第七章 分光光度法

第七章分光光度法

分光光度法是基于物质对光的选择性吸收而建立起来的分析方法。（在选定波长下，被测定溶液对光的吸收程度与溶液中吸光组分的浓度有简单的定量关系）。根据被利用的光波长范围可分为可见、紫外、红外光谱法。利用可见光进行分光光度分析时，通常将被测定组分通过化学反应转变成有色化合物，然后进行吸光度的测量。因此分光光度法在一定意义上使用着比色法，吸光光度法等名词，本章重点讨论可见分光光度法。

一、分光光度法

（一）光的基本性质

光是电磁波。其波长范围很广，如果以波长或频率为序排列可得到如下电磁波谱图。

光谱名称波长范围跃迁类型分析方法

X—射线远紫外光近紫外光可见光近紫外光中红外光远红外光微波

无线电波0.1—10nm

10—200nm

200—400nm

400—760nm

0.76—2.5μm

2.5—5.0μm

500—1000μm

0.1—100cm

1—1000m

K.L层电子

中层电子

价电子

分子振动

分子振动和低位

转动

分子振动

X—射线光谱法

真空紫外光度法

紫外可见光度法

比色可见光度法

近红外光谱法

中红外光谱法

远红外光谱法

微波光谱法

核磁共振光谱法

光有微粒二象性，波动性是指光按波的形式传播。如光的折射、衍射、偏振和干涉等，光的波长λ，频率γ与速度c的关系为：

λγ

=

c

式中λ以cm表示，γ以Hz表示，c为光速2.7979×1010cm/s（真空中）

光同时又具有粒子性，如电效应就明显地表现其粒子性。

光是由“光微粒子”（光量子或光子）组成的，光量子的能量可表示为

γh

E=h为普朗克常数6.6262×10-34J.S

可见上式把光的波粒两相性用h统一起来了。

结论：不同波长（或频率）的光，其能量不同，短波的能量大，长波的能量小。（二）物质对光的吸收

吸收光谱有原子吸收光谱和分子吸收光谱。

原子吸收光谱是由原子外层电子选择性地吸收某些波长的电磁波而引起的。原子吸收分光光度法就是根据原子的这种性质所引起来的。分子吸收光谱比较复杂。这是由分子结构的复杂性引起的，在同一电子能级中有几个振动能级，而在同一振动能级中又有几个转动能级，电子能级之间的能量差一般为1~20电子伏特。因此，电子能级跃迁而产生的吸收光谱，位于紫外-可见光部分。这种又价电子跃迁而产生的分光光谱称为电子光谱。

在电子能级变化时，不可避免地也伴随着分子振动和转动能级的变化，因此，分子的电子光谱通常比原子的线状光谱复杂的多，呈带状光谱。如果用近红外线

（1~0.05ev ）激发分子，则不是以引起电子能级的跃迁，而只能引起分子振动能级（1~0.05ev ）和转动能级（<0.05ev ）的跃迁，这样得到的光谱称为振动-转动光谱或红外吸收光谱。各种物质的分子对红外光的选择性吸收与其分子的结构密切相关。各种色光按一定比例混合而成的，各种色光的波长范围不同。物质的颜色正是由于物质对不同波长的光具有选择性吸收作用而产生的，物质对光吸收的特征更清楚的描述吸收曲线（吸收光谱）物质不同，内部结构不同，吸收光谱不同。

CuSO 4溶液 兰色 吸收互补色 黄色

KMnO 4溶液 紫红 吸收互补色 黄绿

（三）比色与分光光度法的特点

1、可以测定试样中的微粒组分

2、灵敏度高，准确度高。（相对微粒组分测定比色5~10%，分光光度法2~5%）

3、应用广泛，水质（环境）药品。食品中的标准测定方法。

4、简便快速，设备不繁。

二、吸收的基本定律

（一）朗伯—比耳定律

当一束平行单色光通过任何均匀，非散射的固体、液体或气体介质时，光的一部分被吸收，一部分透过溶液，一部分被器皿的表面反射。设入射光强度为Io',吸收光强度为Ia ，透过光强度为It ，反射光度为Ir

Io'=Ia + It + Ir + Id 散射光强度Id

在吸光光度分析中，通常将试液和空的溶液分别置于同样质料及厚度的吸收池中，然后让强度为Io'的单色光分别通过这两个吸收池，在测量其透过光的强度。此时，反射光强度基本上是不变的，且影响可以相互抵消，故上式可简化为：

Io=Ia+ It （散射光强度亦如此）

T I I o

t = 透光率或透光度 温度升高，溶液对光的吸收强度下降 实践证明，溶液对光的吸收程度，与溶液浓度、液层厚度及入射光波长等因素有关，若入一定，则A 只与b 、c 有关。朗伯（1760）比耳（1852）研究了光的吸收与溶液液层的厚度b 及溶液浓度c 的定量关系：

A=Kbc ①

T T

A I I o lg 1log lg -=== ② 朗伯—比耳定律的数学表达式。(Lambert —Beer Law)它表明：当一束单色光通过含有吸光物质的溶液后，溶液的吸光度与吸光物质的浓度及吸收层厚度成正比。它是进行光谱定量分析额理论基础。式中比例常数K ，与吸光物质的性质，入射光波长及温度等因素有关。

（二）吸光系数和摩尔吸光系数

1、上式①中 c 单位 g/L b 单位 cm 时

K=a 称为吸光系数 L.g-1.cm-1 A=abc

2、上式①中 c 单位 mol/L b 单位 cm 时

K=ε 称为摩尔吸光系数 L.mol-1.cm-1 A=εbc

所以，ε表示吸光度质点的浓度为1mol/L,溶液厚度为1cm 时，溶液对光的吸收能力。不能直接测量。需要计算求得。

Ε的无力意义：当吸光物质浓度为1mol/L,吸收池厚度为1cm ，以一定波长的光通过时，所获得的吸光度值A 。

ε值取决于入射光的波长和吸光物质的特性，也受溶剂和温度的影响，ε值反映了方法的灵敏度，它与仪器质量有关，但主要与吸收光的波长有关。

【例题】浓度为0.05mg/L 的Fe 2+溶液，与1.10一邻二氢杂菲显色反应后生成橙红色配合物，在508nm 波长处用2cm 比色皿进行测定，得到T=50%，求得配合物（1.10一邻二氢杂菲亚铁）（Fe 的质量55.85）的a 和ε。

解 30.02lg 2

1lg lg ==-=-=T A 114cm ..30010

0.5230.0---=??==g L bc A a 114..107.130085.55--?=?==cm mol L Ma ε

上式计算时注意单位和有效数字。

（三）偏离朗伯—比耳定量的因素

根据朗伯—比耳定率，当吸收池厚度保持不变，以吸光度对浓度作图时，应得到一条通过坐标原点的直线。但是实际工作中，常常遇到偏差线性关系的现象，即曲线向下负偏离和向上正偏离。造成这些现象原因很多，可以分为物理方面因素和化学方面因素。

1、物理因素

（1）单色光不纯所引起的偏离

在光度分析仪中，使用的是连续光源，用单色器分光，用狭缝控制光谱带的宽度，因而投射到吸收溶液中的入射光，常常是一个有限宽度的光谱带，二不是真正的单色光。由于非常单色光使吸收光谱的分辨率下降，因而导致对朗— 比耳定律偏离。

入射光的纯度与仪器质量有关。性能好的分光光度计，其所用入射光的波长范围较窄即“单色光”的纯度高。因此，用这种分光光度计进行测量，较之用简易型分光光度计或电比色计进行测量所得标准曲线的线性范围要窄，即偏离朗伯—比耳定率的程度要小。入射光波长的选择，对偏离朗伯—比耳定律的程度常有影响，在实际工作中，通常选择吸光物质的最大吸收波长m λ的光为入射光，这样，不仅保证测定有较高的灵敏度，而且由于此处的吸收曲线较平坦，21εε和相差不大，故偏离朗伯—比耳定律的程度是较小的。

（2）非平行光或入射光散射引起的偏离

若入射光不垂直通过吸收池，就使通过吸收溶液的实际光程大于吸收池的厚度，这种影响较小。有时溶液中存在胶粒或不溶性悬浮微粒时，使一部分入射光产生散射，实测吸光度增大，因而导致偏离朗伯—比耳定律。

2化学因素

即溶液中的化学反应引起的偏离。溶液中的吸光物质常因离解、缔合形成新的化合物或互变异构等化学变化而改变其浓度。因而导致偏离朗伯—比耳定律。 例如：K 2CrO 7溶液中有下列平衡

Cr 2O 72- + H 2O = 2HCrO 4- = 2H + + 2CrO 42-

橙 黄

溶液中Cr 2O 72-及CrO 42-(或HCrO 4-)的相对浓度，与溶液的稀释程度及酸度有关。

对于K 2Cr 2O 7的中性水溶液，当加水稀释后，由于离解溶液中Cr 2O 72-相对溶液必须逐渐减小，而CrO 42-的相对浓度逐渐增大。测定K 2Cr 2O 7溶液的吸光度时，如果于波长350nm 处进行测量，则随着K 2Cr 2O 7溶液浓度的增大，其中CrO 42-的相对浓度越来越小，而CrO 42-所产生的吸光度较Cr 2O 72-产生的吸光度为大，其结构将导致标准曲线向下弯曲。很明显，如果于等吸收碘波长445nm 处进行测量，尽管存在离解平衡。也不会发生偏离朗伯—比耳定律的情况。

三、比色仪和分光光度计

（一）目视比色法—标准比色管

用肉眼观察，比较溶液颜色深浅以确定物质含量的方法。才用标准系列溶液方法。原理是要透过光强度相等时，则两个比色管中的溶液相等。

bc A I

I o ε==lg bc o I I ε-=∴10 11110c b o I I ε-=标准液 颜色深度相同时，则 I 标准液=I 测试液 22210c b o I I ε-=测试液 222111c b c b εε=∴

由于标准系列与试液都是在相同条件下显色的，且是同一种显色物质，所以21εε=，又因为液层厚度相等b 1=b 2则c 1=c 2。

【特点】1、简单，适用大批试样分析。

2、稀溶液中微量物质的测定。

3、可在复合光下进行，某些显色反应不符合朗伯—比耳定律仍然可用。

4、准确度较差，相对误差5~20%。

（二）光电比色法—581-G 光电比色计

1、概述：

借助于光电比色计来测量一系列标准溶液的吸光度，绘制标准工作曲线，然后根据被测试液的吸光度，从标准工作曲线上得到被测物质的浓度或含量。它与目视比色法在原理上并不相同，前者比较吸收，后者比较透过。但是，①光电池代替人肉眼，提高了准确度。②当有某些有色物质共存时，可以采用适当的滤光片或适当的参比溶液来消除干扰，选择性提高。

2、581—G 光电比色计

①光源：6~12V 钨丝灯，配有稳压装置

聚光镜使其成为平行光

②滤光片：从光源出发的连续光谱中分出某一波长范围的光作为吸光光度法的光源，理论上纯度越高越好，但纯度太高时，其强度就会太小，难以准确进行测量，一般允许一定波长范围是60nm,如测定470nm 则440nm~500nm 兰光透过（光谱半宽度）

光谱半宽度越小，透过的单色光就越纯。测定时，滤光片透光率最大的光，应该就是被测定有色试液吸收最大的光。即：滤光片的颜色与被测液颜色成互补色。

③比色皿：无色透明，能耐腐蚀性的玻璃或石英制成。

同样厚度的比色皿之间透光率相差应小于0.5%,要干净。

④光电池：“疲劳”现象，光电池收强光照射或连续使用的时间太长时，光电流很快升至一较高值，然后逐渐下降，此时应暂停使用，置于暗处，使之恢复原来的灵敏度。

⑤检流计：悬镜式光点反射检流计，透光度标尺刻度是均匀的，A 与T 负对数关系，A 不均匀

（三）分光光度计—721，722，751分光光度计

1、概述

原理与光电比色法相同，不同色在于单色光的获得方法不同。光电比色计用滤光片，半宽度大（60nm ）单色纯度差，而分光光度计采用棱镜（721）或光栅（722）分光器（ 半宽度5~10nm ），并可以扩展到紫外和近红外光区域（751、754）。

【特点】①纯度高，可得精致的吸收光谱曲线，线性宽，准确度高。

②波长可调，利用A 的加和性可实现两种或两种以上组分的同时测定。 ③无色物质只要在紫外或近红外有吸收峰便可测量。

2、721分光光度计

①光源：钨丝 （320~2500nm 连续光源）

紫外：氢灯 氘灯（180~375nm 连续光源）

②单色器：棱镜（光的折射率不同来分光）

光栅（光的干涉和衍射来分光）

③吸收池：比色皿 石英材料 1cm. 2cm 3cm

④检测器：硒光电池

光电管

四、显色反应其影响因素

（一）显色反应和显色剂

在光度分析中，将试样中被测组分转变或有色化合物的化学反应叫显色反应。显色反应两大类型：配位反应，氧化还原反应，前者是主要的。与被测组分化合或有色物质的试剂称为显色剂。

1、光度分析对显色反应的要求

①选择性好

②灵敏度高

③有色化合物组成恒定，性质稳定

④有色化合物与显色剂色差要大。nm R m

R 60max max >-=?λλλ

⑤显色条件易于控制

2、无色显色剂

应用不多，因为山成的配和物不够稳定，灵敏度和选择性也不高，有硫氰酸盐，钼酸铵和过氧化氢等

3、有机显色剂

大多数有机显色剂常与金属离子生成稳定的螯合物，显色反应的选择性和灵敏度都较高。有些有色螯合物易溶于有机溶剂（4-氨基安替比林溶于CHCl3），故可进行萃取比色，进一步提高灵敏度和选择性，有机显色剂中一般都含有生色团和助色团。

（二）影响显色反应的因素

显色反应能否满足要求除了与显色剂的性质有主要关系之外，控制好显色的

条件很重要。

1、显色剂的用量： M+ R = MR

为了保证显色反应尽可能的进行完全，一般需要加入过量显色剂，但过量并非越多越好。

2、溶液的酸度

溶液的酸度影响M 和R ，MR 的存在状态；R 的颜色，MR 的组成和稳定性。所以综合考虑选择最佳pH 可以作一条A —PH 曲线

3、显色时间：作一个A —t 曲线选择稳定显色时间。

4、温度、溶剂：影响MR 的离解度、颜色、显色速度等。

5、干扰离子影响及清除方法：加屏蔽剂，改变显色条件，分离干扰离子。

五、测量条件

测量误差最小值 -lgT=A=0.434 T=0.368

（一）选择合适 波长的入射光

1、“最大吸收原则”灵敏度高，偏离小。

2、“干扰最小原则”使主要干扰物质避开。

（二）控制适当的吸光度范围

为了使测量结果得到较高的准确度一般控制标准溶液和试液的吸光度A 在0.2~0.8范围内

1、控制溶液的浓度，称量，稀释度

2、选择不同厚度的比色皿

（三）选择适当的参比溶液

在测量吸光度时，利用参比溶液来调节仪器的零点。（T=100%，A=0)可以消除由于吸收池内壁以及溶剂对入射光的反射和吸收带来的误差。基于吸光度的加和性，可用适当的参比溶液扣除干扰。

六、分光光度计的应用

（一）多组分的同时测定

基于吸光度的加和

N N M M N

N M M bc bc A bc bc A ''''''21εεεε+=+=

先利用标准溶液计算出ε的值，在测6个A 值求算出c M c N

（二）示差分光光度法

针对高含量组分，用一个比试液浓度低的溶液作参比

x x s

s bc A bc A εε== )(s x s x c c b c b A A -=?=-εε

当用c s 作参比调零时，测得c x 吸光度就是试液与参比溶液的吸光光度差值。 原理：两溶液的吸光度之差与两溶液浓度之差成正比。

目的：减小仪器的测量误差

（三）酸和碱离解常数的测定

（四）溶液中配合物组成的测定

摩尔比法（饱和法）

等摩尔连续变化法