琼脂最为常用，其主要成份为多糖类物质，性质较稳定，一般微生物不能分解，故用凝固剂而不致引起化学成份变化。琼脂在95℃的热水中才开始融化，融化后的琼脂冷却到45℃才重新凝固。因此用琼脂制成的固体培养基在一般微生物的培养温度范围内(25℃-37℃)不会融化而保持固体状态。

灭菌是用物理或化学的方法来杀死或除去物品上或环境中的所有微生物。消毒是用物理或化学的方法杀死物体上绝大部分微生物(主要是病原微生物和有害微生物)。消毒实际上是部分灭菌。

在微生物实验、生产和科研工作中，需要进行纯培养，不能有任何杂菌，因此，对所用器材、培养基要进行严格灭菌，对工作场所进行消毒，以保证工作顺利进行。

三、实验器材

1．培养皿（Ф90mm）5套

2．试管（15×150mm）5支，（18×180mm）2支，试管架

3．吸量管（10mL）2支，（1mL）8支

4．锥形瓶（250mL）3个

5．烧杯（500mL）1个，50mL1个

6．吸耳球，玻璃棒，滴管

7．纱布、脱脂棉、报纸、精密pH试纸

8．漏斗、漏斗架

9．10% NaOH溶液、10% HCl溶液

10．牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、蒸馏水

11．高压蒸气灭菌器

12．电热恒温培养箱

13．天平、电炉、镊子、牛角勺

四、实验方法

1．玻璃器皿的洗涤和包装

（1）洗涤

玻璃器皿在使用前必须洗涤干净。培养皿、试管、锥形瓶等可用洗衣粉加去污粉洗刷并用自来水冲净。移液管先用洗液浸泡，再用自来水冲洗干净。洗刷干净的玻璃器皿自然晾干或放入干燥箱中烘干，备用。

（2）包装

①培养皿由一底一盖组成一套，用包装纸将5套培养皿包好。

②移液管的吸端用细铁丝将少许棉花塞入构成1~1.5cm长的棉塞，将塞好棉花的移液管的尖端，放在4~5cm宽的长纸条的一端，移液管与纸条约成30o夹角，折叠包装纸包住移液管的尖端，左手将移液管压紧，在桌面上向前搓转，纸条螺旋式包在移液管外面，余下的纸头折叠打结。按实验需要，可单只包装或多只包装，待灭菌。

③用棉塞将试管管口和锥形瓶瓶口部塞住

棉塞的制作：按试管口和锥形瓶瓶口大小估计用棉量，将棉花铺成中心厚，周围逐渐变薄的圆型，对折后卷成卷，一手握粗端，将细端塞入试管或锥形瓶口内，棉塞不宜过松或过紧，用手提棉塞，管、瓶不掉下为准。棉塞四周应紧贴管壁，不能有皱折，以防空气中的微生物沿棉塞皱折侵入。棉塞插入2/3，其余留在管口外，便于拔塞。试管、锥形瓶塞好棉塞后，用包装纸包好，放在灭菌桶内待灭菌。

2．培养基的配制

（1）培养基配方

牛肉膏：1g；蛋白胨：2g；氯化钠：1g；琼脂：4g；蒸馏水：200mL；pH：7.4～7.6 （2）操作方法

①取一个500mL的烧杯，装入200mL的蒸馏水。

②用天平依次称取配方中各成分，放入水中加热溶解，待琼脂完全融化后停止加热，补足蒸发损失的水量。用10﹪NaOH或10﹪HCl调节pH至7.4～7.6。

③分装试管，将培养基分装2支试管中，其余倒入250mL的锥形瓶中，分别塞上棉塞，包扎好待灭菌。

3-1 培养基的分装装置与棉塞

A：培养基的分装图

B：棉塞的做法

1：正确；2：管内太短，外部太长；3：整个棉塞太松；4：管内太紧，外部太短松

3．灭菌

灭菌的方法：灭菌的方法很多，一般可分为加热、过滤、照射和使用化学药品等方法。加热灭菌是最主要的，加热灭菌法有两种：干热灭菌和高压蒸汽灭菌。高压蒸汽灭菌比干热灭菌优越，因为湿热的穿透力和热导传导都比干热强。湿热时微生物吸收高温水分，菌体蛋白很容易凝固变性，所以湿热灭菌效果好。湿热灭菌的温度一般是在121℃灭菌15-30分钟，而干热灭菌的温度则是160℃灭菌2小时才能达到湿热灭菌121℃的同样效果。

①干热灭菌法

培养皿、移液管及其它玻璃器皿可用干热灭菌。现将已包装好的上述物品放入干燥箱中，将温度调至160℃后维持2小时，关掉加热开关，待温度降至50℃左右，将物品取出。

注：灭菌时温度不得超过170℃，以免包装纸烧焦。灭菌好的器皿应保存好，切勿弄破包装纸，否则会染菌。

②高压蒸汽灭菌法

此法使用高压蒸汽灭菌器，微生物实验所需的一些器皿、器具、培养基（不耐高温者除外）等都可用此法灭菌。

③灭菌的操作过程

实验室中常用的高压蒸汽灭菌锅有立式、卧式和手提式等几种。本实验介绍手提式高压蒸汽灭菌器的使用方法。

手提式高压蒸汽灭菌锅的使用操作方法：

1．首先将内层灭菌桶取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。

2．放回灭菌桶，并装入待灭菌物品。注意不要装得太挤，以免防碍蒸汽流通而影响灭菌效果。三角烧瓶与试管口端均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。

3．加盖，并将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的排气槽内。再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。

4．用电加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除灭菌器内的冷空气。待冷空气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升。当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。本实验用1.05kg/cm2，121℃，20分钟灭菌。

5．灭菌所需时间到后，切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至0时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。如果压力未降到0时，打开排气阀，就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染。

6．将取出的灭菌培养基放入电热恒温培养箱于温度37℃下培养24小时，经检查若无杂菌生长，即可待用。

注：每次使用高压蒸汽灭菌器前，认真察看灭菌器内的水位是否合适。

五、思考题

1．培养基根据什么原理配制成的？基础培养基中不同的成分各起到什么作用？

2．说明湿热灭菌比干热灭菌的优越性。

实验五活性污泥法污水处理过程中细菌菌落总数（CFU）的测定

一、实验目的

1．了解细菌总数指标的意义。

2．掌握稀释平板法。

3．掌握细菌菌落总数的计数方法。

二、实验原理

细菌种类很多，有各自的生理特性，必须用适合他们生长的培养基才能将他们培养出来。但在实际工作中不易做到，通常用一种适合大多数细菌生长的培养基培养腐生性细菌，以它的菌落总数表明有机物污染程度。

活性污泥菌含量（细菌总数）是微生物指标，是许多行业运行管理的重要参数之一。在给水工程中，细菌总数在一定程度上反映了微生物污染程度。在污水处理过程中，污泥混合菌浓度及进出水的细菌总数直接反映了活性污泥活性的好坏和水质的变化情况。在实际测定中，通常用适合大多数异养细菌生长的营养琼脂培养基进行培养，以24h、37℃恒温培养产生的菌落总数进行计算。

三、实验器材

1．培养皿（Ф90mm）5套（已灭菌）

2．试管（15×150mm）5支（已灭菌）、试管架

3．吸量管（10mL）2支、（1mL）8支）（已灭菌）

4．锥形瓶（250mL）1个（已灭菌）

5．营养琼脂培养基1瓶（已灭菌）

6．无菌水（200mL）1瓶

7．烧杯（100mL）1个

8．酒精灯

9．吸耳球

四、实验方法

1．稀释水样

将1瓶90mL和5管9mL的无菌水排列好,按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6依次编号，在无菌操作条件下，用10mL的无菌移液管吸取10 mL水样置于第一瓶90mL无菌水（内含玻璃珠）中，将移液管吹洗3次，用手摇10分钟将颗粒状样品打散。即为10-1浓度的菌液。用1mL的无菌移液管吸取1 mL10-1浓度的菌液于一9mL无菌水中，将移液管吹洗3次，摇匀即为10-2浓度菌液。同样方法，依次稀释到10-6。

注：视水体污染程度定稀释倍数，取在平板上能长出30～300个菌落的水样稀释倍数。

2．接种

用无菌移液管吸取3个适宜浓度的稀释液1mL加入无菌培养皿内，并倾注约15 mL已融化且冷却至45℃左右的营养琼脂培养基，并立即旋摇平皿（顺时针或逆时针），使菌液和培养基充分混匀，冷凝后即成平板，翻转平皿，使底面朝上，置于37℃恒温培养箱培养。

3．计菌落数

将培养24h的平板取出计菌落数。

五、菌落计数及报告方法

用肉眼观察，计平板上的细菌菌落数，也可用菌落计数器计数，记下同一浓度的三个平

板的菌落总数，计算平均值，再乘以稀释倍数得出1mL水样中细菌菌落总数。各种不同情况的计算方法如下：

1．首先选择平均菌落数在30～300之间者进行计算，当只有一个稀释度的平均菌落符合此范围时，则以该平均菌落数乘其稀释倍数报告之（表5-1例1）。

2．若有两个稀释度的平均菌落均在30～300之间，则按两者之菌落总数的比值来决定，若其比值小于2，则报告两者的平均数；若其比值大于2，则报告其中较小的菌落总数（表5-1例2及例3）。

3．若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（表5-1例4）。

4．若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（表5-1例5）。

5．若所有稀释度的平均菌落数均不在30～300之间，则以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（表5-1例6）。

6．再求同稀释度的平均数时，若其中一个平板上有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的平均菌落数。若片状菌落约为平板的一半，而另一半平板上菌落数分布很均匀，则可按半平板上的菌落计数，然后乘以2作为整个平板的菌落数。

7．菌落计数的报告，菌落数在100以内时按实有数报告，大于100时，采用二位有效数字，在二位有效数字后面的位数，以四舍五入方法计算。为缩短数字后面的零数，可用10的指数来表示（表5-1报告方式栏）。在报告菌落数为“无法计数”时，应注明水样的稀释倍数。

表4-1 稀释度选择及菌落总数报告方式

例次不同稀释度的平均菌落数

两个稀释度

菌落数之比

菌落总数/CFU·mL-1 报告方式/CFU·mL-1 10-1 10-2 10-3

1 2 3 4 5 6 1365

2760

2890

无法计算

27

无法计算

164

295

271

4650

11

305

20

46

60

513

5

12

—

1.6

2.2

—

—

—

16400

37750

27100

513000

270

30500

16000或1.6×104

38000或3.8×104

27000或2.7×104

510000或5.1×105

270或2.7×102

31000或3.1×104

六、思考题

1．测定水中细菌总数有什么实际意义？

2．根据我国饮用水水质标准，讨论这次的检验结果。