林业生物技术资料

《林业生物技术》复习重点
一、概念与名词
1、植物离体快速繁殖
——又称微快繁，简称微繁，
应用植物细胞的“全能性”理论，在无菌条件下，把离体的植物器官（如根、茎、叶、花、果实、种子等）、组织（如花药、胚珠、形成层、皮层、胚乳等），放在人工控制的环境中，使其分化、繁殖，在短时间内产生大量遗传性一致的完整新植株的技术。是利用植物组织培养技术进行的一种营养繁殖方法，是常规营养繁殖方法的一种扩展与延伸。
2、试管外生根技术
——试管外生根技术是指将组织培养茎芽的生根诱导与驯化培养结合在一起，直接将茎芽扦插到试管外有菌环境中，边诱导生根边驯化培养。该方法舍弃了组织培养苗在试管内生根这一环节，不仅避开了瓶内生根难的问题，同时也大大缩短了育苗周期和节省了育苗成本。
3、林业生物技术
——应用自然科学及工程学原理，依靠森林植物、动物、微生物作为反应器将物料加工转化，规模化生产和提供人们所需的生态环境、生物质产品和公益性服务的科学技术。（P8）
4、细胞全能性
——是指植物细胞具有发育成一个完整植株的全部遗传信息，在适当条件下能够形成完整植株。（P26）
5、组织培养
——组织培养是指将植物的形成层组织、分生组织、表皮组织、薄壁组织和各种器官组织以及愈伤组织进行离体培养的技术。
6、胚珠培养
——胚珠培养是将授粉的子房在无菌条件下解剖后，取胚珠置于培养基中培养的过程。有时也把胚珠连同胎座一起取下来培养。
7、离体叶的培养
——在自然界，很多植物的叶具有强大的再生能力，能从叶片产生不定芽的植物，离体叶培养指包括叶原基、叶柄、叶鞘、叶片、子叶在内的叶组织的无菌培养。它大多经脱分化形成愈伤组织，再由愈伤组织分化出茎和根。其中叶片培养是一个典型的代表。
8、植物细胞工程
——植物细胞工程是植物生物技术的一个重要组成部分，是在离体培养条件下，在细胞水平上对植物材料进行遗传操作的技术，即对植物体的任何一个部分（器官、组织、细胞、原生质体）进行离体诱导使其称为完整植株的技术。
9、外植体
——外植体指植物组织培养中用来进行无菌培养的离体材料，可以是器官、组织、细胞和原生质体等。
10、细胞悬浮培养
——细胞悬浮培养是将游离的植物细胞按一定的细胞密度，悬浮在液体培养基中进行培养增殖的技术。
11、花粉培养
——花粉培养也叫小孢子培养，是从花药中分离出花粉粒，使之成为分散的或游离的状态，通过培养使花粉粒脱分化，进而发育成完整植株的过程。
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2、原生质体
——原生质体是指植物细胞中除去细胞壁具有细胞全能性的裸露部分。
13、转基因林木
——转基因林木是指利用基因工程技术改变基因组构成，用于林业生产或者林产品加工的森林植物。包括转基因森林植物、转基因森林植物产品、转基因森林植物的直接加工品、含有转基因森林植物及其产品的其它相关产品。
14、植物生物反应器技术
——植物生物反应器技术是指利用植物系统，包括植物细胞、组织、器官乃至植物个体为工厂生产具有商业价值的生物制品的方法。
15、诱导抗病性
——诱导抗病性是指利用生物因子或非生物因子处理植物，以改变植物对病害的反应，并产生局部或系统抗性的现象。
16、反义技术
——反义技术是指根据碱基互补原理，人工合成或生物体合成特定互补的DNA或RNA片段，以抑制或封闭某些基因表达的技术。
17、玻璃化
——实践表明，当植物材料不断地进行离体繁殖时，有些培养物的嫩茎、叶片往往会呈半透明水迹状，这种现象通常称为玻璃化。
18、基因工程
——基因工程又称为重组DNA技术，是按着人们的科研或生产需要，在分子水平上，用人工方法提取或合成不同生物的遗传物质（DNA片段），在体外切割，拼接形成重组DNA,然后将重组DNA与载体的遗传物质重新组合，再将其引入到没有该DNA的受体细胞中，进行复制和表达，生产出符合人类需要的产品或创造出生物的新性状，并使之稳定地遗传给下一代。
19、驯化
——驯化是指试管苗移植前可将培养瓶移到自然光照下锻炼3-10d，让试管苗接受自然光的照射，感受自然温度的昼夜温差现象，使其壮实，然后再开瓶移植，经过较低温、湿度的处理，以适应自然温、湿度条件。
20、脱毒苗
——脱毒苗是指不含该种植物的主要危害病毒，即经检测主要病毒在植物内的存在表现为阴性反应的苗木。



















二、是非与选择
1、林业生物技术应用领域主要包括：优质、高抗、速生林木良种培育，良种苗木工厂化繁育，有益天然产特离体生产，林业蛋白质工程、酶工程、能源生物技术、环境生物技术、药材生物技术等其它林业生物技术。
2、植物细胞全能性的实现需经过细胞脱分化和再分化过程。
3、根据起因不同，植物细胞的死亡分为病理性死亡和生理性死亡。
4、器官培养程序包括：无菌外植体的获得、初代培养物的建立、培养物形态发生、植株再生等环节。
5、植物营养器官培养主要包括：根段培养、茎段培养、叶培养。
6、植物繁殖器官培养主要包括：花器官培养、幼果培养、种子培养。
7、原生质体培养的体细胞

变异大于细胞培养的变异，而细胞培养的变异又大于组织器官培养的变异。
8、优良变异的筛选方法有：直接筛选法、间接筛选法。
9、细胞变异的类型包括：自发产生的变异、诱发产生的变异。
10、分裂素/生长素的比例是控制芽和根形成的一个重要条件，比例高时产生芽，比例低时产生根。
11、由完整的植物器官分离单细胞，叶片是分离单细胞的最好材料。
12、成功的悬浮细胞培养体系必须满足三个条件：悬浮培养物分散性良好，均一性好，细胞生长迅速。
13、植物细胞培养可分为：单细胞培养、单倍体培养、原生质体培养。
14、常用的植物生长调节剂有两大类：生长素类，如2,4-D、IAA、NAA等；细胞激动素类，如6-BA、TDZ和ZT。
15、原生质体培养基的基本成分与组织培养基类同，只是添加了渗透压稳定剂。多数情况下所用的培养基是MS、B5或它们的衍生培养基。
16、花卉基因工程研究的内容主要有：香味基因工程、花发育基因工程、花卉保鲜基因工程、花卉株型基因工程、花卉抗性基因工程等五大方面。
17、自1986年第一株转基因杨树问世以来，不同树种的转基因工作相继开展。
18、对于植物悬浮细胞培养的生物反应器应符合：合适的氧传递、良好的流动性、低的剪切力等要求。
19、根据诱导子的来源可将其分为生物因子或非生物因子，生物因子包括真菌、细菌、病毒，还包括一些病原体的非致病性生理小种、选择过的非病原体、弱致病性病原体、强致病性病原体以及病原体和非病原体的毒性产特；非生物因子包括一些物理和化学因子，如损伤、电击、高温、紫外线、重金属、有机化合物、无机化合物等。
20、从实践得知有些植物在B5培养基上生长更适宜，如双子叶植物特别是木本植物。
21、母液是欲配制液的浓缩液，这样不但可以保证各物质成分的准确性及配制时的快速移取，而且还便于低温保藏，一般母液配成比所需浓度高10-100倍。
22、常用的灭菌方法可分为物理的和化学的两类，即：物理方法如干热(烘烧和灼烧)、湿热(常压或高压蒸煮)、射线处理(紫外线、超声波、微波)、过滤、清洗和大量无菌水冲洗等措施；化学方法是使用升汞、甲醛、过氧化氢、高锰酸钾、来苏儿、漂白粉、次氯酸钠、抗菌素、酒精化学药品处理。
23、植物离体培养常用的主要糖类是蔗糖。
24、无菌操作接种时，在操作前和操作期间要经常用于擦拭双手和台面的酒精浓度是70%。
25、根、茎、叶、花、果、木质部、形成层、韧皮部、中柱鞘等植物体细胞均可作为培养材料，诱导形成完整植物体。（√）
26、以小孢子和大孢子细胞等植物性细胞为

培养材料，可诱导形成完整植物体，该植物体叫单倍体，能正常开花结实。（╳）
27、植物细胞培养过程中，温度、光照（如紫外线、湿度、通气状况）均会影响培养细胞的全能性。（√）
28、愈伤组织是尚未分化的原始细胞团，其生理年龄几乎为零。（√）
29、每种激素必须单独配成母液，浓度一般配成1mg／ml。（√）
30、一般来讲，继代时间越长、继代次数越多，细胞变异的几率就越大。（√）
31、茎尖培养与脱毒中，能否培养成功关键在于培养基。（×）
32、平板培养是花粉培养的一种方式。（√）
33、原生质体培养的适宜温度为25-30℃。（√）
34、环境的相对湿度可以影响培养基的水分蒸发，一般要求80％-90％的相对湿度。（×）
35、无病毒植株实际应用中最大的问题并非重复感染。（×）
36、机械法分离原生质体的主要缺点是原生质体的产量很低、方法繁琐费力。（√）
37、植物组织培养形成的愈伤组织进行培养，又可以分化形成根、芽等器官，这一过程称为脱分化。（×）
38、植物组织培养的培养基PH值都在5.8－6.0之间。（×）
39、花粉培养是将花粉从花药中游离出来，成为分散或游离态进行培养。（√）
40、单细胞培养中选择优良细胞株常用平板培养法。（√）
三、简答与问答
1、植物离体快速繁殖的影响因素有哪些？
答：1、外植体
（1）外植体的基因型，（2）外植体的类型，（3）外植体的来源，（4）外植体的生理状态，
（5）外植体的大小，（6）极性，（7）继代培养次数
2、芽的增殖途径
3、培养基（1）基本培养基，（2）碳源，（3）氮源，（4）植物激素，（5）培养基中其它因子
4、培养条件 （1）光照，（2）培养温度，（3）容器内气体成分，（4）湿度
2、植物离体快速繁殖的常见问题有哪些？
答：1、污染， 2、外植体褐变 3、试管苗的玻璃化
4、试管苗移栽的成活率 5、遗传稳定性
3、植物离体快速繁殖中外植体褐变的影响因素有哪些？如何克服？
答：影响外植体褐变的因素有：
（1）植物种类和品种（基因型），含有单宁、酚类化合物、多酚氧化酶活性大、色素含量多的植物较易发生如苹果。（2）外植体的生理状态，成年期＞幼龄期，老熟组织＞幼嫩组织，夏季＞春冬季。（3）取样时间不当，培养时间过长，长时间不继代。（4）培养基，无机盐浓度过高，细胞分裂素过高。（5）温度，过高（6）光照，高光。（7）外植体受损程度，受伤严重，消毒剂毒害。
克服措施有：
（1）外植体选择的时间、季节、部位，遮光处理。 （2）适宜的培养

基。（3）合适的培养条件。（4）加入抗氧化剂，使用VC，PVP，活性碳。（5）缩短继代时间。（6）减少外植体受损程度及合理使用消毒剂。
4、林业生物技术的基本特征是什么？（P8-9）
答：（1）林业生物技术是以森林群落（森林植物、动物和微生物）为生物反应器进行产品生产。
（2）林业生物技术为人类提供生态产品、生物质产品和公益服务。
（3）林业生物技术克服物种间生殖隔离，以各种来源的目的基因定向培育林木新品种。
5、花器官培养的意思有哪些？
答：花器官培养的意义有：
（1）通过离体花芽培养可了解整体植物和内源激素在花芽性别决定中所起的作用；
（2）可以了解花器官各部分对果实和种子发育的作用；
（3）内、外源激素在果实种子发育过程中的调控作用；
（4）生产上也可用于珍贵品种的扩大繁殖。
6、简述种子培养的技术
答：种子培养技术包括：
（1）种子灭菌：种皮厚或不饱满的种子，宜用0.1％升汞消毒10-20min。幼嫩的或发育不全的种子，宜用饱和漂白粉消毒15-30min。若种子上有绒毛或蜡质，应先用95％酒精或吐温80处理，提高消毒效果。对壳厚难萌发的种子，可去壳培养。
（2）培养基：
A.促种子萌发用MS培养基，加或不加激素，诱导愈伤组织则可加入6-BA或2,4-D。
B.无胚乳种子（棉花、大豆、花生、向日葵、番薯、马铃薯、苹果、烟草、薄荷）应适当加生长素。
C.一般糖浓度为1-3%。
D.打破休眠可加GA，或在接种前浸种处理。
（3）接种：把种子按每瓶3-5粒放人培养瓶中，均匀排列。培养温度20-28℃，培养光强为1000-20001x，每天光照时间10-12h。
7、简述组培中细菌污染的症状与致因
答：组培中细菌污染的症状是：菌落呈黏液状或浑浊的水渍状痕或出现泡沫的发酵状等情况，颜色多为白色，与培养基表面界限清楚，接种后1~2天发现。
引起细菌污染的可能原因：外植体、培养基灭菌不彻底、操作不当、接种工具、呼吸、不干净的手、室内不干净等。
8、简述组培中真菌污染症状与致因
答：组培中真菌污染的症状是：菌落多为黑色，绿色，黄色，白色的绒毛状，棉絮状，与培养基表面界限不清楚，接种后3~10 天发现。
引起真菌污染的可能原因：周围环境、空气污染、超净工作台、操作不当、器皿瓶口大等。
9、简述细胞悬浮培养的优点
答：细胞悬浮培养的优点主要有：能大量提供比较均匀一致的细胞，细胞增殖的速度比愈伤组织快，适宜大规模培养，成为细胞工程中独特的产业。
10、简述植物组织培养所需营养与环境条件
答：营养条件包括：
无机营养（大量元素、

微量元素），有机营养（维生素类、肌醇、氨基酸、天然复合物），植物生长调节物质，琼脂，碳源，抗生物质，抗氧化物，活性炭等。
环境条件包括：
温度，光照，湿度，渗透压，pH值，气体。
11、简述 一个标准的组织培养实验室必须具备的条件
答：一个标准的组织培养实验室必须具备的以下条件：
第一、清洗和储存玻璃器皿、塑料器皿和其他实验器皿；
第二、培养基的配制、灭菌和储存；
第三、植物材料的无菌操作；
第四、可控温度、光照、湿度的条件，以便对材料进行体外培养；
第五、培养物生长发育过程的显微观察。
12、简述MS培养基的主要特点
答：MS培养基是1962年由Murashige和Skoog为培养烟草细胞而设计的。其主要特点是：无机盐和离子浓度较高，为较稳定的平衡溶液；其养分的数量和比例较合适，可满足植物的营养和生理需要；它的硝酸盐含量较其他培养基为高，广泛地用于植物的器官、花药、细胞和原生质体培养，效果良好；有些培养基是由它演变而来的。
13、简述继代培养时材料玻璃化的解决办法
答：继代培养时材料玻璃化的具体解决办法为：
①增加培养基中的溶质水平，以降低培养基的水势；
②减少培养基中含氮化合物的用量；
③增加光照；
④增加容器通风，最好进行C02施肥，这对减轻试管苗玻璃化的现象有明显的作用；
⑤降低培养温度，进行变温培养，有助于减轻试管苗玻璃化的现象发生；
⑥降低培养基中细胞分裂素含量，可以考虑加入适量脱落酸。
14、简述基因工程有突出的特征：
答：基因工程有两个重要特征：
第一是可把来自任何生物的基因转移到与其毫无关系的任何其他受体细胞中，因此可以实现按照人们的愿望，改造生物的遗传特性，创造出生物的新性状；
第二是某一段DNA可在受体细胞内进行复制，为准备大量纯化的DNA片段提供了可能，拓宽了分子生物学的研究领域。

四、实践与案例
1、试述提高试管苗驯化移栽成活率的措施
答：试管苗驯化移栽成活率低的原因：
（1）内因：一般地，试管苗细长、黄化、根系发育不良者移栽成活率低。试管苗叶片浓绿、茎粗壮、根系发达及长势好者移栽成活率高。
（2）外因：光、温、水、气、湿度、有无杂菌、管理技术及工作人员的责任心。
提高试管苗驯化移栽成活率的措施：
（1）努力提高试管苗的质量，要求：有针对性调整培养基配方及培养条件。
（2）及时出瓶驯化，避免苗老化。
（3）出苗时可以考虑使用生根粉。
（4）选用合适的基质，创造适宜的培养条件。

（5）定期喷施营养液及杀菌剂，防虫防病；结合浇水浇灌营养液。用自来水浇灌时可不用加微量元素，一般一周一次，初期浓度低0.15-0.2％，后期可增加到0.3％。逐渐延长光照时间，增加光照强度。同时每隔7-10天交替喷1000倍的百菌清或灭枯净。
（6）提高工作人员的责任心。
2、试述茎尖培养的方法及步骤
答：茎尖培养的步骤有：取材——材料处理及消毒——接种——培养——驯化移栽
（1）取材
①直接取材：在生长旺盛、枝条健壮、无病的母株上选生长不久、杂菌污染少的顶梢（1－2cm）（取前可喷杀菌药，可顶芽或侧芽）。
②从试管苗获取。
（2）材料处理及消毒
将采集到的茎尖切成0.5-1.0cm长→→去叶（休眠芽预先剥除鳞片） →→流水冲洗2-4h →→ 75％的酒精中处理30s →→稀释20倍的次氯酸钠中浸5-8min(取自老枝条上的可适当延长时间） →→用无菌水冲洗数次，准备接种。
（3）接种
接种前再剥掉一些叶片，使茎尖0.5cm →→接种。要求：随切随接，动作迅速。亦可将切下茎尖材料在1－5% VC液中浸一下。
（4） 培养
1）培养基① 基本培养基 MS、White、B5、Heller培养基。② 蔗糖作碳源效果好，浓度2－3%。③ 激素（2，4-D，IAA， NAA ）和有机添加物有明显影响。但激素浓度以0.1mg/L为宜， 不要太高。
茎尖生长状态：生长太慢：茎尖不增大→→变绿→→细胞逐渐老化→→休眠。原因: 生长素浓度太低；温度过低或过高。
生长太快：茎尖迅速增大→→愈伤组织→→丧失成苗能力。原因: 生长素浓度过高；光照太弱或温度太高。
生长正常：茎尖基部稍增大并形成少量愈伤组织，茎尖颜色逐渐变绿，并伸长，叶原基发育成可见的小叶，进而形成小苗。
2）初代培养条件：每天光照16h/d，照度1500-2000Lx，温度25±2℃。
3）继代培养：茎尖长成的新梢→→切成小段→→增殖培养基中→→ 1个月左右→→新梢又可切成小段→→再转入新培养基→→建立和维持了茎尖无性系。 （即微型扦插）继代培养可用MS培养基。
4）诱导生根：采用I／2MS培养基 加入一定的生长素类调节物质，如NAA、IBA等。新梢基部浸入50或100mg/l的IBA溶液处理4-8h，然后转移到无激素的生根培养基中。
5）驯化移栽入土：在生根培养1个月左右→→生长健壮而发达的根系→→炼苗→→移栽 →→管理（温、光、湿、气）。
3、试述植物离体培养过程中无菌操作的注意事项
答：无菌操作注意事项主要有：
（1）实验器具和材料的准备。
（2）用75%的酒精擦拭超净工作台，然后室内及超净工作台用紫外灯杀菌20min-30min。
（3）关紫外灯、打开风机，过5

-10min进入缓冲间，以75%洗手和手臂，更换无菌服、帽子和口罩。进入接种室。
（4）用70－75％的酒精拭擦台面并消毒双手。试验用具也应该用酒精消毒。点燃酒精灯，将金属器械在其火焰上灼烧，冷却待用。
（5）取流水冲洗（至少30min）过的外植体，用一定的消毒剂浸泡消毒，用无菌水冲洗3~4次，放入无菌培养皿中，置于酒精灯火焰下方，用无菌的接种器械进行分离、切割或其他处理。
（6）打开培养瓶，瓶口在灯焰处旋转灼烧，用镊子将培养材料置于培养基上，灼烧镊子放回，灼烧瓶口，盖上瓶塞。
（7）收拾台面。
4、红叶石楠试管苗驯化和移栽基质配制
答：基质的基本要求是：疏松通气、适宜的保水性、清洁卫生。
基质的成分比例是：V蛭石/V珍珠岩/V泥炭=6/3/1。成活率可达95%以上。
5、试述红叶石楠组培苗过渡移栽管理
答： （1）组培苗出瓶移栽
组培苗出瓶是保证移栽成活的第一步，是从无菌，温、光、湿度稳定环境中进入到自然环境中，从异养过渡到自养过渡的一个炼苗过程。
（2）防病管理
保持环境清洁、尽量减少污染是组培苗移栽成活的根本所在。幼苗浇灌时应尽可能选择清洁的水源，移栽当天喷施（0.33-0.50）MS 营养液，并喷施 800-1000 倍甲基托布津或百菌清或500倍多菌灵药液，每隔一周左右喷施一次，连续喷施3-4次，前后两次交替使用不同杀菌剂效果更好。
（3）湿度管理
有效的湿度管理也是保证组培苗移栽成功的关键因素之一，红叶石楠组培苗出瓶前是在100％ 相对湿度条件下生长的，出瓶初期保持高湿的小环境至关重要。红叶石楠移栽初期 3-5d 棚内空气湿度需保持在 95％ 以上，5d 后仍需半封闭保持 80％ 相对湿度2-3周。移栽后也要注意基质湿度的控制，除淋足定根水后，以后2-3d淋水一次。
（4）光照、温度管理
组培苗室内生长环境是在弱光、基本恒温下，因此移栽后应注意遮光及控温。一般移栽初期应遮光 70％一周，以后用 50％ 遮光，2-3周即可除去遮阳网。
移栽时应选择适宜的季节，红叶石楠在 9月下旬到次年5月中旬移栽成活率较高，冬季及早春移栽成活率最高，冬季应在大棚内加盖内棚，苗床基质保持在15℃ 以上，成活率一般可达90％以上。
6、试述鹅掌楸组织培养时的培养基、培养条件及消毒要领
答：以最常用的MS培养基与1／2MS为基本培养基，附加外源激素：生长素为IBA，细胞分裂素为6-BA，激动素为KT。蔗糖30g/L，琼脂肪7g/L，活性炭3g/L，pH值为5.6-5.8，温度28℃，光照2000lx。
野生高山鹅掌楸由于生长在野外，枝条粗壮，灭菌困难，先用75%酒精处理5s (注意时间不

能过长) ，再用 0.1%HgCl2消毒6-8min，再用无菌蒸馏水漂洗3-5次污染率较低。时间控制要求高，操作技术熟练是保障。