基因编辑技术的方法、原理及应用
Hans Journal of Biomedicine 生物医学, 2015, 5, 32-41
Published Online July 2015 in Hans. https://www.360docs.net/doc/0214159886.html,/journal/hjbm
https://www.360docs.net/doc/0214159886.html,/10.12677/hjbm.2015.53005
Methods, Principles and Application of
Gene Editing
Yuchang Zhu1, Xiaojiang Zheng1, Yibing Hu2*
1School of Biological Science and Technology, Hubei University for Nationalities, Enshi Hubei
2College of Resources & Environmental Sciences, Nanjing Agricultural University, Nanjing Jiangsu
Email: *huyb@https://www.360docs.net/doc/0214159886.html,
Received: Jul. 1st, 2015; accepted: Jul. 24th, 2015; published: Jul. 27th, 2015
Copyright ? 2015 by authors and Hans Publishers Inc.
This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY).
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Abstract
Fast development of gene editing technologies provides more powerful tools for gene function analysis. Now researchers can easily manipulate targeted gene with the Zinc Finger Nuclease (FZN), Transcription Activation Like Effector Nuclease (TALEN) and Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated proteins (CRISPR) technologies emerged in the last dec-ade. These technologies revolutionized gene functional analysis and medical treatment. In this re-view, several typical gene editing technologies were listed, and their principles, characteristics and application were discussed.
Keywords
Gene Editing, Methods, Principles, Application
基因编辑技术的方法、原理及应用
朱玉昌1，郑小江1，胡一兵2*
1湖北民族学院生物科学与技术学院，湖北恩施
2南京农业大学资源与环境科学学院，江苏南京
Email: *huyb@https://www.360docs.net/doc/0214159886.html,
收稿日期：2015年7月1日；录用日期：2015年7月24日；发布日期：2015年7月27日
*通讯作者。
基因编辑技术的方法、原理及应用
摘要
基因编辑技术的飞速发展为基因功能研究工作提供了更多有力的工具。近十年来相继出现的锌指核酸酶(FZN)、转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)以及规律性间隔的短回文序列重复簇(CRISPR)已经可以让研究人员很方便的对特定的目的基因进行突变、修复或替换等操作，从而为生物学研究及医学治疗领域带来革命性的变化。本文就有代表性的基因编辑技术的种类、原理及其研究进展进行了综述，并对它们各自的特点及应用前景和值得进一步研究的问题进行了探讨。
关键词
基因编辑，方法，原理，应用
1. 引言
随着DNA测序技术的快速进步，越来越多的物种基因组序列成为已知，但鉴定这些基因的功能仍然是一项十分艰巨的任务。作为鉴定基因功能最重要的策略，获得其突变体是优先考虑的手段。然而，无论是依赖自发突变还是通过物理、化学手段如射线和化学诱变剂处理，或者利用转座子以及T-DAN插入，都只能被动的获得随机出现的基因突变体材料，并且基因出现突变的频率通常较低。因此，虽然过去运用这些手段对很多基因的功能鉴定提供了巨大的帮助，但它们目前已经难以满足日益扩大的基因功能研究的需求。令人鼓舞的是，近十年来基因编辑技术的出现为克服上述矛盾开辟了新的途径，特别是锌指核酸酶(FZN)和转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)以及最近发展起来的规律性间隔的短回文序列重复簇(CRISPR)技术，为基因编辑提供了前所未有的方便和快捷，吸引了全世界研究人员的广泛关注。
基因编辑就是通过对细胞基因组中目的基因的一段核苷酸序列甚至是单个核苷酸进行替换、切除，增加或者是插入外源的DNA序列，使之产生可遗传的改变[1]-[3]。与射线或化学诱变剂导致的DNA随机突变不同的是，基因编辑技术是定向改变基因的组成和结构，具有高效、可控和定向操作的特点。因此，基因编辑技术被麻省理工科技评论评为2014年十大突破性科学技术
(https://www.360docs.net/doc/0214159886.html,/lists/technologies/2014/)，其中CRISPR还获得2015年度生命科学突破奖(https://https://www.360docs.net/doc/0214159886.html,/News/21)。
虽然各种基因编辑技术的原理及作用方式并不相同，但它们的共同之处是基因编辑都建立在使目标基因DNA产生双链断裂(Double Strand Breaking, DSB)的基础上。因为DNA分子单链断裂或缺失后容易被细胞内的各种修复机制所修复而不产生任何改变[4]，但DNA双链断裂的结果则有很大的不同。细胞内DNA双链断裂的修复有两种方式，即同源重组修复(Homologous Recombination, HR)和非同源末端链接修复(Non-Homologous End Join, NHEJ) [5] [6]。当DNA发生双链断裂后，如果细胞内存在与裂口两端同源的序列，则进行同源重组修复，外源DNA片段可借此插入断裂序列中对原来的基因进行敲除或将外源基因插入基因组DNA而形成所谓的基因敲入；若细胞内无同源序列存在，双链断裂的DNA分子则通过NHEJ连接，由于无模板可以利用，这种“硬”连接容易导致碱基的缺失、增加或改变而引起突变。实际上，无论是HR修复还是NHEJ修复，都可以产生较于原来基因的不同变化。虽然DNA双链断裂对基因组而言是严重的伤害[7]，但这种变化正是研究基因功能所需要的。下面我们就基因编辑技术的种类及其特点分别进行简单的介绍。
基因编辑技术的方法、原理及应用
2. 同源重组(Homologous Recombination, HR)
从使基因发生定向改变这个角度而言，早期的基因编辑技术可以追溯到同源重组这种方法。基于同源重组的基因编辑被称为基因打靶或基因靶向技术(gene targeting)，例如依赖大肠杆菌细胞内的Rec A或酵母的RAD54重组酶，基因靶向技术可以对目标基因或基因的部分序列进行替换、删除，或在细胞内存在同源序列的情况下插入外源DNA序列。运用同源重组对基因进行编辑的方法已经在微生物、植物和动物中取得了成功[2]。不过，该方法的一个主要局限在于重组频率低，约为10?4~10?5[2]。虽然对微生物及培养的动物细胞系、甚至对一些苔藓植物如小立碗藓来说，同源重组技术可以获得满意的基因编辑效率，但对高等植物或动物，基于同源重组的基因靶向技术由于效率太低，在实践上难以广泛应用，尽管也有少数成功的例子[8] [9]。据分析，高等动、植物中同源重组效率低下的原因可能在于这些细胞内同源重组酶的效率不高，因为有研究显示，转入外源的同源重组酶基因后，这些物种中的同源重组效率提高了一个数量级[8] [9]。
3. 锌指核酸酶(Zinc Finger Nuclease, FZN)
人工核酸酶FZN可以算是第一种具有普遍适用性的基因编辑技术。我们知道，分子生物学中广泛使用的工具酶主要是II型限制性核酸内切酶，绝大多数情况下这些酶的切割位点位于其DNA识别序列之中。不过，IIS型的核酸内切酶(如Fok I)则不同，其识别序列和切割序列相距9个核苷酸，并且切割和识别功能分别由酶蛋白的不同结构域完成。人工核酸酶正是利用了IIS型核酸内切酶的这一特点，在保留它的非特异的酶切割功能结构域的基础上，将其DNA识别结构域用能够识别特定核苷酸序列的、人工合成的结构域取代，这样就构成了能够根据人们的需要而识别特定DNA序列并进行切割的人工核酸酶。
按此原理构建的锌指核酸酶FZN就是由一系列锌指结构单元与Fok I的核酸酶切活性区域组合而成的(图1)，它具有对特定的DNA序列进行识别和切割的能力。FZN对不同DNA序列识别的机理在于组成其锌指蛋白基元(Motif)的种类及排列方式。锌指结构是很早就发现的一类能与DNA分子相互作用的蛋白结构基元。在人类基因组中，约有3%蛋白含有这样的结构[10]。锌指结构基元一般由30个左右的氨基酸组成，其结合锌离子的保守氨基酸为四个半胱氨酸残基(Cys-)或两个半胱氨酸残基和两个组氨酸残基(His-)。空间结构上，锌指结构从N端到C端由两个反向的β平行结构和一个α螺旋组成。α螺旋的1、
3、6位氨基酸残基分别特异性的结合其识别DNA分子中三个连续的碱基[11] [12]，亦即不同的锌指结构
基元中其α螺旋的1、3、6位上氨基酸残基是不同的，因此，将不同的锌指结构单位(通常3~6个)组合起来就可以形成识别18~36 bp的一段双链DNA序列。所以，选择不同的锌指结构单位组合起来并且和Fok I连接，就构成了能针对特定的目标序列进行切割的人工核酸酶(图1)。不仅如此，Fok I需要形成二聚体才具有酶切活性[13]，虽然Fok I自身二聚化也能产生对DNA的切割作用，但切割效率极低并且容易产生非特异切割，所以在设计FZN时，还需要对Fok I进行突变，使之不能形成同源二聚体；并且研究显示，当两个结合不同靶序列的突变Fok I相距5~6 bp就可以形成异源二聚体而具有酶切功能，这样设计的另一个优点是可以增加FZN识别的特异性[14]。
FZN这种基因编辑方法在一系列的模式生物中都获得了成功[15]，研究显示FZN基因编辑效率约为30%，相对于同源重组，其编辑效率无疑具有了质的提高。不过，目前它还存在一些不足，一个突出的问题是所谓的脱靶效应，即合成的核酸酶并没有对预先设定的目标DNA序列进行识别和切割。出现这种情况的原因在于组成人工核酸酶的各个锌指结构单元之间存在相互影响，即存在所谓上下文依赖(Context-dependant)，也就是说将不同锌指结构单位连接起来后，其DNA识别序列并不是它们单独存在时分别识别的核苷酸组序列的简单相加[16] [17]。因此，这种脱靶效应很大程度上还是目前对锌指结构单
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Figure 1. A schematic figure of FZN components and two joining
models of double strand breaks after FZN nuclease cleavage (based
on reference [15])
图1. FZN核酸酶结构及其工作原理示意图。图中显示FZN的组
成以及目标DNA经锌指核酸酶切割后的两种不同的连接(修复)
方式(参考文献[15])
元之间的相互影响缺乏足够了解造成的。由于受专利等因素的影响，不同的研究机构对他们研究出的结果并没有充分共享。相信随着以后对锌指结构单元之间相互影响的深入了解，FZN脱靶问题可能会得到较好的解决。
4. 转录激活子样效应因子核酸酶TALEN (Transcription Activation Like Effector Nuclease)
在FZN问世不久，另一种人工核酸酶TALEN也被开发出来。与FZN一样，TALEN也是利用一种对DNA分子特异识别的蛋白结构与Fok I的酶切活性结构域组合形成的。与FZN不同的是，TALEN利用的是黄杆菌(Xanthomonas)的转录因子激活样效应因子(Transcription Activation Like Effector)中DNA序列识别模块作为特异识别DNA序列的基础[18]。TALEN识别模块一般由34个氨基酸组成(图2)，其组成的氨基酸除了第12和13位外其余都是保守的，因此第12/13位氨基酸被称为可变的双氨基酸残基RVD (Repeat Va-riable Di-residue)，正是这两个氨基酸决定了TALEN结合DNA上核苷酸的种类[19]-[21]。实际上，组成DNA 分子的四种不同碱基都有与之对应的TALEN识别模块(图2)，所以在构建TALEN人工核酸酶时原理相对简单，只需将表达不同的TALEN识别模块序列按目标序列的顺序连接起来，再与Fok I酶的编码序列融合即可完成。不过，由于目标序列的每个碱基都需要一个TALEN识别模块，所以整个构建过程工作量较大。目前，在拟南芥等多种生物中其基因编辑的作用已经得到验证[18] [22]。
除了原理简单，TALEN的另一个优势在于，理论上说对任意的核苷酸序列，都能以它为靶标构建一个特异的TALEN核酸酶。在编辑效率方面，TALEN虽然也还没有达到理想的程度，但相对于FZN还是有所提高[23]，并且有更好的特异性，使其在医疗用途中更加安全，不过脱靶效应仍然存在。实际上所谓“脱靶”产生的影响并不只是降低了基因编辑的成功率，因为无论是FZN还是TALEN，它们识别的目标基因的序列长度一般只有十几个碱基，而在整个基因组中，不可避免的有一些与目标序列相似的序列存在，所以，脱靶后更大的危害在于人工核酸酶对基因组中具有与靶序列相似的基因进行编辑，从而产生不可预测的后果。在医学治疗领域的基因编辑运用中，这种情况尤其需要避免。不过，最近的研究表明，通
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Figure 2. A cartoon figure of TALEN components and structure (https://https://www.360docs.net/doc/0214159886.html,/talen/). Red and
purple ellipses represent TALEN recognition modules
图 2. TALEN结构及组成示意图(https://https://www.360docs.net/doc/0214159886.html,/talen/)。图中红色和紫色的椭圆形结构为
TALEN的识别模块
过运用一套扩展的RVD有效的增强了TALEN的特异性及编辑效率，这种新的技术有望在生物及医学领域得到更广泛的应用[24]。
对于其构建复杂的问题，目前已有公司开发出商业化的试剂盒，特别是采用新的克隆技术如GOLDEN GATE CLONING [25]，最快一天左右的时间就可以构建针对一个目标基因特定序列的TALEN核酸酶，不过这种技术使用成本仍然较高。
5. 规律性间隔的短回文序列重复簇(Clustered Regularly Interspaced Short
Palindromic Repeats/CRISPR-Associated Proteins, CRISPR)
如果说FZN和TALEN技术的出现使基因编辑研究获得了很大的成功，那么最近的CRISPR则让这一领域的发展产生了飞跃。CRISPR目前还没有较为统一的中文名称，这里我们将其译为“规律性间隔的短回文序列重复簇”。
实际上早在1987年，日本的研究人员就发现E. coli中存在一些29 bp的重复序列，这些重复序列被一些长度与重复序列类似(32 bp)的但彼此不同的间隔序列(spacer)分开，不过他们当时并不清楚这些序列存在的意义[26]。2002年，Jansen等[27]将这些间隔排列的重复序列命名为CRISPR。直到2007年，CRISPR 和Cas核酸酶才被发现与细菌的适应性免疫有关，并且这种机制在细菌和古细菌中普遍存在[28]。随后的研究显示CRISPR-Cas系统的种类及组成成分较多，但一个来自产脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、由Cas9蛋白组成的CRISPR系统由于其组成简单引起了研究人员的深入探索，该系统只有三个必须的组成部分，即tracrRNA，CrRNA和Cas9核酸酶[6]。
根据Jiang等[29]的研究，CRISPR/Cas9系统发挥作用的基本过程可分为三个阶段，即间隔序列获得期、CRISPR/Cas表达期和DNA干扰期(图3)。在间隔序列获得期病毒或质粒侵染细菌时，病毒或质粒DNA被宿主的核酸酶切割成短的DNA片段，符合条件的切割片段作为protospacers而被整合进宿主基因组的CRISPR基因座中成为新的spacer。CRISPR中已经存在的spacers则是以前外源DNA入侵时留下的“记录”。彼此不同的spacer被重复序列(repeat)隔开。在间隔序列和重复序列附近还存在编码Cas9核酸酶的区域以及转录生成traCrRNA的非编码区。
随后CRISPR/Cas9的表达期内，spacers和repeats序列一起被转录成长链的pre-CrRNA，同时tracrRNA和Cas9也被转录出来(图3)。当tracrRNA与pre-CrRNA中由repeat序列转录形成的区域互补结合形成双链RNA (guide RNA)后，引发双链RNA特异的RNaes III对pre-CrRNA进行剪切形成成熟的CrRNA，这个过程同时还需要Cas9的参与[6]。每个成熟的CrRNA中包含由spacer转录出来的长20
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Figure 3. A cartoon figure of CRISPR components and working model (revised on reference [29])
图3. CRISPR/Cas9组成及工作原理示意图(根据参考文献[29]，有修改)
个核苷酸的引导序列和由repeat转录形成的、与tracrRNA互补的区域，其中引导序列是能与入侵DNA 互补结合的区域。
在DNA干扰期，CrRNA与tracrRNA结合后形成的guide RNA (gRNA)引导Cas9一起与入侵病毒或质粒DNA结合，导致Cas9核酸酶在入侵DNA核苷酸中PAM (核苷酸组成为5’-NGG-3’或5’-NAG-3’)5’端上游3个碱基处对入侵DNA进行双链切割产生断裂，从而破坏入侵DNA使细菌免受侵害[6] [30]。由于PAM的5’端与目标序列(即与引导序列互补的外源DNA区域)的3’端相连，所以切割实际上发生在引导序列结合的范围内。
在CRISPR/Cas9系统对入侵DNA序列的识别过程中，除了gRNA中的引导序列与靶DNA通过碱基配对识别以外，外源DNA序列上的PAM序列也发挥着至关重要的作用[30]，因为外源入侵DNA的PAM 序列诱变后即可躲过CRISPR/Cas9系统的警戒而免受切割[31]。简单地说，PAM是CRISPR/Cas9系统识
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别“自己”或“异己”的策略，因为CRISPR/Cas9操纵子的DNA中虽有能与引导序列配对的spacer序列，但其邻近的repeat序列中无PAM序列，所以CRISPR/Cas9不会对其产生切割。
同时，详细的研究还显示，Cas9蛋白实际上包含与HNH和RuvC这两个内切酶同源的结构域，HNH 结构域特异地切割靶DNA中与CrRNA互补的DNA链，RuvC酶类似的结构域则切割非互补链。诱变这两个区域中的任何一个都会导致Cas9与靶DNA结合后只能产生具有单链切割的环状而非双链断裂的线性DNA分子[6] [32]。不仅如此，Jinek等[6]还发现在引导序列与目标DNA互补结合过程中，远离PAM 的一端能容忍一些碱基的错配，但这种情况可能导致脱靶效应的产生，Hsu等[33]报道在人类细胞系中运用CRISPR/Cas9的确有脱靶现象出现。
针对CRISPR/Cas 9系统这一问题，Ran等[34]对CRISPR/Cas9进行了深入的研究，他们发现，两个适当位移的不同gRNA (即两个不同gRNA与各自的目标序列结合后，它们之间的距离保持在一定范围以内)与Cas9n (突变Cas9的RuvC类似的结构域使之形成只有HNH酶活性的切割酶)一起能在靶DNA上产生双链切割的同时大大降低可能出现的脱靶效应，在培养的鼠受精卵中实验表明这种策略具有良好的应用潜力[34]。这种策略成功的原因可能在于用两个sgRNA的方式相当于将CRISPR/Cas9系统中特异识别序列的长度增加了一倍，因此其识别特异性大大增加。
在高等植物领域，运用CRISPR/Cas9对水稻中不同靶基因的研究表明，约一半的胚细胞中靶基因被该系统进行了编辑，并且在T0代就可以比较容易的获得纯合突变体植株。尤其重要的是其脱靶效应非常低，因此，CRISPR/Cas9是水稻研究的一个有效工具[35]。不仅如此，在高等动物中对灵长类动物进行CRISPR/Cas9基因编辑的研究也表明，通过对单细胞胚进行sgRNA和Cas9的mRNA共同注射，研究人员成功获得了同时对两个靶基因进行了修饰的食蟹猴，并且他们没有检测到脱靶现象的发生[36]，这个结果说明CRISPR技术在医学上有巨大的应用潜力。
此外，研究还发现将转录tracrRNA和CrRNA的DNA编码序列连接在一起，转录后形成一个人工设计的gRNA同样可以有效引导Cas9对靶基因进行编辑[6] [32]。因此，整个CRISPR/Cas9系统使用起来非常简单：只需要根据目标序列设计引物扩增spacer，再将其整合进含有tracRNA和Cas9表达盒的载体，就完成了基因编辑载体的准备工作。此外，为适应真核生物的细胞结构，一般在设计编辑载体时要在Cas蛋白编码序列一端或两端加上核定位信号。目前很多实验室已经构建了专门用于基因敲除的CRISPR/Cas9载体[37] [38]。
6. 结语
人工核酸酶FZN和TALEN都是依靠蛋白质对核苷酸序列的识别，其切割的机制更是直接利用了天然存在的核酸酶的结构域，从原理上说，人工核酸酶和天然存在的限制性核酸内切酶并无本质区别，尤其是天然的II型核酸内切酶多数为同源二聚体结构，所以通常它识别和切割具有回文结构的序列，这一点与人工核酸酶采用的工作原理也有相似之处。那么，天然的限制性核酸内切酶对DNA的识别是否同样依靠锌指结构或TALEN等类似的机制？尽管目前还不清楚，但弄清楚这个问题可能会带来更多新的发现。
有趣的是，与十多年前发现并得到广泛应用的RNAi机制类似，CRISPR/Cas9也是利用短的双链RNA 介导目标基因的沉默[39]。不同的是，RNAi是在转录水平干扰外源入侵基因的表达，而CRISPR/Cas9是破坏外源入侵生物DNA组成和结构从而导致外源基因被彻底破坏。尽管机制存在区别，但它们都是微生物防御体系的重要组成部分。由此可见，短的双链RNA在生物的防御体系中扮演着极其重要的角色[29]。
然而，目前发现细菌中大约只有40%的种类存在CRISPR这种防御机制，因此研究具备和不具备CRISPR 体系的细菌的防御策略有何不同也是一个值得深入关注的问题。
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对比人工核酸酶和CRISPR/Cas9系统可以发现，CRISPR/Cas9的优势主要体现在两个方面：一是用于基因敲除的CRISPR载体构建极其简单，只需要根据推荐的序列合成spacer并将其整合进载体，就完成了基因编辑载体体外的操作过程；二是CRISPR/Cas9与DNA靶序列结合有更高的特异性[40]，原因是FZN和TALEN对靶DNA的识别是依靠蛋白质与DNA的相互作用(实际上是组成蛋白质的氨基酸残基在空间结构上与DNA碱基侧链基团之间的相互作用)，其特异性相对较低；而CRISPR/Cas9系统对靶DNA 序列的识别则是RNA和DNA按照碱基互补配对原则进行的，因此特异性更高。除此之外，相对于同源重组，CRISPR不仅有更高的效率，适应范围也更加广泛。目前的研究表明该技术适合从原核生物到高等动植物在内的所有生物类群，而且，对CRISPR的酶切基团进行诱变后可以对DNA进行单链切割以及可以同时进行多基因或单基因的多靶点编辑[34]。
对生物学领域的研究者来说，CRISPR的优势在于它能非常方便的对感兴趣的基因进行编辑使之产生突变，从而极大的方便了阐明每个基因的功能。然而，医学领域的专家更关注运用该技术进行基因治疗的潜力。尽管目前还只是处于初始阶段，但可以预料，CRISPR将给生命科学和医学领域带来难以估量的重要影响。
基金项目
本研究获得了湖北省自然科学基金指导项目(2015CFC879)、湖北省教育厅B类项目(B20082901)及湖北民族学院博士启动基金项目(MY2014B008)资助。
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基因编辑技术的方法、原理及应用
Hans Journal of Biomedicine 生物医学, 2015, 5, 32-41 Published Online July 2015 in Hans. https://www.360docs.net/doc/0214159886.html,/journal/hjbm https://www.360docs.net/doc/0214159886.html,/10.12677/hjbm.2015.53005 Methods, Principles and Application of Gene Editing Yuchang Zhu1, Xiaojiang Zheng1, Yibing Hu2* 1School of Biological Science and Technology, Hubei University for Nationalities, Enshi Hubei 2College of Resources & Environmental Sciences, Nanjing Agricultural University, Nanjing Jiangsu Email: *huyb@https://www.360docs.net/doc/0214159886.html, Received: Jul. 1st, 2015; accepted: Jul. 24th, 2015; published: Jul. 27th, 2015 Copyright ? 2015 by authors and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY). https://www.360docs.net/doc/0214159886.html,/licenses/by/4.0/ Abstract Fast development of gene editing technologies provides more powerful tools for gene function analysis. Now researchers can easily manipulate targeted gene with the Zinc Finger Nuclease (FZN), Transcription Activation Like Effector Nuclease (TALEN) and Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated proteins (CRISPR) technologies emerged in the last dec-ade. These technologies revolutionized gene functional analysis and medical treatment. In this re-view, several typical gene editing technologies were listed, and their principles, characteristics and application were discussed. Keywords Gene Editing, Methods, Principles, Application 基因编辑技术的方法、原理及应用 朱玉昌1，郑小江1，胡一兵2* 1湖北民族学院生物科学与技术学院，湖北恩施 2南京农业大学资源与环境科学学院，江苏南京 Email: *huyb@https://www.360docs.net/doc/0214159886.html, 收稿日期：2015年7月1日；录用日期：2015年7月24日；发布日期：2015年7月27日 *通讯作者。
高中生物 第一章 基因工程 第2课时 基因工程的原理和技术学案 浙科版选修3
第2课时基因工程的原理和技术 知识内容要求考情解读 基因工程的原 理和技术 b 1.简述基因工程的原理。 2.概述基因工程基本操作的几个步 骤。 一、基因工程的原理 1．基本原理 让人们感兴趣的基因(即目的基因)在宿主细胞中稳定和高效地表达。 2．变异类型 基因工程属于可遗传变异中的基因重组。 归纳总结(1)在基因工程中，不同DNA链的断裂和连接产生DNA片段的交换和重新组合，形成了新的DNA分子，在这个操作中交换了DNA片段，故属于基因重组。 (2)基因工程中的基因重组不同于减数分裂过程中的基因重组。前者属于无性生殖中的重组，并发生在不同种生物间，打破了物种间的界线，可以定向地改造生物的遗传特性，此操作均在细胞外进行。 例1科学家用纳米技术制造出一种“生物导弹”，可以携带DNA分子。把它注射入组织中，可以通过细胞的内吞作用进入细胞内，DNA被释放出来，进入到细胞核内，最终整合到细胞染色体上，成为细胞基因组的一部分，DNA整合到细胞染色体中的过程属于( ) A．基因突变B．基因重组 C．基因互换D．染色体畸变 答案 B 解析基因突变是基因内部结构的改变；染色体畸变是以染色体作为研究对象，探讨染色体结构和数目的变化；基因工程是将外源基因导入受体细胞，得到人们所需要的产物，属于基因重组。 例2下列叙述符合基因工程基本原理的是( ) A．B淋巴细胞与肿瘤细胞融合，杂交瘤细胞中含有B淋巴细胞中的抗体基因 B．将人的干扰素基因重组到质粒后导入大肠杆菌，获得能产生人干扰素的菌株 C．用紫外线照射青霉菌，使其DNA发生改变，通过筛选获得青霉素高产菌株 D．自然界中天然存在的噬菌体自行感染细菌后其DNA整合到细菌DNA上 答案 B 解析基因工程是在生物体外，通过对DNA分子进行人工“剪切”和“拼接”，对生物的基
基因编辑技术最新进展
基因编辑技术最新进展 人体内已命名的基因共有25000多条，目前已知一部分基因（3000）的突变会引起各类疾病。对于此类疾病的治疗，最本质的手段是通过一些方法将突变后的遗传物质矫正回原来的状态。这类方法被称为遗传疗法（genetic therapies）。目前最广泛的遗传疗法手段为：1. 以病毒载体感染方式引导的源基因导入；2. 以RNA干扰方式引导的目的基因表达下调。这些手段在治疗严重复合型免疫缺陷疾病（SCID）以及Wiskott-Aldrich综合征方面获得了成功。尽管如此，RNAi 技术在应用的广泛性上还存在局限。 基因编辑技术（genome editing technologies）是针对DNA本身进行的操作手段。最近应用型基因编辑领域的"鼻祖"，美国麻省理工学院张锋教授等人发表在《Nature Medicine》杂志上的一篇综述详细介绍了这些技术的原理以及在临床上的应用前景。 基因编辑技术的基本原理
归巢酶，ZFN，TALEN以及CRISPR/cas9四种核酸内切酶均能够特异性地识别与切割特定的DNA序列，引起DNA双链断裂（DSB）。根据其识别方式的不同可以分为：蛋白质与DNA的识别与切割，包括归巢酶，ZFN，TALEN； RNA与DNA的识别与蛋白质介导的切割，即CRISPR/cas9。在特异性方面，归巢酶具有一个较大的DNA识别结构域，此结构同时负责DNA的切割；ZFN与TALEN是由多个酶亚基组成的复合体，分别具有特异性识别DNA的能力与 DNA内切活性。在应用方面，归巢酶及ZFN需要通过人工突变的方式构造切割不同DNA序列的工程酶，LALEN则需要复杂的分子克隆达到此目的。与之不同，在CRISPR/cas9系统中，可以通过简单的sgRNA的变化达到切割不同的基因片段的目的。切割完成后，目的位点会出现双链断裂（DSB）的结果并引起生物体的主动修复。NHDJ修复以另外一条未被切割的DNA链为模板，从而保证修复结果的准确。在反复不断地断裂-修复过程中，容易在切割位点造成插入或缺失突变，这样就达到了造成基因紊乱的目的。另外，研究人员利用HDR的修复机制可以人为制造想要得到的突变结果，从而达到基因修复的效果。 基因编辑疗法简介 基因编辑在疾病治疗方面的应用模式主要为：矫正/沉默有害突变，插入保护性突变，加入治疗性基因以及敲除病毒DNA。对于突变引起的有害基因的活化，可以通过简单的沉默或敲除的方式达到治疗的目的，如亨廷顿氏舞蹈症（一种显性突变引起的家族性遗传病），但是对于突变引起的正常基因的失活，则需要通过HDR的方式对目的序列进行编辑，使其恢复到原有的健康状态，如泰萨氏病（一种隐性基因突变引起的遗传性疾病）。 基因编辑的效率 基因编辑的效率受到编辑方式，细胞类型，位点序列等多个因素的影响。总体上来讲，NHEJ要比HDR效率更高。对于我们更关心的HDR方式，主要受到4个因素的影响：1，修饰的本质，如改变的序列幅度；2，其识别特异性的干扰，如
基因操作原理
（这份材料根据老师给的PDF课件整理，仅供参考） 第一章 编码产生一种有生物学功能产物---蛋白质（多肽）或RNA所需信息的一段DNA称基因。Include: 1.编码蛋白质肽链或RNA所必需的核苷酸序列(open reading frame) 2.保证转录所必须的调控序列(S-D) 3. 5’-和3’-非翻译序列(leader and trailer) 4.内含子(intron) Recombinant DNA（重组DNA）：是将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。 这项技术可概括为∶分、切、连、转、选。 两个最基本的特点是分子水平上的操作和细胞水平上的表达。 基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。 Genetic Engineering（基因工程）重组DNA技术与基因工程的基本用途分离、扩增、鉴定、研究、整理生物信息资源大规模生产生物活性物质设计、构建生物的新性状甚至新物种大规模生产生物活性物质工程细胞。 Development of gene engineering： 第一代基因工程蛋白多肽基因的高效表达经典基因工程 第二代基因工程蛋白编码基因的定向诱变蛋白质工程 第三代基因工程代谢信息途径的修饰重构途径工程 第四代基因工程基因组或染色体的转移基因组工程 第二章 目的基因的获得（DNA的准备） 1.从基因组直接获得 2.RT-PCR 方法获得 3.人工合成法 DNA抽提的基本原理 ?1 获得细胞，裂解细胞 三种破壁、膜的方法比较：非离子型去污剂法较温和．适用于抽提10kb左右的质粒；而煮沸法与碱性SDS法相对较剧烈．只能抽提小于10kb的质粒，当然在熟练方法的前提下，碱性SDS法也能抽提较大的质粒。非离子型去污剂的变性能力较弱，常用的TritonX—100等，常用的离子型去污别是SDS。在选择去污剂类型对应根据变性剧烈程度的要求而定。 2 分离（质粒DNA与染色体DNA的分离） 3 纯化（去除RNA） ?RNA与DNA相比在化学及生化性质上有差别，因此可选用RNA酶处理．以保留DNA分子而专门分解RNA。 3 纯化（去除蛋白） ?常用的去除蛋白质的试剂有酚、酚／氯仿、氯仿／异戊醇。 PCR的基本原理：变性、复性、半保留复制 PCR三步曲：1. DNA热变性90～97℃ 2. 引物退火45～55℃ 3. 引物延伸72℃左右
最新基因操作原理
基因操作原理
《基因操作原理》课程教学大纲 课程编码：13019课程名称：基因操作原理 课程英文名 称： Princeples of Gene Manipulation 先修课程：生物化学、遗传 学、分子生物学 等 适用专业：生物技术生物科学 总学时：56 讲课学时 56 实验学时 0 实习学时 0 总学分：3.5 一、课程性质、地位和任务 “基因操作原理”是伴随着生物学尤其是分子生物学的飞速发展而兴起的一门新学科。重点介绍基因操作中的工具酶及其种类、活性和用途；质粒载体、λ噬菌体载体和表达载体等的基本构成、种类和用途；重组DNA导入细菌和真核细胞的方法；DNA、RNA和蛋白质的分离及检测技术；定点诱变技术； PCR技术原理及其应用；cDNA文库和基因组文库的构建；分子杂交原理和技术； DNA序列分析的原理，通过Internet进行序列分析处理以及数据的获取。本门课程开设的指导思想在于使学生在掌握一般生物学以及分子生物学知识的基础上，掌握DNA重组，转移、表达和检测等技术的基本概念和基本原理，为日后从事基因工程和分子生物学研究打下技术操作方面的理论基础。”分子克隆技术”是与本课程配套的实验课程。 二、课程基本要求 能对以基因克隆和表达为主线的基因操作自行设计技术路线，要求学生随着科学研究和技术的发展，及时掌握新的知识和方法。 本课程涉及到生物学的一些重要课程，如：普通生物学、生物化学、微生物学、遗传学和分子生物学，因此要学生选修这些课程之后，再选修本课程。如果能做到理论与实验并至，将能巩固所学知识。重点要求学生掌握在核酸水平上进行研究的基本方法。 三、教学内容及安排 绪论：基因操作的理论基础（2学时） 本章重点与难点: 掌握与基因操作有关的基本概念 0.1基因的概念 0.1.1 什么是基因 0.1.2基因与其产物的共线性及非共线性 0.1.3 基因的重叠与可变性
基因编辑技术简介
基因编辑技术学习总结 CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats）是在细菌中发现的适应性免疫反应系统，能有效抵抗噬菌体等对细菌造成的损伤。这项机制被应用于基因编辑，是当前生物学的研究热点。 一、基因编辑技术的发展 基因编辑技术的发展可追溯到1968年I型限制性内切酶的发现，它可以识别DNA并随即剪切DNA，但由于不具有特异性而不能得到应用；1970年后具有识别特异性的Ⅱ型限制性内切酶被发现；1981年一种Ⅱ型限制性内切酶，FokI 在黄杆菌中被分离出来，成为了基因研究的重要工具。 FokI不同于一般的Ⅱ限制性内切酶（识别和剪切利用同一结构域，因而难以在保证剪切活性的条件下改变识别域），FokI的含有两个相对独立的结构域，N端为识别域，C端为剪切域；这种特性使得FokI可以通过对识别域的改造对DNA进行定点切割。在这种理论的基础上，发展出了ZFN——锌指核酸酶，TALEN ——转录激活样效应蛋白核酸酶；两种技术都是通过使能够识别DNA序列的蛋白与FokI相连实现基因的特异性切割，其不同在于锌指结构域通过约30个氨基酸对DNA三联体进行识别，而转录激活效应蛋白则是通过34个氨基酸组成的识别单体对不同核苷酸进行识别，因而TALEN的识别效率显著高于ZFN。然而它们都是利用利用蛋白进行DNA识别，并使用相同的剪切蛋白－FokI形成二聚体进行DNA剪切。 CRISPR的不同之处在于它利用RNA进行DNA识别，其识别效率优势显而易见；此外CRISPR技术不需要对识别域和限制性内切酶剪切域进行连接，因而设计简单，编辑高效。 CRISPR技术起源于1987年日本在细菌DNA中发现“重复－居间（spacer）－重复序列”，2002年命名为成簇规律性间隔短回文重复（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）并预测改基因序列与细菌获得性免疫有关，2007年其免疫功能得到证实，并最终于2012年成功运用于基因编辑。 蛋白质、RNA介导的DNA编辑技术都已取得成功。2014年，单链DNA引导的具有核酸内切酶活性的TtAgo蛋白在嗜热菌中被发现。这种DNA指导核酸内切酶是否可以应用于基因编辑技术，韩春雨团队发表文章，利用NgAgo蛋白实现了格DNA引导的基因组编辑，但其实验结果目前依然存在争议。
《基因工程原理与技术》标准答案及评分标准.0001
精品文档 《基因工程原理与技术》标准答案及评分标准 一、名词解释（本大题共5小题，每题2分，总计10分） 限制性内切酶的Star活性：限制性内切酶的识别和酶切活性一般在一定的温度、离子强度、pH 等条件下才表现最佳切割能力和位点的专一性。如果改变反应条件就会影响酶的专一性和切割效率，称为星号（*）活性。 受体细胞：又称为宿主细胞或寄主细胞等，从试验技术上讲是能摄取外源DNA并使其稳定维持的细胞；从试验目的讲是有应用价值和理论研究价值的细胞 T-DNA是农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒上切割下来转移到植物细胞的一段DNA 该DNA片段上的基因与肿瘤的形成有关。 克隆基因的表达：指储存遗传信息的基因经过一系列步骤表现出其生物功能的整个过 程。典型的基因表达是基因经过转录、翻译，产生有生物活性的蛋白质的过程。 a -互补：3 -半乳糖苷酶（B -gal）是大肠杆菌lacZ基因的产物，当培养基中的一种色素元（X-gal ）被3 -gal切割后，即产生兰色。大肠杆菌的3一半乳糖苷酶由1021个氨基酸构成，只有在四聚体状态下才有活性。大肠杆菌lacZ基因由于a区域缺失，只能编码一种在氨基端截短的多肽，形成无活性的不完全酶，称为a受体；如果载体的lacZ 基因在相反方向缺失，产生在羧基端截短的多肽，这种部分3 -半乳乳糖苷酶也无活性。 但是这种蛋白质可作为a供体。受体一旦接受了供体（在体内或体外），即可恢复3 -半乳糖苷酶的活性，这种现象称为a互补. 由载体产生的a供体能够与寄主细胞产生 的无活性的a受体互作形成一种八聚体，从而恢复3 -半乳糖苷酶的活性。如果培养基 中含有X-gal的诱导物IPTG时，凡是包含有3 -半乳糖苷酶活性的细胞将转变为蓝色，反之不含有这种酶活性的细胞将保持白色。 、填空题（本大题共7小题，每空1分，总计20 分） 1、质粒按自我转移的能力可分为—接合型—质粒和—非接合型—质粒；按复制类型可分为松 弛性质粒和严紧型质粒。 2、为了防止DNA的自身环化，可用碱性磷酸酶除去双链DNA 5'—端的磷酸基团 。 3、人工感受态的大肠杆菌细胞在温度为_0匸—时吸附DNA在温度为_42乜__ 时摄人 DNA 4、仅克隆基因（DNA片段）用途而言，最简单的质粒载体也必需包括三个组成部分： 复制区：含有复制起点__、选择标记：主要是抗性基因 ________ 、__克隆位点：便于外源_ DNA的插入_。另外，一个理想的质粒载体必须具有低分子量。 5、Southern blotting 杂交能够检测外源基因是否整合进受体细胞基因组；外源基 因的转录表达需要通过—northern_杂交或_ RT-PCR_来揭示；而外源基因_____ 翻 译—水平的表达则需通过免疫学检测或Western杂交才能揭示，其使用的探针是 —蛋白质____ 。 6、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位有—细胞质_、_ —周质_、一细胞外 _。 7、Vir区基因的激活信号有三类，它们是—酚类化合物_、_中性糖和酸性糖_、— _ pH 值_。 简答题（本大题共7 小题，总计50 分） 1欢迎下载
基因操作原理名词解释
第一章 1. Gene manipulation 基因操作。将在细胞外产生的核酸（物质）分子插入到病毒，质粒或其它载体系统中，再整合到特定的宿主中，从而形成一种新的可连续繁殖的有机体。 2. Interrupted genes 间断基因。序列中间插入有与氨基酸编码无关的DNA 间隔区，使一个基因分隔成不连续的若干区段。我们称这种编码序列不连续的基因为间断基因。 3 .Promotor 启动子。DNA 分子可以与RNA 聚合酶特异结合的部位，也就是使转录开始的部位。4. Subcloning 亚克隆。当初始克隆中的外源DNA 片段较长，含有许多目的基因以外的DNA 片段时，在诸如表达、序列分析和突变等操作中不便进行，将目的基因所对应的一小段DNA 找出来，这个过程叫“亚克隆”。 第二章 1.Restriction and modification 限制和修饰。宿主特异性地降解外源遗传物质（DNA）的现象称为限制。外源遗传物质通过甲基化等作用避免宿主的限制作用称为修饰。 2. Matched ends 匹配末端。识别位点为回文对称结构的序列，经限制酶切割后，产生的相同的，互补的末端称为匹配粘端，亦即粘性末端（cohesive end）。 3. Blunt ends 平末端。在回文对称轴上同时切割DNA 的两条链，产生的没有碱基突出的末端称为平末端。 4. Isoschizomer ：同裂酶。识别相同序列的限制酶称同裂酶，但它们的切割位点可能不同。 5. Isocaudiners ：同尾酶。来源不同、识别序列不同，?但产生相同粘性末端的酶。 6.Site preferences ：位点偏爱。某些限制酶对同一介质中的不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率的现象称为位点偏爱。 7.Star activity 星星活性。在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星星活性。 8. Nicking enzyme 切口酶。有些限制酶只切割双链DNA 中的一条链，产生单链缺口，这种酶称为切口酶。 9. Klenow fragment Klenow 片段。Klenow DNA 聚合酶是E.coli DNA polymerase 经蛋白酶（枯草杆菌蛋白酶）裂解而从全酶中除去5'--3' 外切活性的多肽大片段，而聚合活性和3'--5' 外切活性不受影响。 10 .Sequenase 测序酶。是改造的T7 噬菌体DNA 聚合酶，切除了99% 以上的3'--5' 外切活性。Sequenase Version2 切除了所有的3'--5' 外切活性，用于双脱氧链终止法对长片段进行测序。 11.Reverse transcriptase 反转录酶。即依赖于RNA 的DNA 聚合酶，它有5'--3' 合成DNA 活性，但是无3'--5' 外切活性。它来自AMV （禽成髓细胞瘤病毒）或Mo-MLV （Moloney 鼠白血病病毒，又称M-MuLV）。 12. Terminal transferase 末端转移酶。来源于小牛胸腺，是存在于前淋巴细胞及分化早期的类淋巴样细胞内的一种不寻常的DNA 聚合酶，在二价阳离子存在下，末端转移酶催化dNTP 加于DNA 分子的3' 羟基端。若dNTP 为T 或C ，此二价阳离子首选钴离子；若dNTP 为A 或G，此二价阳离子首选镁离子。 13. Ligase 连接酶。催化DNA 5' 磷酸基与3' 羟基之间形成磷酸二酯键，将两段核酸连接起来的酶。 14. T4 polynucleotide kinase T4 多核苷酸激酶。催化ATP 的γ-磷酸基转移至DNA 或RNA 的5' 末端。 15. Alkaline phosphatase 碱性磷酸酶。主要来源于牛小肠（Calf intestinal alkaline phosphatase），简称CIP 或CIAP，也有来自细菌（BAP）。催化除去DNA 或RNA 5' 磷酸。 16. S1 nuclease Sl 核酸酶。来源于米曲霉（Aspergillus oryzae），可降解单链DNA 或RNA ，产生带5' 磷酸的单核苷酸或寡核苷酸双链；对dsDNA ，dsRNA ，DNA:RNA 杂交体不敏感。
基因工程原理(徐晋麟) 课件归纳总结要点
第一章基因工程的分子生物学基础 1、基因工程（遗传工程、基因操作、重组DNA技术等）：细胞外用各种方法产 生的核酸分子插入载体分子中，形成遗传物质的新组合，最终整合掺入到本来不含这些核酸分子的宿主生物中，并进行复制繁衍。 基因工程诞生的理论基础：①DNA双螺旋模型；②基因是可以转移的；③操作子模型的建立；④遗传密码子的破译。 基因工程的技术基础：①工具酶（DNA连接酶、内切酶、反转录酶）；②PCR 技术；③载体技术；基因转移技术。 2、DNA复制：①两条互补的反向平行的DNA单链之间由众多氢键连接（G-C、 A-T）形成稳定DNA双链分子；②DNA合成的起始需要引物提供3，羟基，DNA聚合酶按照5→3方向合成DNA。 3、限制性内切酶： I类酶II类酶III类酶 酶分子三亚基双功能内切酶与甲基化酶分 离 二亚基双功能识别位点二分非对称序列4-8bp序列，回文结构5-7bp非对称序列 切割位点距识别位点1000bp 在识别位点中或靠识 别位点在识别位点下游24-26bp 限制性反应与甲基化反应互斥分开反应同时竟争 限制作用需要需要不需要 限制酶剪切： 黏性末端：指DNA分子在限制酶的作用下形成的具有互补碱基的单链延伸末端
结构，它们能够通过互补碱基间的配对而重新环化起来。（①5’突出的黏性末端；②3’突出的黏性末端。） ③平末端：两条链上的断裂位置是处在一个对称结构的中心，形成的DNA片段 具有平末端。 产生黏性末端的酶： a、同尾酶：一组来源不同识别序列各异的，但能够切割形成相同粘性末端的核 酸内切限制酶。 b、同裂酶：有一些来源不同的限制性内切酶能识别并切割相同的核苷酸靶序列， 这类酶称为同裂酶。 4、连接酶：能够催化两条双链DNA链之间形成5′，3′磷酸二酯键的酶 ①E. coli DNA 连接酶（只连接粘末端） 利用NAD（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）作为能量供体，主要来源于原核生物。 ②T4 DNA连接酶（粘末端和平末端） 利用ATP作为能量供体，主要来源于真核生物，T4噬菌体也属于此类。 在基因工程的实验中主要用T4 DNA连接酶。 5、核酸的分离纯化：通过各种方法将生物材料破碎，释放DNA（RNA）至溶 液中，去除杂质（如用苯酚萃取蛋白质），再用乙醇沉淀核酸，通过离心，分离纯化核酸，最后用低浓度盐溶液溶解核酸。 细菌DNA的提取：细菌培养物的生长和收集→细胞提取物的制备→从细胞提取物中纯化DNA→DNA取样的浓缩→DNA浓度的测量（A260/A280=1.8）。凝胶电泳：（弱碱性条件）根据DNA或RNA 分子的大小，形状和拓扑结构，将DNA和RNA进行分离的技术。
第一章 基因操作原理的理论基础.
第一节基因操作原理 基因操作（Gene Manipulation）的核心部分为分子克隆（molecular cloning）。由于政府对基因操作有一定的法律约束，大多数国家对此都有一个精确的法律定义。比如在英国将基因操作定义为将在细胞外产生的核酸（物质）分子插入到病毒、质粒或其它载体系统中，再整合到那些本来不含该类物质的宿主中，从而形成一种新的可连续繁殖的有机体。（引自Principles of Gene Manipulation ，Black well Scientific Publications , RW. OLD & SB Primrose , 1985）。强调外源核酸分子（一般情况下都是DNA）在不同宿主中的繁殖，打破自然种的界限，将来自不相关物种的基因放入一个宿主中是基因操作的重要特征。另一个特征是繁殖。 这里所说的基因操作并不是一个法律概念，除了包括基因克隆外，还包括基因的表达、调控、检测和改造等与基因研究相关的内容。 本课程就是为了讲述在核酸水平上对基因进行研究所涉及的方法、技术和策略的原理，主要是基本的、通用的原理，对于涉及到具体的学科或领域的原理不在此范围内。 基因操作原理在生物学科发展中具有重要地位。这门课以前叫“分子克隆Ⅰ”，“分子克隆Ⅱ”为实验课。但无论叫什么，本门课程到底要讲些什么，它的地位如何？ 20 世纪是生物学发展最为迅速的时期，1953年由于认识了DNA 的双螺旋结构，从而揭开了分子生物学研究的热潮。在整个生物学研究进程或研究层次来说，其发展过程涉及到个体、组织器官、细胞、亚细胞水平，同时由于遗传学的兴起与发展，DNA 作为生命遗传信息的物质基础被确定下来，从而导致分子生物学的诞生。 分子生物学严格来说应是从分子水平或核酸水平上进行研究的生物学，研究生物的生物学现象和本质，如DNA的结构、复制、表达、调控、遗传、变异等。由于分子生物学的进一步发展，生物学的各个分枝学科都延伸到了分子水平，在这种情况下，传统分子生物学就是一个包罗万象的学科，大的可以说动、植、微生物的分子生物学，小的可以说某些物种的分子生物学，如水稻的分子生物学、链霉菌的分子生物学、芽胞杆菌的分子生物学。 在这种情况下，传统的分子生物学就好象是高级生物化学，阐述基因或者说 DNA（核酸）的静态和动态化学本质。目前的分子生物学，朝着发育、结构和遗传生物学的方向发展。如果说传统的分子生物学是静态分子生物学的话，那么这些学科可以说是动态分子生物学，即在分子水平（核酸）上，研究生物的生长、分化、死亡以及遗传和变异的内在规律。 在以上这些研究中，均涉及在DNA 水平的操作，本门课程就是要讲述这相关的原理，为分子生物学的研究服务。通过分子生物学内在的原理，如 DNA 结构、复制、转录、表达、调控等，讲述研究方法和技术的设计原理。
基因编辑技术简介
基因编辑技术简介-标准化文件发布号：（9456-EUATWK-MWUB-WUNN-INNUL-DDQTY-KII
基因编辑技术学习总结 CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats）是在细菌中发现的适应性免疫反应系统，能有效抵抗噬菌体等对细菌造成的损伤。这项机制被应用于基因编辑，是当前生物学的研究热点。 一、基因编辑技术的发展 基因编辑技术的发展可追溯到1968年I型限制性内切酶的发现，它可以识别DNA并随即剪切DNA，但由于不具有特异性而不能得到应用；1970年后具有识别特异性的Ⅱ型限制性内切酶被发现；1981年一种Ⅱ型限制性内切酶，FokI 在黄杆菌中被分离出来，成为了基因研究的重要工具。 FokI不同于一般的Ⅱ限制性内切酶（识别和剪切利用同一结构域，因而难以在保证剪切活性的条件下改变识别域），FokI的含有两个相对独立的结构域，N端为识别域，C端为剪切域；这种特性使得FokI可以通过对识别域的改造对DNA进行定点切割。在这种理论的基础上，发展出了ZFN——锌指核酸酶，TALEN——转录激活样效应蛋白核酸酶；两种技术都是通过使能够识别DNA 序列的蛋白与FokI相连实现基因的特异性切割，其不同在于锌指结构域通过约30个氨基酸对DNA三联体进行识别，而转录激活效应蛋白则是通过34个氨基酸组成的识别单体对不同核苷酸进行识别，因而TALEN的识别效率显著高于ZFN。然而它们都是利用利用蛋白进行DNA识别，并使用相同的剪切蛋白－FokI 形成二聚体进行DNA剪切。 CRISPR的不同之处在于它利用RNA进行DNA识别，其识别效率优势显而易见；此外CRISPR技术不需要对识别域和限制性内切酶剪切域进行连接，因而设计简单，编辑高效。 CRISPR技术起源于1987年日本在细菌DNA中发现“重复－居间（spacer）－重复序列”，2002年命名为成簇规律性间隔短回文重复（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）并预测改基因序列与细菌获得性免疫有关，2007年其免疫功能得到证实，并最终于2012年成功运用于基因编辑。 蛋白质、RNA介导的DNA编辑技术都已取得成功。2014年，单链DNA引导的具有核酸内切酶活性的TtAgo蛋白在嗜热菌中被发现。这种DNA指导核酸内
基因工程原理与技术思考题
Chapter I Introduction 1)什么是基因基因有哪些主要特点 基因是一段可以编码具有某种生物学功能物质的核苷酸序列。 ①不同基因具有相同的物质基础.②基因是可以切割的。③基因是可以转移的。④多肽与基因之间存 在对应关系。⑤遗传密码是通用的。⑥基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代。 2)翻译并解释下列名词 genetic engineering遗传工程 gene engineering基因工程：通过基因操作，将目的基因或DNA片段与合适的载体连接转入目标生物获得新的遗传性状的操作。 gene manipulation基因操作：对基因进行分离、分析、改造、检测、表达、重组和转移等操作的总称。 recombinant DNA technique重组DNA技术 gene cloning基因克隆：是指对基因进行分离和扩大繁殖等操作过程，其目的在于获得大量的基因拷贝，在技术上主要包括载体构建、大肠杆菌遗传转化、重组子筛选和扩大繁殖等环节。 molecular cloning分子克隆 3)什么是基因工程简述基因工程的基本过程p2 p4 4)简述基因工程研究的主要内容p5 5)简述基因工程诞生理论基础p2和技术准备有哪些p3 6)基因表达的产物中，氨基酸序列相同时，基因密码子是否一定相同为什么 否，密码子简并性 7)举例说明基因工程技术在医学、农业、工业等领域的应用。 医学:人胰岛素和疫苗 农业:抗虫BT农药 工业:工程酿酒酵母 Chapter Ⅱ The tools of trade 1)什么是限制性核酸内切酶简述其主要类型和特点 是一种核酸水解酶，主要从细菌中分离得到。类型特点p11 2)II型核酸内切酶的基本特点有哪些p12-14简述影响核酸内切酶活性的因素有哪些p14
基因编辑基本原理
1 基本介绍 基因编辑技术指能够让人类对目标基因进行“编辑”，实现对特定DNA片段的敲除、加入等。 而CRISPR/Cas9技术自问世以来，就有着其它基因编辑技术无可比拟的优势，技术不断改进后，更被认为能够在活细胞中最有效、最便捷地“编辑”任何基因。 2016年美国间谍首脑发布了一项公开警告，将基因编辑列为潜在的大规模杀伤性武器（WMD）之一。[2] 2 应用技术 这不是CRISPR/Cas9这项明星技术第一次得到人们的关注。在此之前，有着“豪华版”诺奖之称的“2015年度生命科学突破奖”颁发给了发现基因组编辑工具“CRISPR/Cas9”的两位美女科学家——珍妮弗·杜德娜和艾曼纽·夏邦杰。二人更是获得了2015年度化学领域的引文桂冠奖——素有诺奖“风向标”之称，曾被认为是今年诺贝尔化学奖的最有力竞争者。 那CRISPR/Cas9到底是一项什么技术，为何能够获得如此这般青睐，又何以在短短两三年时间内，发展成为生物学领域最炙手可热的研究工具之一，并有近700篇相关论文发表？它将来又会如何影响到我们的生活？ CRISPR/Cas9是继“锌指核酸内切酶（ZFN）”、“类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN）”之后出现的第三代“基因组定点编辑技术”。与前两代技术相比，其成本低、制作简便、快捷高效的优点，让它迅速风靡于世界各地的实验室，成为科研、医疗等领域的有效工具。 3 执行手段 1）基因敲除：如果想使某个基因的功能丧失，可以在这个基因上产生DSB，NHEJ修复的过程中往往会产生DNA的插入或删除（indel），造成移码突变，从而实现基因敲除。2）特异突变引入：如果想把某个特异的突变引入到基因组上，需要通过同源重组来实现，这时候要提供一个含有特异突变同源模版。正常情况下同源重组效率非常低，而在这个位点产生DSB会极大的提高重组效率，从而实现特异突变的引入。3）定点转基因：与特异突变引入的原理一样，在同源模版中间加入一个转基因，这个转基因在DSB修复过程中会被拷贝到基因组中，从而实现定点转基因。通过定点转基因的方法可以把基因插入到人的基因组AAVS1位点，这个位点是一个开放位点，支持转基因长期稳定的表达，破坏这个位点对细胞没有不良影响，因此被广泛利用。
基因工程原理讲义：目的基因的克隆
第九讲目的基因的克隆 中国科学院遗传与发育生物学研究所 2017年8月
目录 一、基因克隆的一般概念 1．基因克隆定义 2．“克隆”的不同含义 3．基因克隆的过程 4．DNA片段的产生与分离 5．基因文库 二、基因克隆与分离的实验策略 1．物理策略 2．生物策略 3．克隆样品的选择 4．基因文库库容测算 三、cDNA基因克隆 1．概述 2．cDNA文库的构建 3．低丰度mRNA之cDNA克隆 4．稀少mRNA的cDNA克隆 5．全长cDNA的合成 6．cDNA克隆的优越性 四、基因组DNA克隆
1．cDNA克隆的局限性 2．基因组DNA克隆的优越性 3．构建基因组文库的载体类型五、基因定位定隆 1．基因定位克隆概述 2．RFLP分子标记 3．RFLP作图原理与步骤 4．染色体步移 5．大尺度物理图谱的构建
目的基因的克隆 一、基因克隆的概念 1．基因克隆的定义 基因克隆亦叫做DNA克隆(DNA cloning)，它是指将外源基因或DNA片段插入到克隆载体的分子上，构成重组的DNA群体，并转化到寄主细胞进行复制和繁殖，以便从大分子DNA或DNA片段混合物中分离纯化目的基因或特定DNA片段的实验操作，叫做基因克隆。严格地说，基因克隆应叫做DNA克隆，因为被克隆的是基因组的全部(理论上)的DNA片段，而并不是所有的DNA片段都编码有基因。 *要注意基因克隆与基因分离两者在概念上的差别！完成了基因克隆并不等于完成了基因的分离！尽管两者之间存在密切的相互关系。因此在日常交谈中或是一般文字叙述中，甚至于某些正式有关文件中，常把“基因克隆”与“基因分离”等同使用，不作区分，是不妥当的。 *有时我们所说的基因克隆，即所谓的“分子克隆”(Molecular cloning)，实质上包含着目的基因的分离与鉴定两个主要的内容，基因克隆的全过程包括如下四个步骤：
浅谈基因编辑技术在农作物领域中的应用与问题探究
现代农业研究 近年来，农作物转基因技术得到了快速发展，将基因编辑技术应用在农作物育种上，能得到多个新的生物品种，尤其在玉米、大豆、棉花等农作物上有着较好应用。转基因技术的应用，一定程度推动了农业领域发展，但是还存在一定安全问题，要想充分利用作物转基因技术，还要注重基因编辑农作物的管理和检测，以便能发挥基因编辑技术在研发新品种上的作用，尽可能提高农作物营养价值。 1基因编辑技术在农作物领域的应用 1.1ZFN 技术 ZFN 主要负责识别和结合特定的核苷酸序列，将ZFN 技术应用到作物育种中，可对植物基因进行重新编辑。锌指核酸酶由锌脂蛋白和核酸酶结构域组成，其中核酸酶结构域对切割点不具有识别特异性，只有在二聚体情况下可使其具备酶活性。因此，需要对任一靶位点设置一对ZFN，以便形成核酸酶二聚体，从而进行DNA 链的切割。有研究学者采用该技术，替换掉烟草中乙酰乳酸酶基因的三个核苷酸点，进而得到抗除草剂的作物[1]。另外，将ZFN 技术应用在玉米作物 中，能合成磷酸酶基因，使得玉米具有抗除草剂性能，同时还能减少玉米中的肌醇六磷酸含量，提高了作物营养品质。尽管当前ZFN 技术在多种植物中取得较好运用，但是由于锌指单元对切割点识别性不高，因此在不同基因改造上的识别差异较大，限制了该技术的广泛使用。 1.2TALEN 技术 该技术是一种基于核苷酸的编辑技术，是由核酸内切酶和DNA 结构域共同组成的，其中DNA 结构域主要是由多个氨基酸序列构成的，重复序列能识别相应的碱基。TALEN 技术运用原理为：结合靶位点两端的序列设置一对TALEN，与识别位点结合后，两个核酸内切酶结合起到形成二聚体，在切割DNA 链后可完成基因编辑。有学者将该技术运用到水稻中，破坏了细菌性病原菌效应蛋白在作物基因组上的位点，进而提高了水稻抗百叶枯病。另外，在这一技术作用下，还能破坏水稻甜菜碱乙醛脱氢酶结合位点，能起到提高水稻品质的作用。而将该转基因技术运用到小麦育种中，能得到抗性较强的小麦，相对于传统育种技术来讲有 浅谈基因编辑技术在农作物领域中的 应用与问题探究 （威海海洋职业学院 264300） 【摘要】随着ZFN 、CPISPR/Cas9等基因编辑技术的发展和运用，大量基因编辑作物生产出来，这种背景下，基因编辑作物的检测及安全成为重点研究问题。本文主要围绕基因编辑技术在农作物领域的应用、针对基因编辑农作物的安全评价监管、基因编辑农作物的检测等方面展开讨论，具体分析了基因编辑技术在农业领域的应用现状，并以保障农作物食用安全为主，加强基因编辑作物有关问题的研究，促进农业领域良好发展。【关键词】基因编辑技术；农作物领域；应用分析 邹丹丹 Discussion on the Application and the Problem of the Gene Editing Technology in the Field of Crop Zou Dandan [Abstract]With the development and application of gene editing technology such as ZFN,CPISPR/Cas9,a large number of gene editing crops have been produced.Under this background,the detection and safe?ty of gene editing crops has become a key research issue.In this paper,the application of gene editing technology in agriculture was analyzed in detail,and the main purpose was to ensure the food safety of crops,to strengthen the research on related problems of gene editing crops,and to promote the good de?velopment of agricultural field. [Keywords]gene editing technology;crop field;application analysis （Weihai Marine V ocational College 264300） 农业经济
基因编辑技术进展
基因编辑技术最新进展 ? 人体内已命名的基因共有25000多条，目前已知一部分基因（3000）的突变会引起各类疾病。对于此类疾病的治疗，最本质的手段是通过一些方法将突变后的遗传物质矫正回原来的状态。这类方法被称为遗传疗法（genetic therapies）。目前最广泛的遗传疗法手段为：1. 以病毒载体感染方式引导的源基因导入；2. 以RNA干扰方式引导的目的基因表达下调。这些手段在治疗严重复合型免疫缺陷疾病（SCID）以及Wiskott-Aldrich综合征方面获得了成功。尽管如此，RNAi 技术在应用的广泛性上还存在局限。 ? 基因编辑技术（genome editing technologies）是针对DNA本身进行的操作手段。最近应用型基因编辑领域的"鼻祖"，美国麻省理工学院张锋教授等人发表在《Nature Medicine》杂志上的一篇综述详细介绍了这些技术的原理以及在临床上的应用前景。 ? 基因编辑技术的基本原理
? 归巢酶，ZFN，TALEN以及CRISPR/cas9四种核酸内切酶均能够特异性地识别与切割特定的DNA序列，引起DNA双链断裂（DSB）。根据其识别方式的不同可以分为：蛋白质与DNA的识别与切割，包括归巢酶，ZFN，TALEN； RNA与DNA的识别与蛋白质介导的切割，即CRISPR/cas9。在特异性方面，归巢酶具有一个较大的DNA识别结构域，此结构同时负责DNA的切割；ZFN与TALEN是由多个酶亚基组成的复合体，分别具有特异性识别DNA的能力与 DNA内切活性。在应用方面，归巢酶及ZFN需要通过人工突变的方式构造切割不同DNA序列的工程酶，LALEN则需要复杂的分子克隆达到此目的。与之不同，在CRISPR/cas9系统中，可以通过简单的sgRNA的变化达到切割不同的基因片段的目的。切割完成后，目的位点会出现双链断裂（DSB）的结果并引起生物体的主动修复。NHDJ修复以另外一条未被切割的DNA链为模板，从而保证修复结果的准确。在反复不断地断裂-修复过程中，容易在切割位点造成插入或缺失突变，这样就达到了造成基因紊乱的目的。另外，研究人员利用HDR的修复机制可以人为制造想要得到的突变结果，从而达到基因修复的效果。 ? 基因编辑疗法简介 ? 基因编辑在疾病治疗方面的应用模式主要为：矫正/沉默有害突变，插入保护性突变，加入治疗性基因以及敲除病毒DNA。对于突变引起的有害基因的活化，可以通过简单的沉默或敲除的方式达到治疗的目的，如亨廷顿氏舞蹈症（一种显性突变引起的家族性遗传病），但是对于突变引起的正常基因的失活，则需要通过HDR的方式对目的序列进行编辑，使其恢复到原有的健康状态，如泰萨氏病（一种隐性基因突变引起的遗传性疾病）。 ? 基因编辑的效率 ? 基因编辑的效率受到编辑方式，细胞类型，位点序列等多个因素的影响。总体上来讲，NHEJ要比HDR效率更高。对于我们更关心的HDR方式，主要受到4个因