细胞培养中的黑胶虫问题

1.我们实验室最近一次的情况:

我们前后从上海细胞中心买了三批细胞，细胞刚到的时候，观察均生长良好，密度适中，培养液清亮，也没有见小黑点，但是对细胞传代以后就陆续出现多少不等的小黑点，有时候在一夜之间暴长，给培养液加庆大霉素，也无济于事，对贴壁细胞用生理盐水及D-hanks液冲洗七遍后见减少，但是随后几天又出现，刚开始怀疑操作有问题，但是由有经验的老师操作也出现这种问题，陆续对培养液，血清及胰酶进行培养也没发现问题。

同时培养箱也有本实验室保存的3t3细胞进行培养，生长快，很快铺满，仔细观察也可以见到少量的黑点。

后来还有从军科院过来的Hela细胞，没有使用我们的血清，直接吸出多余的培养液后，进行培养，传代后用原来吸出的培养液进行培养，同样发现了问题。

可以发现如下的特点：

（1）与细胞共生，细胞长的好或密度大的话，小黑点就少，反之则多；

（2）对抗生素无效；

（3）可能通过培养箱空气进行污染；

（4）单用培养液及血清培养没发现问题。

（5）换掖冲洗后也无效。

以下是论坛里我找来的相关帖子内容

“黑胶虫”是近十几年才发现的一种细胞污染物，“黑胶虫”的分类目前尚无鉴定确认。“黑胶虫”可寄生于动物细胞，也可以生存于培养基中，依靠细胞和培养基中的营养为生，并随细胞传代而传代。“黑胶虫”与细胞竞争性生长，开始时对细胞并没有什么影响，但当黑胶虫的数量多到一定程度的时候，细胞生长就会受到影响直至死亡，严重影响了科研活动的开展和进行。所以“黑胶虫”的污染常在培养条件改变、细胞接种密度降低、细胞状态不佳时显现并使实验中断，尤其在冻存细胞复苏时可造成大量细胞死亡。

目前比较公认的观点认为“黑胶虫”是一种微生物，增殖缓慢但对细胞有损害，数量达到一定程度可引起细胞死亡，其来源可能是细胞本身的污染或从动物取材时污染造成的。该污染在全世界细胞实验室中普遍存在，解决该问题是一个世界性难题

关于是什么的问题的讨论

A. 玻璃培养瓶中的类似氧化硅的东西（曾经有文献报道过）

B. 据说这是黑胶虫，又有人说是原生动物，好象也没个统一的说法

C. 据病毒所和军科院鉴定是一种寄生于牛血清内的一种原虫，似乎和草履虫和变形虫有类似之处，然而由于课题经费不够而不能继续进行下去。

D. 有人说是纳米级的细菌

其他的特点

（1）形态上有些像细菌，直径约在0.5~1微米，

（2）在400X倒置显微镜小，有典型的布朗运动（不规则的原地小距离抖动）。

（3）细胞内好像也有存在，

（4）但并不引起培养液混浊

（5）时间稍长，细胞状态明显恶化，并最后死亡

大家的处理：

1.换好一点的血清（我觉着和血清的关系不大）。

2.如果是贴壁细胞的话，可用无菌的PBS洗几次，可一定程度上缓解。若是悬浮的话，就不太好处理拉，可以向其中少加一点滋养细胞（从小鼠腹腔内取的巨噬细胞，这种细胞不分裂，过一阵就死掉了，做抗体杂交瘤融合的同志肯定知道）。加滋养细胞对有黑胶虫的刚复苏的细胞很有效！还有就是实验环境要注意好，保持细胞间整个环境的洁净度。

3.换用进口的一次性塑料培养瓶。

4.建议清理无菌室所有物品，重新灭菌，用KMnO4熏蒸，按首次使用无菌室做，细胞重新复苏，。

5. 在换液前先加入生理盐水并轻轻拍打，冲洗干净后再加入培养液，坚持天天洗，传代时加生理盐水再离心一次，接种密度稍大一些，一段时间后，虫子就会大大减少，对细胞的生长也不会有大的影响。

6.有材料称minocycline具有一定的作用，可以和换液结合起来使用。

杀灭黑胶虫的一种方法

估计养细胞者，很多人遇到过所谓的“黑胶虫”。最近养细胞，不幸的是，也中奖了，看到培养瓶里仿佛一夜之间冒出来的密密麻麻的小黑东西，真是有苦难言，因为曾在园子里看过有关“黑胶虫”的帖子，不好对付，没有有效的杀灭方法，据说有专杀培养基，但又有什么好的方法可以消除实验室和培养箱内的污染呢？紫外照射、甲醛高锰酸钾熏蒸------这些方法不知其对“黑胶虫”的确切效果，有些对人有毒害，有没有一种方法，即能杀死“黑胶虫”，对人的毒性又较小呢？我想到了试试新洁尔灭（苯扎溴铵）是否可以，新洁尔灭是外用皮肤消毒剂，我们实验室常规用来擦洗手及工作台面的。

首先说明这种东西在低倍下呈黑色点状，在高倍下呈杆状，确实是在不停地运动的，有些战友不相信它会动，也有人不相信有这种所谓的“黑胶虫”，只要静下心来仔细盯住一点，你就会能注意到它确实在运动，我也录了一段相，足以可以证明，太大，160多M。

题目：杀灭、处理黑胶虫的一种新方法

目的：找到一种高效且低或无毒的杀灭处理“黑胶虫”的方法。

方法：取有“黑胶虫”污染的六孔板，每孔内有2ml培养液，向有污染的孔内分别加入0.5ml、1ml、2ml、3ml的新洁尔灭原液，边加边在倒置显微镜下观察。

结果：加入新洁尔灭时，培养液内逐渐变得有些混浊，且会有絮状的东西形成（肉眼看是白色的），这实际上是由“黑胶虫”聚集而成（见下面的图），约2-3分钟后，“黑胶虫”慢慢停止了运动。为了进一步观察其效果，把六孔板放入37度培养箱继续培养，第二天观察发现：有些仍成团絮状但不会动；有些贴在瓶壁上也不会动；有些已由杆状变成了圆球状，象是发生了水肿一样，更不会动了，估计“黑胶虫”已死亡。这几种剂量的新洁尔灭效果是一样的。

结论：新洁尔灭与水或培养基的比例为1：4时即可杀死“黑胶虫”（更低的浓度没有试，当时杀虫心切，就想多用点，反正也不贵，一瓶新洁尔灭才7块多钱）。可以喷洒或擦洗用于实验室或培养箱内消毒；若细胞不珍贵且不想要了，也可以用来杀灭其中的“黑胶虫”。若细胞珍贵，不要轻易尝试，除非你不想要了；你试了，本人概不负责

细胞培养中的黑胶虫问题

细胞培养中的黑胶虫问题 1.我们实验室最近一次的情况: 我们前后从上海细胞中心买了三批细胞，细胞刚到的时候，观察均生长良好，密度适中，培养液清亮，也没有见小黑点，但是对细胞传代以后就陆续出现多少不等的小黑点，有时候在一夜之间暴长，给培养液加庆大霉素，也无济于事，对贴壁细胞用生理盐水及D-hanks液冲洗七遍后见减少，但是随后几天又出现，刚开始怀疑操作有问题，但是由有经验的老师操作也出现这种问题，陆续对培养液，血清及胰酶进行培养也没发现问题。同时培养箱也有本实验室保存的3t3细胞进行培养，生长快，很快铺满，仔细观察也可以见到少量的黑点。后来还有从军科院过来的Hela细胞，没有使用我们的血清，直接吸出多余的培养液后，进行培养，传代后用原来吸出的培养液进行培养，同样发现了问题。可以发现如下的特点：（1）与细胞共生，细胞长的好或密度大的话，小黑点就少，反之则多；（2）对抗生素无效；（3）可能通过培养箱空气进行污染；（4）单用培养液及血清培养没发现问题。（5）换掖冲洗后也无效。以下是论坛里我找来的相关帖子内容 “黑胶虫”是近十几年才发现的一种细胞污染物，“黑胶虫”的分类目前尚无鉴定确认。“黑胶虫”可寄生于动物细胞，也可以生存于培养基中，依靠细胞和培养基中的营养为生，并随细胞传代而传代。“黑胶虫”与细胞竞争性生长，开始时对细胞并没有什么影响，但当黑胶虫的数量多到一定程度的时候，细胞生长就会受到影响直至死亡，严重影响了科研活动的开展和进行。所以“黑胶虫”的污染常在培养条件改变、细胞接种密度降低、细胞状态不佳时显现并使实验中断，尤其在冻存细胞复苏时可造成大量细胞死亡。目前比较公认的观点认为“黑胶虫”是一种微生物，增殖缓慢但对细胞有损害，数量达到一定程度可引起细胞死亡，其来源可能是细胞本身的污染或从动物取材时污染造成的。该污染在全世界细胞实验室中普遍存在，解决该问题是一个世界性难题关于是什么的问题的讨论 A. 玻璃培养瓶中的类似氧化硅的东西（曾经有文献报道过） B. 据说这是黑胶虫，又有人说是原生动物，好象也没个统一的说法 C. 据病毒所和军科院鉴定是一种寄生于牛血清内的一种原虫，似乎和草履虫和变形虫有类似之处，然而由于课题经费不够而不能继续进行下去。 D. 有人说是纳米级的细菌其他的特点（1）形态上有些像细菌，直径约在0.5~1微米，（2）在400X倒置显微镜小，有典型的布朗运动（不规则的原地小距离抖动）。（3）细胞内好像也有存在，（4）但并不引起培养液混浊（5）时间稍长，细胞状态明显恶化，并最后死亡大家的处理： 1.换好一点的血清（我觉着和血清的关系不大）。

如何预防细胞培养中的黑胶虫污染

如何预防细胞培养中的黑胶虫污染污染是细胞培养的大敌。预防和避免污染是细胞培养成功的关键之一。一开始就要十分重视，防止污染，否则会前功尽弃，不仅浪费时间，而且浪费人力、物力，甚至造成无法弥补的损失。细胞培养中常见的生物污染类型有7种，分别是细菌污染、支原体污染、原虫污染、黑胶虫污染、真菌污染、病毒污染以及非细胞污染。他们在细胞培养中污染的特点如下： 1、细菌：细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状，根据感染细菌的不同，可有不同的外形，培养液一般会浑浊变黄，对细胞生长影响明显。 2、支原体：黑色的，好象多为多形，培养液一般培养液一般会浑浊，原体感染，国内血清很多都没有做支原体阴性检测，而支原体是牛血清中最常见的微生物之一。而且它不能用过滤的办法除去。支原体感染细胞以后，细胞病变不很明显，只是慢慢死去。 3、黑胶虫：可以穿透滤膜，也可以通过空气传播，低倍下为黑色点状，高倍下可看见黑色的小虫游来游去，培养液也是不浑的，一般不会太影响，细胞还是可以用的。常常是细胞生长状态良好，且观测到的运动物无明显增多，且培养液颜色、透明度无明显变化，可在同一批号的血清养的细胞中发现类似现象。对细胞生长状态不会有明显影响，在细胞增殖旺盛之后会自然消失，除更换血清外无须特殊处理。 4、真菌：一般培养液清亮，不变色，镜下有丝状物，有些真菌开始很像死细胞碎片，只是它很多很多的小块很清楚，象珊瑚状，不象细胞碎片分不清，慢慢的会长出很细的黑色丝状物。真菌生长的比较慢，不象细菌那么容易被发现，但是一旦发现有它的存在细胞就被污染了，也很难救活了。 5、原虫：培养液可轻微浑浊，显微镜下那些细小的点状物数量非常多，轻微活动，细胞虽然可以生长但繁殖速度却明显减慢，而且细胞状态不好，边缘不清楚，细胞不透亮。他们与细胞可共生但会与细胞争夺营养。这种共生是非常普遍的，但他们的数量小，细胞站优势所以不会影响到细胞的正常生长，只有当他们到达一定的数量时就会影响到细胞的生长，最终形成恶性循环。 6、病毒：组织细胞培养过程中，如果没有除去潜在的病毒，就会产生病毒污染。目前，从原代猴肾细胞的培养中已发现不少于20种血清性病毒。尽管病毒污染的细胞不影响原代培养，但生产疫苗是不安全的。因此，潜在病毒是细胞大量生产和疫苗、干扰素等生物制品制作中的难题 7、非同种细胞污染：即是细胞交叉污染，由于细胞培养操作时各细胞株所需的器材和溶液没有严格分开，往往会使一种细胞被另一种细胞污染。目前，世

网上培养caco-2经验总结

上海细胞生物所。还有我们实验室也有，不知道卖不卖。如果需要和我e-mail 联系：hui_anny@https://www.360docs.net/doc/0221527.html, 求助：有谁培养过HepG2细胞和 Caco-2 细胞吗？细胞, 培养, 求助细胞, 培养, 求助欢迎您访问。提示：游客只能阅读部份内容，请注册或者登录后继续浏览全部信息，谢谢！本人第一次养细胞，目标细胞是HepG2细胞和 Caco-2 细胞，现在在查文献，可是有不少东西都不懂，如我在网上找到的Caco-2 细胞的培养基是MEM,20%胎牛血清和NEAA ，这个？没有量啊，到时怎么配呢？请养过这两种细胞的前辈指点经验啊！我在此多多感谢了！ [ 本帖最后由 liushen 于 08-6-16 22:13 编辑 ] 超级版主 3# 发表于 08-6-18 16:19 | 只看该作者 MEM ，胎牛血清，非必需氨基酸欢迎您访问。提示：游客只能阅读部份内容，请注册或者登录后继续浏览全部信息，谢谢！ MEM 是一种细胞培养液，你可以去公司网站去查，有卖的。有现成的MEM 液体，也有MEM 干粉，可以自己去配制。 20%胎牛血清，就是在MEM 液体里面加入胎牛血清至终浓度为20%。 NEAA 是非必需氨基酸吧。我们用的是Gibco 公司的产品，买来的时候是10倍浓度的，用的时候10倍稀释到培养液中即可。我有養過用DMEM+ FBS10% 含PS 0.05% 然後用trypsin 0.25% 去做subculture 就可以了!很好養! Caco-2细胞培养的一点重要经验这个细胞对生长环境的要求非常之高。除了大家熟知的培养液条件的苛刻外（此不详述,又不懂的可留言问）,对生长的空间问题要求比较高。在每一次传代消化的时候,要消化足够长的时间,要不停地在镜下观察细胞的消化状态。这个细胞长的比较厚,所以消化比较困难。需要耐心。而消化的结果应该是保证足够多的细胞都是成单个状态而不是抱团或者成片。对于这一点,常规消化是比较难做到的。所以需要采取点特殊措施,我一般是这样做的：首先吸干净原培养基,加入少量含EDTA 的胰酶（以下简称YE ）润洗,快速润洗完细胞生长面后吸走,然后加入适量的YE （我个人一般较常用量多加0.5-1ml ）,进行充分的消化,保持在镜下适时观察。待较多细胞被消化下来悬浮于消化液中,大部分细胞边缘皱缩变清晰后,用吸管吸出消化液入离心管中加入适量培养基,常规离心5分钟左右,离心完毕倾倒上清,加入新鲜培养基吹打均匀,然后置于新的小培养瓶中培养。原培养瓶中加入培养基吹打,细胞吹下来之后,适当多吹打几次细胞悬液以使细胞单个分离均匀。然后分瓶传代,原瓶加入新培养基继续培养。

细胞污染及处理方法

细胞污染及处理方法总结洁净区,并不就是没有细菌，而就是细菌得数量非常少,国家标准10０级得洁净标准就是浮游菌数不得超过5个每立方米，沉降菌数不得超过1个每培养皿、而国外得标准比我国得还要高一点，要求得数量更少. 所以在我们得洁净操作台里,并不就是真正一个细菌都没有得，所以在操作得时候还就是要尽量利索迅速地完成操作。尽量减少进入培养体系细菌得数量。所以处理细菌污染得重要原则就就是:无限地稀释细菌得浓度,无限地减少细菌得数量! 一、细菌污染培养基:颜色发红,液体清亮或浑浊；显微镜下:有黑点或杆状物在到处游走，细胞部分脱落，出现细胞碎片; 成像：图一：杆菌污染

图二:白色链球菌以下就是摘自丁香园得处理方法： 1）、将污染得培养液倒掉，转烧瓶口,加入１0mlＰBS,适当晃动清洗培养瓶，然后倒掉。转烧瓶口。 2）、继续加入10mｌPBS,同样方法晃动,清洗培养瓶，然后倒掉。 3）、继续加入５ｍlPBS，同样方法洗瓶,主要就是培养面，然后倒掉。 4）、重复步骤3再洗. 5）、重复步骤3再洗。 6）、加入3－5ml双抗，洗瓶,静置3-5分钟,然后吸出。 7）、加入3ｍl双抗,洗瓶,静置3—5分钟，然后吸出。 8）、再加入5mｌPＢS洗瓶,然后吸出。 9）、加入10mｌ培养液,加入2ml双抗,放置培养箱培养,５小时之后，倒掉培养基,加入PBS洗瓶两次,然后加入胰酶消化，吹打后置于离心机8００—１０00r/ｍiｎ离心,然后洗一次。置于新得培养瓶里培养，培养体系加入2ｍl双抗. 10）、24h之后,视情况换液,若仍然污染严重,培养基浑浊，重复以上步骤,若瞧不到污染物,则继续步骤1）、3）、4)、6）、８），然后加入培养液培养，培养体系加入2mｌ双抗、

黑胶虫

干细胞之家- 中国干细胞研究员的交流论坛's Archiver 干细胞之家论坛?实验室综合讨论区?细胞培养中的黑胶虫问题 qingnuanrenxin发表于2010-5-16 12:03 细胞培养中的黑胶虫问题我们实验室最近一次的情况:我们前后从上海细胞中心买了三批细胞，细胞刚到的时候，观察均生长良好，密度适中，培养液清亮，也没有见小黑点，但是对细胞传代以后就陆续出现多少不等的小黑点，有时候在一夜之间暴长，给培养液加庆大霉素，也无济于事，对贴壁细胞用生理盐水及D-hanks液冲洗七遍后见减少，但是随后几天又出现，刚开始怀疑操作有问题，但是由有经验的老师操作也出现这种问题，陆续对培养液，血清及胰酶进行培养也没发现问题。同时培养箱也有本实验室保存的3t3细胞进行培养，生长快，很快铺满，仔细观察也可以见到少量的黑点。后来还有从军科院过来的Hela细胞，没有使用我们的血清，直接吸出多余的培养液后，进行培养，传代后用原来吸出的培养液进行培养，同样发现了问题。黑焦虫的特点： 1、与细胞共生，细胞长的好或密度大的话，小黑点就少，反之则多。 2、对抗生素无效。 3、可能通过培养箱空气进行污染。 4、单用培养液及血清培养没发现问题。 5、换掖冲洗后也无效。以下是论坛里我找来的相关帖子内容。“黑胶虫”是近十几年才发现的一种细胞污染物，“黑胶虫”的分类目前尚无鉴定确认。“黑胶虫”可寄生于动物细胞，也可以生存于培养基中，依靠细胞和培养基中的营养为生，并随细胞传代而传代。“黑胶虫”与细胞竞争性生长，开始时对细胞并没有什么影响，但当黑胶虫的数量多到一定程度的时候，细胞生长就会受到影响直至死亡，严重影响了科研活动的开展和进行。所以“黑胶虫”的污染常在培养条件改变、细胞接种密度降低、细胞状态不佳时显现并使实验中断，尤其在冻存细胞复苏时可造成大量细胞死亡。目前比较公认的观点认为“黑胶虫”是一种微生物，增殖缓慢但对细胞有损害，数量达到一定程度可引起细胞死亡，其来源可能是细胞本身的污染或从动物取材时污染造成的。该污染在全世界细胞实验室中普遍存在，解决该问题是一个世界性难题关于是什么的问题的讨论： 1、玻璃培养瓶中的类似氧化硅的东西（曾经有文献报道过）。

黑胶虫作业

在细胞培养中常可见到一些大小不等、形态不同的黑色颗粒在细胞及培养液中做不规则运动。镜下检查颗粒数目（100×），每视野计数在10个以上者就有可能使细胞生长受到影响。若培养过程中，其数量继续增多则可能导致细胞停止增殖继而死亡。人们常称这种颗粒为黑胶虫或中毒颗粒。近年来，黑胶虫在现代细胞培养中被广泛讨论，但大多数文献未对其进行描述或仅一带而过。从各个实验中发现，黑胶虫在不同条件或不同种类细胞的培养时对细胞培养的影响大小不一，但存在以下几个特点：（1）黑胶虫与细胞竞争生长，使细胞状态恶化甚至死亡，但不引起培养液浑浊；（2）多数情况下，抗生素对黑胶虫无效；（3）一般单用培养液及血清培养不会得到黑胶虫；（4）黑胶虫在培养体系中多做典型的布朗运动。科学家们至今尚未对黑胶虫进行分类学上的归类，但对其身份有多种猜测。一．非生物有部分科学家认为，任何一种外来生物在培养基中都会有生命活动的反应和表现，而不是简单的运动。如果黑胶虫的运动状况已达到用显微镜可观察到的程度，其营养代谢和能量需求也可想而知，那么，培养液中营养的消耗将加大、酸碱含量都将发生明显变化。比如出现迅速、大含量的沉淀，pH值的迅速下降，细胞大量破碎死亡，引发其他微生物侵染等。但这些状况在黑胶虫感染中很难观察到。因此，有科学家提出黑胶虫为非生物。（1）细胞碎片说在从37℃环境中取出细胞进行观察时，由于液体培养基比热大，液内环境高于外界温度，造成冷热交换、小范围内形成液体流动加剧，即出现观察到的“虫体”游动。同时随着细胞培养的继续，部分细胞开始衰亡，细胞膜结构破裂。破裂之后的细胞内容物泄露到培养液中。尤其是溶酶体的破坏，连续性地造成其他细胞和细胞器的损伤，如果换液不很勤，又会出现进一步破坏和更多的残渣，即表现为“虫体”增多，同时细胞状态恶化甚至死亡。（2）无机物说在1990年发表于细胞生物学杂志上的《对细胞培养中一种黑色运动颗粒性质的研究》中，青岛医学院肿瘤研究室指出，细胞培养中的黑色运动颗粒为硅复合物。该研究小组收集和实验了不同产地的小牛血清，以组织培养方式，通过能谱扫描电镜和电感耦合等离子发射光谱分析仪观察，用紫外分光及电泳透析进行生化分析。他们发现用各种杀灭微生物的方法都杀不死黑色颗粒。在光镜、透射和扫描电镜视野下，只能看到大小不等的颗粒，未见到细胞核、核膜、细胞器及绒毛等生物体结构。将牛血清中收集的运动颗粒分别洗涤后匀浆，进行紫外分光光度计测定，未见蛋白质吸收峰。能谱扫描电镜观察分析黑色颗粒是一种硅化合物，成分主要为硅，其次为钙和钾。电感耦合等离子发射光谱分析结果表明黑色颗粒可能来自于培养液对玻璃器皿的侵蚀，部分来源于培养细胞本身。（3）血清聚合物产物有人对Gibco公司的血清进行研究后认为，黑色颗粒为血清聚合产物，是血清灭活之后出现的类似絮状沉淀。二．生物黑胶虫一般出现在血清培养中，有时在一夜之间暴长，加入了各种抗生素也无济于事，即便冲洗后减少，但几天后依旧出现。这样反复的出现和活力让一些科学家认为黑胶虫是一种生物。但血清是经过0.1μm滤膜过滤的，一般不存在细菌、霉菌或支原体。基于这些考虑，科学家们对黑胶虫的身份有以下几个猜测。（1）寄生性原虫有人在400倍以上的高倍镜下可以清楚的看到黑胶虫有两种不同的形态，一种很大，运动较慢，泛红光，另一种较小，运动较快，红中带绿，个小的围着个大的分布，很可能是公的围着雌的。在本研究中，也有人对无细胞的血清进行培养，并发现4周后视野内均为黑煤

关于细胞污染的一些总结和心得

关于细胞污染的一些总结和心得概述凡混入细胞培养环境中对细胞生存有害的成分和造成细胞不纯的异物都应视为污染，细胞污染不能完全被消除，但能减少其发生的频率和后果的严重性。细胞污染根据污染源主要可以分为物理性，化学性和生物性污染。物理性污染的来源、危害及预防：物理性污染常常被人们所忽视或被笼统地归为化学性污染。物理性污染通过影响细胞培养体系中的生化成分，从而影响细胞的代谢。培养环境中的物理因素，如温度、放射线、振动、辐射(紫外线或荧光)会对细胞产生影响。细胞、培养液或其它培养试剂暴露于放射线、辐射或过冷过热的温度中，可以引起细胞代谢发生改变，如细胞同步化、细胞生长受抑制甚至细胞死亡。通过实验室的合理设计及建立规范的操作规程，可以减少环境中物理因素对细胞的影响。孵箱应放在温度较恒定的环境中，周围不能放置能引起机械振动的设备，如离心机。培养液及培养试剂应放在固定的位置，为避免光照试剂不能放在玻璃门的冰箱中，试剂周围不能放同位素。培养液从冰箱中取出后应在室温中放置一段时间后再进行实验，以避免过冷的温度对细胞的影响。化学性污染的来源、危害及预防培养环境中许多化学物质都可以引起细胞的污染。化学物质并不总是抑制细胞的生长，某些化学物质如激素就可促进细胞的生长。不同细胞对化学物质污染的反应是不一样的。未纯化的物质、试剂、水、血清、生长辅助因子及储存试剂的容器都可能成为化学性污染的来源。细胞培养的必需养分，如氨基酸，若浓度超过了合适的范围，也会对细胞产生毒性。同样，不同细胞系其最佳培养条件下对血清和缓冲液的要求是不一样的，在培养中应严格控制。玻璃制品清洗过程中残留的变性剂或肥皂(通常残留在瓶盖的内表面)是最常见的化学性污染。水是唯一一种在凝固时膨胀的化合物。因此在选择冻存细胞的容器时应考虑到这个因素。容器因水的膨胀而发生破裂是引起试剂污染的重要原因。为了避免金属离子、有机分子、细胞内毒素等物质对水的污染，在配制液体，清洗容器时必须使用不含杂质的超纯水。需要注意的是，超纯水放置过久其纯度会下降。在高压蒸气灭菌及蒸馏水时水经常被污染，因为高压蒸气锅及纯水机的常规维护后可能有少量的化学物质残留。为了保证水的纯度，我们应采取措施尽量避免化学物质的残留。动物血清是细胞培养中常用的天然培养基，但血清又是潜在的生物及化学污染的来源。由于血清采集于多个动物，而且不同厂商的生产工艺及质量各不相同，因此血清中许多成分的浓度存在很大的变异。血清对不同细胞的促生长能力及毒副作用取决于这些细胞的分化功能、组织来源及培养基的成分等因素。在进行一系列实验时，为了保证实验的可重复性，最好选用同一批次的血清。培养液、培养附加成分、试剂培养液、培养附加成分、试剂都可能成为化学性污染的来源。细胞培养使用的所有物质都应是高纯度的，并经过权威机构的鉴定，实验者本人也应对上述成分进行纯度鉴定。同时，正确配置和储存培养液及试剂也是非常重要的，应该采取标准的操作步骤，避免液体体积计算错误，混用类似化合物等错误。培养

关于细胞培养中的污染

细胞培养中常见的污染情况总结如下:常见的污染如下： 1、细菌：细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状，根据感染细菌的不同，可有不同的外形，培养液一般会浑浊变黄，对细胞生长影响明显。仔细检查一下器皿的灭菌情况，是否在高压灭菌时放气时间足够，压力足够！尤其是和储存培养液接触的移液管等物品，连续两次污染的话有可能造成储存液污染，一定要注意！下次使用前检查一下培养液是否存在浑浊的现象！可在培养液中加相应的抗生素处理 2、霉菌：培养液是清亮的，倒置显微镜下无杂质，37度孵箱培养2-3天，仍清亮，但出现絮状杂质，镜下可见呈细丝状的团状漂浮物，可看到明显的菌丝，细胞仍可生长，但时间长之后，细胞的活力状态变差，用硫酸铜溶液擦拭CO2孵箱内，再把水盘里也加上饱和量的硫酸铜。或者在培养箱的托盘加入饱和的消毒磷酸氢二钠高盐液体,可以防止霉菌污染。CO2孵箱被霉菌污染后，可把所有细胞暂时转移，采用过氧乙酸擦洗孵箱（包括隔板，箱壁）。并把过氧乙酸放置在孵箱内一个小时，使其蒸汽弥漫。待过氧乙酸的气味消散后，再移入细胞。孵箱应定期清洁（2月左右），尤其在多雨的季节。其它培养箱清洗方法是：用84液擦洗－清水擦洗－75%酒精擦洗－紫外灯照。预防霉菌污染，可在培养基里加3u/ml的两性霉素或制霉菌素或放线菌素D或双抗；但细胞一旦污染，很难挽救，制霉菌素或放线菌素D 或双抗都于事无补，建议舍弃该污染细胞。，将环境彻底消毒，如果所有细胞都污染，可能是系统污染，检查一下培养基和器材，如果只是个别污染，可能是操作问题，就要注意操作 3、支原体：黑色的，好象多为多形，培养液一般培养液一般会浑浊，原体感染，国内血清很多都没有做支原体阴性检测，而支原体是牛血清中最常见的微生物之一。而且它不能用过滤的办法除去。支原体感染细胞以后，细胞病变不很明显，只是慢慢死去。用泰乐菌素，兽用支原体病的药，但可用于细胞培养，无任何不良反应。Sigma公司的使用时用50ug/ml Tylosin培养液培养6天或连续传两代即可清除支原体污染。如果作为常用的抗生素的话, 建议用8ug/ml的浓度。 4、黑蛟虫：可以穿透滤膜，也可以通过空气传播，低倍下为黑色点状，高倍下可看见黑色的小虫游来游去，培养液也是不浑的，一般不会太影响，细胞还是可以用的。常常是细胞生长状态良好，且观测到的运动物无明显增多，且培养液颜色、透明度无明显变化，可在同一批号的血清养的细胞中发现类似现象。对细胞生长状态不会有明显影响，在细胞增殖旺盛之后会自然消失，除更换血清外无须特殊处理。建议如果细胞有可能是此种污染的话，可以增加细胞的种板密度，以提高细胞的生存率。 5、真菌：一般培养液清亮，不变色，镜下有丝状物，有些真菌开始很像死细胞碎片，只是它很多很多的小块很清楚，象珊瑚状，不象细胞碎片分不清，慢慢的会长出很细的黑色丝状物。真菌生长的比较慢，不象细菌那么容易被发现，但是一旦发现有它的存在细胞就被污染了，也很难救活了。 6、原虫：培养液可轻微浑浊，显微镜下那些细小的点状物数量非常多，轻微活动，细胞虽然可以生长但繁殖速度却明显减慢，而且细胞状态不好，边缘不清楚，细胞不透亮。他们与细胞可共生但会与细胞争夺营养。这种共生是非常普遍的，但他们的数量小，细胞站优势所以不会影响到细胞的正常生长，只有当他们到达一定的数量时就会影响到细胞的生长，最终

如何挽救细胞污染

在讨论之前，大家首先要有一个概念，即洁净区，并不是没有细菌，而是细菌的数量非常少，国家标准100级的洁净标准是浮游菌数不得超过5个每立方米，沉降菌数不得超过1 个每培养皿.而国外的标准比我国的还要高一点，要求的数量更少。所以在我们的洁净操作台里，并不是真正一个细菌都没有的，所以在操作的时候还是要尽量利索迅速地完成操作。尽量减少进入培养体系细菌的数量。所以处理细菌污染的重要原则就是：无限地稀释细菌的浓度，无限地减少细菌的数量！1）.将污染的培养液倒掉，转烧瓶口，加入10mlPBS，适当晃动清洗培养瓶，然后倒掉。转烧瓶口。 2）.继续加入10mlPBS，同样方法晃动，清洗培养瓶，然后倒掉。 3）.继续加入5mlPBS，同样方法洗瓶，主要是培养面，然后倒掉。 4）.重复步骤3再洗。 5）.重复步骤3再洗。 6）.加入3-5ml双抗，洗瓶，静置3-5分钟，然后吸出。 7）.加入3ml双抗，洗瓶，静置3-5分钟，然后吸出。 8）.再加入5mlPBS洗瓶，然后吸出。 9）.加入10ml培养液，加入2ml双抗，放置培养箱培养，5小时之后，倒掉培养基，加入PBS洗瓶两次，然后加入胰酶消化，吹打后置于离心机800-1000r/min离心，然后洗一次。置于新的培养瓶里培养，培养体系加入2ml双抗。 10）.24h之后，视情况换液，若仍然污染严重，培养基浑浊，重复以上步骤，若看不到污染物，则继续步骤1)、3）、4）、6）、8），然后加入培养液培养，培养体系加入2ml双抗. 11).24h之后，若仍污染严重，可再重复一次，若还污染只能弃之（不过一般没有出现这种情况），若镜下不见污染物，则换液PBS洗瓶，正常培养。以上是对于细菌污染（常见为金黄色葡萄球菌和大肠杆菌）；若为霉菌或者真菌污染，加入两性霉素B清洗和培养，终浓度一般为2.5μg/ml（在30μg/ml时会有细胞毒性）。另外也可以选择在培养基里加3ug/ml的制霉菌素或放线菌素D。其它操作同；若为支原体或者黑胶虫污染，因为这个太难处理，所以我基本上都是重新弄细胞了。处理的代价更大更麻烦。但是也是有专门针对黑胶虫和支原体污染的试剂的，但是我没有试过。比较贵呵呵。有同学说用泰乐处理支原体污染效果比较好。大家可以试试，我下次也会试一试。至于黑胶虫的话，我觉得真的是没有办法了，还是需要你在无菌观念和无菌操作上下大功夫加强了，真的黑胶虫在科研领域还是很未知的啊。所以没有什么好的应对方法。预防为主！！还是要强调无菌操作啊！！尤其注意血清的质量！这个是主要来源。一般建议用北美血清，这个黑胶虫污染会概率小。以上方法主要是针对贴壁生长的细胞，在操作的过程中，一定要小心操作动作，轻柔缓慢，切忌大动作鲁莽。防止细胞脱落。以上方法操作得当，基本上都能救活你的细胞（我还没有听到没救活的反馈）。当然如果你的细胞仍有富余或者冻存的，我还是建议你把污染的扔掉，再复苏方便省事。这个拯救细胞还是主要针对你就只剩这一瓶细胞无路可退的时候。欢迎大家讨论

教你判断你的细胞是何种污染

教你判断你的细胞是何种污染细胞培养中常见的生物污染类型有7种，分别是细菌污染、支原体污染、原虫污染、黑胶虫污染、真菌污染、病毒污染以及非细胞污染。他们在细胞培养中污染的特点如下： 1、细菌：细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状，根据感染细菌的不同，可有不同的外形，培养液一般会浑浊变黄，对细胞生长影响明显。 2、支原体：黑色的，好象多为多形，培养液一般培养液一般会浑浊，原体感染，国内血清很多都没有做支原体阴性检测，而支原体是牛血清中最常见的微生物之一。而且它不能用过滤的办法除去。支原体感染细胞以后，细胞病变不很明显，只是慢慢死去。 3、黑胶虫：可以穿透滤膜，也可以通过空气传播，低倍下为黑色点状，高倍下可看见黑色的小虫游来游去，培养液也是不浑的，一般不会太影响，细胞还是可以用的。常常是细胞生长状态良好，且观测到的运动物无明显增多，且培养液颜色、透明度无明显变化，可在同一批号的血清养的细胞中发现类似现象。对细胞生长状态不会有明显影响，在细胞增殖旺盛之后会自然消失，除更换血清外无须特殊处理。 4、真菌：一般培养液清亮，不变色，镜下有丝状物，有些真菌开始很像死细胞碎片，只是它很多很多的小块很清楚，象珊瑚状，不象细胞碎片分不清，慢慢的会长出很细的黑色丝状物。真菌生长的比较慢，不象细菌那么容易被发现，但是一旦发现有它的存在细胞就被污染了，也很难救活了。 5、原虫：培养液可轻微浑浊，显微镜下那些细小的点状物数量非常多，轻微活动，细胞虽然可以生长但繁殖速度却明显减慢，而且细胞状态不好，边缘不清楚，细胞不透亮。他们与细胞可共生但会与细胞争夺营养。这种共生是非常普遍的，但他们的数量小，细胞站优势所以不会影响到细胞的正常生长，只有当他们到达一定的数量时就会影响到细胞的生长，最终形成恶性循环。 6. 病毒：组织细胞培养过程中，如果没有除去潜在的病毒，就会产生病毒污染。目前，从原代猴肾细胞的培养中已发现不少于20种血清性病毒。尽管病毒污染的细胞不影响原代培养，但生产疫苗是不安全的。因此，潜在病毒是细胞大量生产和疫苗、干扰素等生物制品制作中的难题 7、非同种细胞污染：即是细胞交叉污染，由于细胞培养操作时各细胞株所需的器材和溶液没有严格分开，往往会使一种细胞被另一种细胞污染。目前，世界上已有几十种细胞都被HeLa细胞所污染，致使许多实验宣告无效。非细胞培养物所造成的化学成分的污染也偶有发生，大多是由于细胞培养所需物品清洗消毒不彻底而带入一些有毒化学物质所致。

黑胶虫污染

细胞培养中的黑胶虫污染及解决方案点击次数：2365 发布时间：2011-4-2 细胞培养中的黑胶虫污染摘要：预防和避免污染是细胞培养成功的关键，黑胶虫(也称黑焦虫)是近几年来几乎出现在每个细胞培养实验室。但是现在无法对黑胶虫的确认和鉴别，导致学术界说法不一，笔者收集了关于黑胶虫的资料，对黑胶虫进行类系统描述，对黑胶虫出现的情况对细胞培养的影响以及黑胶虫污染后的有效处理进行介绍。关键词：黑胶虫污染处理细胞培养 The pollution of black dots in cell culture (Grade 2005, Biotechnology, School of Life Science and Engineering) Abstract Pollution prevention is the key to success in cell culture, black dots (also called black particles) almost appeared in every cell culture laboratory in past few years .But now no one able to confirm and identify what the black dots is. This lead to appear different academic arguments.The author collected information about the black dots to make a description about black spots which similar to the systemic description,and Introduce when aand where the black dots come out. At the same time give some advice to deal with the black dots. Key words Pollution black dots cell culture 前言污染是细胞培养的大敌。预防和避免污染是细胞培养成功的关键之一。一开始就要十分重视，防止污染，否则会前功尽弃，不仅浪费时间，而且浪费人力、物力，甚至造成无法弥补的损失。细胞培养中常见的生物污染类型有7种，分别是细菌污染、支原体污染、原虫污染、黑胶虫污染、真菌污染、病毒污染以及非细胞污染。他们在细胞培养中污染的特点如下： 1、细菌：细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状，根据感染细菌的不同，可有不同的外形，培养液一般会浑浊变黄，对细胞生长影响明显。 2、支原体：黑色的，好象多为多形，培养液一般培养液一般会浑浊，原体感染，国内血清很多都没有做支原体阴性检测，而支原体是牛血清中最常见的微生物之一。而且它不能用过滤的办法除去。支原体感染细胞以后，细胞病变不很明显，只是慢慢死去。 3、黑胶虫：可以穿透滤膜，也可以通过空气传播，低倍下为黑色点状，高倍下可看见黑色的小虫游来游去，培养液也是不浑的，一般不会太影响，细胞还是可以用的。常常是细胞生长状态良好，且观测到的运动物无明显增多，且培养液颜色、透明度无明显变化，可在同一批号的血清养的细胞中发现类似现象。对细胞生长状态不会有明显影响，在细胞增殖旺盛之后会自然消失，除更换血清外无须特殊处理。 4、真菌：一般培养液清亮，不变色，镜下有丝状物，有些真菌开始很像死细胞碎片，只是它很多很多的小块很清楚，象珊瑚状，不象细胞碎片分不清，慢慢的会长出很细的黑色丝状物。真菌生长的比较慢，不象

黑胶虫抑制剂

上海 “黑胶虫”清除培养基产品使用说明书【产品信息】产品名称：“黑胶虫”清除培养基产品货号：DMR542121 产品成分：RPMI-1640基础培养基、“黑胶虫”抑制剂产品规格：100ml/瓶有效期：3个月保存方法：2℃～8℃，避光【产品简介】 “黑胶虫”及其分解复合物是一种常见的细胞污染物，与细胞共生，随细胞传代而传代，通常抗生素对其无效。“黑胶虫”与细胞竞争性生长，对细胞生长不利，严重时导致细胞死亡。目前各大高校和科研单位的细胞大多存在被“黑胶虫”污染的现象，对细胞培养及其后续实验造成了极大地影响。 “黑胶虫”清除培养基是本公司在Biomocin产品的基础上开发的新一代产品，含有清除“黑胶虫”的特殊成分。本产品经过了上百种细胞的测试和长期的实验验证，对细胞无害，对清除“黑胶虫”污染效果显著，能够很好的杀灭和抑制“黑胶虫”。【使用说明】 1.根据所培养细胞的特性，向“黑胶虫”清除培养基中加入血清、双抗等成分，配制成相应的完全培养基。 2.将50-100万个细胞铺到60mm的细胞培养皿内，加入4ml“黑胶虫”清除完全培养基孵育细胞。 3.次日更换新鲜的“黑胶虫”清除完全培养基，之后每2～3天更换1次培养液，换液时用无菌的平衡盐溶液洗涤细胞1-2次；期间如果细胞密度过大，请保持细胞密度适当（贴壁细胞可能需要用胰酶消化），并更换新的培养皿。 4.使用“黑胶虫”清除培养基3日之后即可见清除效果，连续使用12～14天即可将“黑胶虫”清除，若“黑胶虫”污染较为严重，可延长处理3～5天。 5.因环境中可能依然存在污染源，为避免细胞再次受到“黑胶虫”的污染，建议您在“黑胶虫”清除以后继续使用“黑胶虫”清除培养基，以达到预防的效果。【注意事项】 1.收到产品后首先检查包装是否完好，培养基瓶是否有破损，培养基是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生，请及时和我们联系。 2.仔细阅读产品说明书，了解产品相关信息，如使用方法、保存方式、有效期等，确保操作方式与产品说明书相一致。若因操作方式与产品说明不一致而导致出现的问题，责任由客户自行承担。 3.检查确认产品无任何问题后，如果不立即使用，请将产品及时放入2℃～8℃中，避光保存。 4.本产品仅供研究或进一步生产使用，不用于诊断或治疗。上海笃玛生物科技有限公司

细胞培养中常见污染

最近看到不少问有关细胞培养污染的事，正好我看到了一个有关这方面的总结，很全很好很强大，跟大家分享下细胞培养中常见的污染情况总结如下:常见的污染如下：1、细菌：细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状，根据感染细菌的不同，可有不同的外形，培养液一般会浑浊变黄，对细胞生长影响明显。仔细检查一下器皿的灭菌情况，是否在高压灭菌时放气时间足够，压力足够！尤其是和储存培养液接触的移液管等物品，连续两次污染的话有可能造成储存液污染，一定要注意！下次使用前检查一下培养液是否存在浑浊的现象！可在培养液中加相应的抗生素处理2、霉菌：培养液是清亮的，倒置显微镜下无杂质，37度孵箱培养2-3天，仍清亮，但出现絮状杂质，镜下可见呈细丝状的团状漂浮物，可看到明显的菌丝，细胞仍可生长，但时间长之后，细胞的活力状态变差，用硫酸铜溶液擦拭CO2孵箱内，再把水盘里也加上饱和量的硫酸铜。或者在培养箱的托盘加入饱和的消毒磷酸氢二钠高盐液体,可以防止霉菌污染。CO2孵箱被霉菌污染后，可把所有细胞暂时转移，采用过氧乙酸擦洗孵箱（包括隔板，箱壁）。并把过氧乙酸放置在孵箱内一个小时，使其蒸汽弥漫。待过氧乙酸的气味消散后，再移入细胞。孵箱应定期清洁（2月左右），尤其在多雨的季节。其它培养箱清洗方法是：用84液擦洗－清水擦洗－75%酒精擦洗－紫外灯照。预防霉菌污染，可在培养基里加3u/ml的两性霉素或制霉菌素或放线菌素D或双抗；但细胞一旦污染，很难挽救，制霉菌素或放线菌素D或双抗都于事无补，建议舍弃该污染细胞。，将环境彻底消毒，如果所有细胞都污染，可能是系统污染，检查一下培养基和器材，如果只是个别污染，可能是操作问题，就要注意操作3、支原体：黑色的，好象多为多形，培养液一般会浑浊，原体感染，国内血清很多都没有做支原体阴性检测，而支原体是牛血清中最常见的微生物之一。而且它不能用过滤的办法除去。支原体感染细胞以后，细胞病变不很明显，只是慢慢死去。用泰乐菌素，兽用支原体病的药，但可用于细胞培养，无任何不良反应。Sigma公司的使用时用50ug/ml Tylosin培养液培养6天或连续传两代即可清除支原体污染。如果作为常用的抗生素的话, 建议用8ug/ml的浓度。4、黑蛟虫：可以穿透滤膜，也可以通过空气传播，低倍下为黑色点状，高倍下可看见黑色的小虫游来游去，培养液也是不浑的，一般不会太影响，细胞还是可以用的。常常是细胞生长状态良好，且观测到的运动物无明显增多，且培养液颜色、透明度无明显变化，可在同一批号的血清养的细胞中发现类似现象。对细胞生长状态不会有明显影响，在细胞增殖旺盛之后会自然消失，除更换血清外无须特殊处理。建议如果细胞有可能是此种污染的话，可以增加细胞的种板密度，以提高细胞的生存率。5、真菌：一般培养液清亮，不变色，镜下有丝状物，有些真菌开始很像死细胞碎片，只是它很多很多的小块很清楚，象珊瑚状，不象细胞碎片分不清，慢慢的会长出很细的黑色丝状物。真菌生长的比较慢，不象细菌那么容易被发现，但是一旦发现有它的存在细胞就被污染了，也很难救活了。6、原虫：培养液可轻微浑浊，显微镜下那些细小的点状物数量非常多，轻微活动，细胞虽然可以生长但繁殖速度却明显减慢，而且细胞状态不好，边缘不清楚，细胞不透亮。他们与

13(1).细胞培养中出现小颗粒的原因1

细胞培养的过程中，经常见到黑色的颗粒或小黑点，已成为很多细胞培养初学者的困扰，这种情况是怎么引起的呢？该如何避免呢？产生原因： 1.细胞状态：细胞自身具有分泌功能，或细胞营养不良，生长状态欠佳，细胞老化都有可能在培养过程中出现小黑点。 2.血清沉淀：通常经过热处理的血清，沉淀物的形成会显著的增多。有些沉淀物在显微镜下观察像是“小黑点”，常会误认为血清遭受污染，而将血清放在37℃中欲培养此“微生物“，但在37℃环境下，又会使此沈淀物增多，更会误认为微生物之增殖。一般而言，此小黑点应不会影响细胞的生长，但若经过平行试验怀疑此血清的品质，应立即停用，更换另一批号的血清。 3：黑胶虫污染黑胶虫概况：在细胞培养的时候,有时会在400倍显微镜下看到小黑点在动,小黑点有时呈点状,有时呈小的片状,运动形式为在原地振动（类似布朗运动）,这种小黑点既不是细菌、霉菌,也不是支原体（我们曾经请周守长用血平板培养过,没有菌落出现）,目前业内人士称其为“黑胶虫”.黑胶虫到底是否为生物?这个一直是业内人士的疑惑.黑胶虫一般是存在血清里的,而血清通常是经过0.1μm 滤膜过滤的,所以血清里不可能存在细菌、霉菌及支原体等微生物.如果说黑胶虫不是生物,它会不断增多,达到一定数量时会与细胞竞争性生长,与细胞竞争培养基中的营养,从而使得细胞营养不足而死亡.不管对于黑胶虫的争论如何,但有几个是目前大家公认的： ①与细胞竞争性生长,对细胞生长有不利影响. ②“黑胶虫”会增殖,增殖多时,视野下一大片都为“黑胶虫”. ③“黑胶虫”与血清有关,与血清质量有一定关系. 4：支原体污染：如果细胞表面出现许多小黑点，细胞生长缓慢，培养液很黄，那么支原体污染的可能性就很大。 5：细胞受各种霉菌、细菌等生物污染。此种原因大多为环境原因造成。解决办法： 1.如果小黑点有增殖趋势，那么就有可能是污染了，需要处理；如果确定是支原体解决办法很多： a 抗生素(antibiotic)除菌法：用抗生素抑制支原体。取受支原体污染的细胞，加入含抗生素的1640培养液培养3天后，吸除培养液连续三个轮回。清除支原体后的细胞，在不加抗生素的培养液中，再传代培养3～4次。 b 加温除菌法：把受污染的细胞置41℃中作用5～10小时。 c 动物体内接种除菌法：把受支原体污染的肿瘤细胞接种在同种动物皮下或腹腔中，借动物 C e l l M a x

细胞中常见的污染

一、常见的污染如下： 1. 细菌：细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状，根据感染细菌的不同，可有不同的外形，培养液一般会浑浊变黄，对细胞生长影响明显。仔细检查一下器皿的灭菌情况，是否在高压灭菌时放气时间足够，压力足够！尤其是和储存培养液接触的移液管等物品，连续两次污染的话有可能造成储存液污染，一定要注意！下次使用前检查一下培养液是否存在浑浊的现象！可在培养液中加相应的抗生素处理。 2. 霉菌：培养液是清亮的，倒置显微镜下无杂质，37度孵箱培养2-3天，仍清亮，但出现絮状杂质，镜下可见呈细丝状的团状漂浮物，可看到明显的菌丝，细胞仍可生长，但时间长之后，细胞的活力状态变差，用硫酸铜溶液擦拭CO2孵箱内，再把水盘里也加上饱和量的硫酸铜。或者在培养箱的托盘加入饱和的消毒磷酸氢二钠高盐液体,可以防止霉菌污染。 CO2孵箱被霉菌污染后，可把所有细胞暂时转移，采用过氧乙酸擦洗孵箱（包括隔板，箱壁）。并把过氧乙酸放置在孵箱内一个小时，使其蒸汽弥漫。待过氧乙酸的气味消散后，再移入细胞。孵箱应定期清洁（2月左右），尤其在多雨的季节。其它培养箱清洗方法是：用84液擦洗－清水擦洗－75%酒精擦洗－紫外灯照。预防霉菌污染，可在培养基里加3u/ml的两性霉素或制霉菌素或放线菌素D或双抗；但细胞一旦污染，很难挽救，制霉菌素或放线菌素D或双抗都于事无补，建议舍弃该污染细胞。，将环境彻底消毒，如果所有细胞都污染，可能是系统污染，检查一下培养基和器材，如果只是个别污染，可能是操作问题，就要注意操作。 3. 支原体：黑色的，好象多为多形，培养液一般会浑浊，原体感染，国内血清很多都没有做支原体阴性检测，而支原体是牛血清中最常见的微生物之一。而且它不能用过滤的办法除去。支原体感染细胞以后，细胞病变不很明显，只是慢慢死去。用泰乐菌素，兽用支原体病的药，但可用于细胞培养，无任何不良反应。Sigma 公司的使用时用50ug/ml Tylosin培养液培养6天或连续传两代即可清除支原体污染。如果作为常用的抗生素的话, 建议用8ug/ml的浓度。 4. 黑蛟虫：可以穿透滤膜，也可以通过空气传播，低倍下为黑色点状，高倍下可看见黑色的小虫游来游去，培养液也是不浑的，一般不会太影响，细胞还是可以用的。常常是细胞生长状态良好，且观测到的运动物无明显增多，且培养液颜色、透明度无明显变化，可在同一批号的血清养的细胞中发现类似现象。对细胞生长状态不会有明显影响，在细胞增殖旺盛之后会自然消失，除更换血清外无须特殊处理。建议如果细胞有可能是此种污染的话，可以增加细胞的种板密度，以提高细胞的生存率。 5. 真菌：一般培养液清亮，不变色，镜下有丝状物，有些真菌开始很像死细胞碎片，只是它很多很多的小块很清楚，象珊瑚状，不象细胞碎片分不清，慢慢的会长出很细的黑色丝状物。真菌生长的比较慢，不象细菌那么容易被发现，但是一旦发现有它的存在细胞就被污染了，也很难救活了。 6. 原虫：培养液可轻微浑浊，显微镜下那些细小的点状物数量非常多，轻微活动，细胞虽然可以生长但繁殖速度却明显减慢，而且细胞状态不好，边缘不清楚，细胞不透亮。他们与细胞可共生但会与细胞争夺营养。这种共生是非常普遍的，但他们的数量小，细胞站优势所以不会影响到细胞的正常生长，只有当他们到达一定的数量时就会影响到细胞的生长，最终形成恶性循环。污染的可能原因：可能原因很多。比如配液消毒问题、操作问题、环境问题等等。