生化实验指导

实验1 氨基酸纸层析

一、实验目的

通过对氨基酸的分离和鉴定，掌握纸层析的基本原理及操作方法。 二、实验原理

层析法又称色谱法。是一项重要的分离技术。利用混合物中各组分理化性质的不同，使各组分以不同程度分配在两相中。 层析的种类： 根据原理分为： a 分配层(纸层析) b 吸附层析 c 亲和层析 d 离子交换层析 根据支持物分为： a 纸层析 b 柱层析 c 薄层层析 d 凝胶过滤层析 分配层析的原理：

各种物质在两种互不溶解的溶剂中的分配系数不同，从而达到分离的目的。 分配层析用于分离在水和有机溶剂中都可溶的混合物。

一种物质在两相中达到平衡时，在两相中的浓度之比是一个常数。

物质在流动相里的浓度

物质在固定相里的浓度 纸层析:

分配的过程：一部分溶质随有机相移动离开原点进入无溶质区，并进行重新分配，不断向前移动。随着有机相不断向前移动，溶质不断地在两相间进行可逆的分配。由于各种物质的分配系数不同，随展层溶剂移动的速率也不同，从而达到分离的目的。移动速度可用比移（Rf ）值表示：

色斑中心至上样原点中心的距离

K D =

图1 氨基酸纸层析示意图

R f =

溶剂前缘至上样原点中心的距离

载体：滤纸

固定相：滤纸吸附的水

流动相：水饱和酚

极性：谷氨酸＞丙氨酸＞脯氨酸

对于水－饱和酚的溶剂体系，氨基酸极性越小，KD 值越大，Ｒｆ值也越大，一定时间内随流动相迁移的距离远，反之迁移距离小。

三、实验材料

仪器

⑴层析缸；⑵层析滤纸；⑶电吹风机；⑸喷雾器；⑹毛细管。

试剂

⑴氨基酸标准液（6mg/mL）；⑵氨基酸混合液（6mg/mL)

⑶展层剂：水饱和苯酚溶液。

⑷显色剂：0.3%茚三酮丙酮溶液

四、操作步骤

1、层析滤纸的准备

用铅笔在层析滤纸上距离一端2-3cm处划线并标记点样位置。

2、点样(少量多次)

用毛细管平口端蘸取少量样品溶液，点样于滤纸的相应位置，要求样品斑点直径不超过0.5cm，干燥后再点样，重复3次。

3、展层

将滤纸放入层析缸，使滤纸浸入液面以下，但不要使液面没过点样线。展层50-60分钟，取出，用铅笔绘出前沿线。

4、显色

滤纸吹干，用喷雾器把茚三酮溶液均匀细致地喷洒在滤纸有效面上，吹干。

图2 氨基酸纸层析造作图

五、结果与分析

用铅笔描出色斑轮廓，找出中心点。如果斑点形状不规则或出现明显的“拖尾”，则圈出颜色集中均匀的部分。

计算各色斑的Rf值,对照标准样品，确定混合样品中氨基酸

六、思考题：

1、Rf值的概念、如何计算Rf值以及影响该值的各种因素。

2、纸层析分离氨基酸的原理

3、分析造成色斑拖尾现象的原因。

七、操作注意事项

1、点样量要适当，点样要均匀；

2、尽可能不要用手去触摸滤纸有效面；

3、层析时间根据层析系统的具体情况而定，使分配系数相近的氨基酸分开；

4、喷茚三酮时要均匀、适量，不可过多。

实验2 酵母RNA的提取及组分鉴定

一、目的：

学习稀碱法提酵母RNA的原理与技术。

二、原理：

由于RNA的来源和种类很多，因而提取制备方法也各异，一般有苯酚法、去污剂法和盐酸胍法。其中苯酚法又是实验室最常用的。组织匀浆用苯酚处理并离心后，RNA即溶于上层被酚饱和的水相中，DNA和蛋白质则留在酚层中，向水层加入乙醇后，RNA即以白色絮状沉淀析出，此法能较好地除去DNA和蛋白质。上述方法提取的RNA具有生物活性。工业上常用稀碱法和浓盐法提取RNA，用这两种方法所提取的核酸均为变性的RNA，主要用作制备核苷酸的原料，其工艺比较简单。浓盐法是用10%左右氯化钠溶液，90℃提取3—4h，迅速冷却，提取液经离心后，上清液用乙醇沉淀RNA。

稀碱法使用稀碱（本实验用0.2%NaOH溶液）使酵母细胞裂解，然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀RNA（本实验）或调pH2.5利用等电点沉淀。提取的RNA 有不同程度的降解。酵母含RNA达2.67—10.0%，而DNA含量仅为0.03—0.516%，为此，提取RNA多以酵母为原料。

三、器材与试剂：

1.器材：

①干酵母粉（市售），②鲜酵母（市售），③pH试纸（pH1—10），④台天平（100g）。

⑤烧杯100ml（×1），⑥量筒50ml（×1）、10ml（×1），⑦抽滤瓶500ml（×1）、布氏漏斗φ10cm （×1），⑧移液管0.5ml（×1）、1ml（×2）、2ml（×2）、5ml（×1），⑨离心机5000r·min-1。2．试剂：

①0.2%氢氧化钠溶液：2g NaOH溶于蒸馏水并稀释至1000ml，②乙酸（A·R），③95%乙醇，④无水乙醚（C·P），⑤氨水（C·P），⑥ 10%硫酸溶液：浓硫酸（比重1.84）10ml，缓缓倾于水中，稀释至100ml，⑦5%硝酸银溶液：5g AgNO3溶于蒸馏水并稀释至100ml，贮于棕色瓶中，⑧苔黑酚—三氯化铁试剂：将100mg苔黑酚溶于100ml浓盐酸中，再加入100mg FeCl3·6H2O。临用时配制。

四、操作步骤：

1．RNA的提取：

称取8g干酵母粉于100ml研钵中，干研磨，转入锥形瓶后加入0.2%NaOH溶液40ml，

沸水浴加热30分钟，经常搅拌，冷却后离心5分钟（4000r·min-1）。取上清液，缓慢加入至30ml酸性乙醇中，边加边搅。加毕，静置，待完全沉淀，离心5分钟（4000r·min-1），沉淀备用。

向沉淀中加10%硫酸液10ml，转入锥形瓶中，加热至澄清，将RNA水解，即为水解液，进行组分鉴定。

2．鉴定：

（1）核糖：取水解液1ml，加苔黑酚—FeCl3试剂1ml，水浴加热，观察颜色变化。

（2）嘌呤碱：取水解液2ml，加氨水2ml及5%硝酸银溶液1ml，观察是否产生絮状嘌呤银化合物（有时絮状物出现较慢，可放置几分钟）。

（3）磷酸：取水解液1ml，定磷试剂1ml，水浴加热，观察颜色变化。

五、结果与讨论：

1．所得RNA是否是纯品？如何进一步纯化？

2．RNA提取过程中的关键步骤及注意事项有哪些？

实验3 酶促反应的影响因素

一、实验目的

1．了解温度、激活剂、抑制剂对酶促反应速度的影响。

2．学习检定温度、抑制剂影响酶促反应速度的方法。

二、实验原理

在酶促反应中，酶的催化活性与环境温度、pH有密切关系，通常各种酶只有在一定的温度、pH范围内才表现它的活性，一种酶表现其活性最高时的温度、pH值称为该酶的最适温度、最适pH。

在酶促反应中，酶的激活剂和抑制剂可加速或抑制酶的活性，如氯化钠在低浓度时为唾液淀粉酶的激活剂，而硫酸铜则是它的抑制剂。

本实验利用淀粉水解过程中不同阶段的产物与碘有不同的颜色反应，定性观察唾液淀粉酶在酶促反应中各种因素对其活性的影响。

淀粉（遇碘呈蓝色）→紫色糊精(遇碘呈紫色)→红色糊精(遇碘呈红色)→无色糊精(遇碘不呈色)→麦芽糖(遇碘不呈色)→葡萄糖(遇碘不呈色)。

所以淀粉被唾液淀粉酶水解的程度，可由水解混合物遇碘呈现的颜色来判断，以此反映淀粉酶的活性，由此检定温度、pH、激活剂、抑制剂对酶促反应的影响。

三、实验器材

试管和试管架、恒温水浴、冰浴、吸量管（1 mL12支、2 mL5支、5 mL4支）、滴管、量筒、玻棒、白瓷板、秒表、烧杯、棕色瓶。

四、实验试剂

1．新鲜唾液稀释液(唾液淀粉酶液)：每位同学进实验室自己制备，先用蒸馏水漱口，以清除食物残渣，再含一口蒸馏水，0.5 min后使其流入量筒并稀释至200倍(稀释倍数可因人而异)混匀备用。

2．0.1%淀粉溶液

3．碘液：称取2 g碘化钾溶于5 mL蒸馏水中，再加入1 g碘，待碘完全溶解后，加蒸馏水95 mL，混匀贮于棕色瓶中。

4．1%NaCl溶液

5．1%CuSO4溶液

6．缓冲溶液。

五、操作步骤

1．温度对酶促反应的影响

取4支洁净试管编号，按下表进行操作（体积单位：mL）：试管号 1 2 3 淀粉溶液 1.5 1.5 1.5 稀释唾液 1 1 煮沸的稀释唾液 1

处理方式37℃恒温水浴，

保温10 min

0℃恒温，保温10 min，分一半至4号管，

将4号管37℃恒温水浴，保温10 min

碘化钾-碘液1滴1滴各1滴

现象

2．激活剂、抑制剂对酶促反应的影响

取4支洁净试管编号，按下表加入各试剂（体积单位：mL）：

试管号 1 2 3 4

淀粉溶液 1.5 1.5 1.5 1.5

1% Na Cl 溶液0.5

1%Cu SO4溶液0.5

1%Na2SO40.5

蒸馏水0.5

稀释唾液0.5 0.5 0.5 0.5

处理方式37℃恒温水浴，保温10 min

碘化钾-碘液1滴1滴1滴1滴

现象

六、注意事项

加入酶液后，要充分摇匀，保证酶液与全部淀粉液接触反应，得到理想的颜色梯度变化。

七、问题与思考

1．什么是酶的最适温度、最适pH？它们是酶的特征物理常数吗？

2．激活剂分几类? 氯化钠属哪种类型？硫酸钠对淀粉酶的活性有无影响？

实验4 Vc含量测定---2,6-二氯酚靛酚滴定法

一实验目的

1、学习2,6-二氯酚靛酚滴定法定量测定维生素C的原理和方法

2、掌握滴定管基本操作过程

二实验原理

Vc是人类营养中重要的维生素之一，绿色蔬菜和水果中含量很丰富。Vc有强的还原性，在碱性、加热并有氧化剂存在时Vc易被氧化破坏。2,6-二氯酚靛酚在碱性溶液中为蓝色，在酸性溶液中为红色，被还原后变为无色。因此可用2,6-二氯酚靛酚测样品中的Vc含量，Vc 可将染料还原为无色同时Vc被氧化成脱氢Vc，Vc全部被氧化后，滴入的染料使溶液呈淡粉红色。根据消耗染料的量可计算出样品中Vc的含量。

三实验仪器、试剂和材料

仪器：

（1）天平（7）量筒

（2）研钵（8）漏斗

（3）5ml微量滴定管（9）滤布

（4）50ml容量瓶(10)1.0ml、10.0ml吸量管

（5）10ml胖肚吸管

（6）100ml锥形瓶

试剂：

（1）1%草酸溶液：称取10g草酸，加水至1000ml；

（2）2%草酸溶液：称20g草酸，加水至1000ml；

（3）Vc标准液：准确称10 mg Vc溶于100 ml 1%草酸中，即Vc的浓度为0.1 mg/ml；（4）0.05 %的2，6 - 二氯酚靛酚溶液：称取2，6-二氯酚靛酚500mg，溶于300ml含有

104mg 碳酸氢钠的热水中，冷却后，稀释至1000ml ，过滤于棕色瓶中，贮存于冰箱内。 材料 猕猴桃若干

四 操作步骤

1、提取Vc ：

称取猕猴桃40g ，加入2%草酸溶液，用研钵磨成匀浆。两层滤布过滤取得滤液，用少量 2% 草酸溶液洗研钵几次，倒入滤渣中，合并滤液，定容至1000ml 。（注意：切勿过量）

2、标准液滴定：

取Vc 标准液1ml 于100ml 锥形瓶中，加9ml 1% 草酸溶液，用2，6-二氯酚靛酚溶液滴定至淡红色。记录所染料溶液的量，计算出1ml 染料溶液所能氧化Vc 的量。

抗坏血酸浓度*消耗抗坏血酸体积

消耗染料体积 3、空白滴定：

取10ml 1%草酸溶液放入锥形瓶中，滴定，方法同2中的操作，作为空白对照。 4、样品滴定：

另吸取两份10ml 样品，放入两个锥形瓶中，分别滴定，方法同2中的操作 。记录染料溶液所用的体积。

五 结果、分析讨论

取两份10ml 样品所用染料溶液体积的平均值，代入下面公式计算100g 样品中还原型Vc 的含量：

（V 1-V 2）×V×M×100

V 1：为滴定样品所消耗染料溶液的平均体积 V 2：为滴定空白对照所消耗染料溶液体积 V ： 样品提取液的总体积

V 3：滴定时所取的样品提取液的体积 M ：1ml 染料溶液所能氧化Vc 的量（mg ） W ：样品的重量（g ）

1毫升染料氧化Vc 的质量=

Vc 含量 (mg/100g) =

V 3×W

六注意事项

1、样品提取过程避免与铜、铁接触，滴定过程要迅速，滴定时间不超过2min，样品滴定消耗染料1~5ml为宜，如超出此范围，应增加或减少样品用量。

2、如果样品泡沫过多，可加几滴辛醇消泡。

3、样品中含有色素会干扰对终点的判断。

4、本法只能测定还原型Vc，不能测出具有相同生理功能的氧化型Vc和结合型Vc。

5、用2%草酸溶液制备提取液可有效抑制Vc氧化酶，而1%草酸溶液无此作用。