有氧训练对大鼠腓肠肌ChREBP及其调节因子的影响_黄森
有氧训练对大鼠腓肠肌ChＲEBP及其调节因子的影响Effects of aerobic training on ChＲEBP and its regulative factor
in rats’gastrocnemius
黄森1，2，林文弢3，翁锡全3，刘建红2，周志宏2，4
HUANG Sen1，2，LIN Wen－tao3，WENG Xi－quan3，LIU Jian－hong2，ZHOU Zhi－hong2，4
摘要：目的:探讨有氧训练对大鼠骨骼肌ChＲEBP及其调节因子PP2A、PKA、AMPK和MLx
的影响。方法:20只适应训练后8周龄SD大鼠随机分为安静组和运动组，每组10只。运动
组进行35m/min、1h/d、5d/周跑台训练、共训练4周。ＲQ－PCＲ和WB检测PP2A、PKA、
AMPK、MLx和ChＲEBP的基因和蛋白表达。结果:经过4周有氧训练后，运动组大鼠腓肠肌
PP2A、AMPK mＲNA表达和AMPK、MLx蛋白表达水平显著高于安静组(P＜0.01或P＜
0.05)，PP2A和CHＲEBP蛋白表达水平显著降低(P＜0.01)，其余指标间无显著变化(P＞
0.05)。结论:有氧训练通过降低CHＲEBP蛋白表达和通过PP2A、PKA、AMPK途径降低
CHＲEBP活性抑制ChＲEBP功能，可能是有氧训练降低体脂的机制之一。
关键词：有氧训练;ChＲEBP;PP2A;AMPK;PKA;MLx
中图分类号：G804．7文献标识码：A文章编号：1006－2076（2013）05－0036－04
Abstract：Objective：To evaluate the effects of aerobic training on ChＲEBP and its regulative factor
in rats’gastrocnemius．Methods：After adaptive training，20eight－weeks－old male SD rats were
divided into two groups，the quiet group and the training group．Training group underwent treadmill
training for4weeks，with35m/min for1hour/day，5days/week．Technology of quantitative fluores-
cent PCＲand Western blotting are adopted in order to test the genes expression and the level of pro-
tein changes of PP2A，PKA，AMPK，MLx and ChＲEBP．Ｒesults：After4w aerobic training，com-
pared with the quiet group，the expression of PP2A，AMPK mＲNA and the protein level of AMPK，
MLx in training group increased significantly（P＜0．01or P＜0．05），and the protein level of
PP2A，CHＲEBP in training group decreased significantly（P＜0．01），other index have not signifi-
cantly changed within the two groups（P＞0．05）．Conclusions：Aerobic training through lowering
CHＲEBP protein expression and through PP2A，PKA，AMPK pathway to reduce CHＲEBP activity
to inhibit CHＲEBP function，this may be one of the mechanism of the decrease in body fat by aero-
bic training．
Key words：aerobic training；ChＲEBP；PP2A；AMPK；PKA；MLx
收稿日期：2013－03－15
基金项目：国家自然科学基金面上项目（30871216）。
作者简介：黄森（1971－），男，湖南隆回人，在读博士研究生，助理研究员，主要研究方向低氧训练的理论与方法。
作者单位：1．上海体育学院，上海200438；2．湖南省体育科学研究所，湖南长沙410008；3．广州体育学院，广东广州510500；
4．湖南体育职业学院，湖南长沙410014
1．Shanghai University of Sport，Shanghai200438，China；2．
Hunan Institute of Sports Science，Changsha410008，China；3．
Guangzhou Sport University，Guangzhou510500，China；4．Hu-
nan Sports Professional College，Changsha410014，China
糖类应答元件结合蛋白（carbohydrate response el-ement binding protein，ChＲEBP）是2001年发现的一种能与糖类应答元件（carbohydrate response element，ChＲE）结合的蛋白质，在哺乳动物的各种组织器官中分布广泛，而以肝脏、脂肪、小肠、肾脏和肌肉等组织中含量较多［1］。有研究显示，肝脏中有139个基因受ChＲEBP的调节，包括与糖代谢有关的丙酮酸激酶、葡萄糖－6－磷酸脱氢酶等，与脂肪酸合成有关的脂肪酸合酶、乙酰辅酶A羧化酶等，与甘油三酯合成有关的
第29卷第5期2013年10月
山东体育学院学报
Journal of Shandong Institute of Physical Education and Sports
Vol．29No．5
October2013
DOI:10.14104/https://www.360docs.net/doc/0e5161103.html,ki.1006-2076.2013.05.010
线粒体甘油三酯转移蛋白、三磷酸甘油脱氢酶等［2］。目前大量的研究表明，ChＲEBP是独立于胰岛素之外的调控糖脂代谢的重要转录因子，在机体能量代谢中起到非常重要的转录调节作用。有氧训练是目前治疗肥胖及其相关的糖尿病、脂肪肝等病症的有效手段，涉及的研究目前多与胰岛素有关，而ChＲEBP在其中的影响及相关机制却鲜有报道。本研究通过观察有氧训练对大鼠骨骼肌中ChＲEBP及其调节因子蛋白磷酸酶2A（protein phosphatase2A，PP2A）、蛋白激酶A（pro-tein kinase A，PKA）、AMP活化蛋白激酶（AMP activa-ted protein kinase，AMPK）和Max样蛋白X（Max like protein x，MLx）基因和蛋白表达的影响，为有氧训练改善机体糖脂代谢的机制研究提供新的实验依据。
1材料与方法
1．1动物与分组
6周龄雄性SD大鼠30只，购自广东省医学实验动物中心，实验动物生产许可证号：SCXK（粤）2009－0002，体重160 180g，分笼饲养，每笼5只，自由饮食，室温23? 25?，湿度40% 60%，自然光照，自由饮食。定期消毒饲养室、用具等。所有大鼠在常氧条件下先进行2周跑台适应性训练，每天运动15min，速度从12m/min开始，逐天增加，2周后达到35m/ min。动物跑台为杭州段氏大鼠跑台。两周后根据大鼠体重和训练情况进行正态分布分组，淘汰体重过重和过轻、运动能力较差及有伤病的大鼠，保留20只进行正式实验。20只大鼠随机分为安静组和运动组，每组10只。本实验在广州体育学院运动生物化学重点实验室进行。
1．2训练方案
训练组进行常氧环境下的跑台训练，35m/min、1 h/d、5d/周［3］。安静组正常生活，不接受跑台训练，正式实验时间为4周。
1．3标品采集
第4周末，运动组完成最后训练24h后取材，安静组同一时间取材。按0．3ml/100g体重剂量腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，腹主动脉取血，迅速分离腓肠肌，以灭菌锡纸包好在液氮中快速冷冻后保存于－80?超低温冰箱中。
1．4测试方法
1．4．1ＲQ－PCＲ测定PP2A、MLx和ChＲEBP基因表达
总ＲNA提取：以TrizolＲeagent（Invitrogen，USA）提取腓肠肌总ＲNA，经紫外分光光度仪测定其OD260/OD280在1．6 1．8之间，提示提取的ＲNA符合纯度要求，可用于后续PCＲ。
反转录合成模板cDNA：0．5ml去酶管中加入总ＲNA2μg、25?Oligo dT1μl、加DEPC－去离子水至13μl；850C变性5min，然后冰上放置2min以上；加入逆转录5?反应缓冲液5μl，25mM dNTP1μl、25 U/μlＲNase Inhibitor1μl、M－MLVＲTase（ＲNase H free）（GeneCopoeia，USA）1μl、ddH
2
O（ＲNase/DNase free）4μl，总体积为25μl。混匀配制的反应mix，短暂离心后在42?反应60min，再进行85?5min灭活处理。所得的单链cDNA放置于－20?保存。
引物设计：从NCBI中查寻目标基因序列，由TAKAＲA公司设计和合成目标基因引物。PP2A （sense：5’TGG ACC AGT GGA TCG AGC AG3’，anti-sense：5’ATG CAC ATC TCC ACA CAC AGT GAC 3’），PKA（sense：5’AAG CTG AAG CAG ATC GAG CAC A3’，antisense：5’CAG GCA CGT ACT CCA TGA CCA3’），AMPK（sense：5’CAG GCA CAT GGT TGT CCA CAG3’，antisense：5’AAT TTG GCG ATC CAC AGC TAG TTC3’），MLx（sense：5’TCC AGA GCT AAT AGC ATC GGT TC3’，antisense：5’GAC AAT GGT CTG AAG GTC ATC ATA G3’），ChＲEBP（sense：5’GGT TGT CCC CAA AGC AGA GAG3’，antisense：5’GGA GAC AGG TGG ACA CTC AGT3’），GAPDH （sense：5’TGG TCT ACA TGT TCC AGT ATG ACT3’，antisense：5’CCA TTT GAT GTT AGC GGG ATC TC3’）。
ＲQ－PCＲ：取0．2μl薄壁PCＲ管加入2?Alli-nOneTM Q－PCＲMix（GeneCopoeia，USA）10μl、ddH2O4μl、PCＲ上游引物2μl、PCＲ下游引物2μl、模板2μl，总体积20μl。混匀置于Bio－Ｒad Q－PCＲ仪（BIO－ＲAD，USA）中。95?10min预变性后，变性95?10s，退火54? 60?20s，延伸72?15s，40个循环。测出Ct值并进行溶解曲线分析，以GAPDH 为内参，用比较Ct值法计算相对表达量：△△Ct=（测试组目的基因Ct值－测试组内参基因Ct值）－（对照组目的基因Ct值－对照组内参基因Ct值），相对表达量F=2－△△Ct。
1．4．2WB测定PP2A、MLx和ChＲEBP蛋白表达总蛋白提取：以凯基全蛋白提取试剂盒（KGP2100）提取腓肠肌总蛋白，用Bradford法蛋白定量后，将样品调节成5μg/μl分装保存于－20?。
Western blotting：取出蛋白质样品加入上样缓冲液混匀，95?煮5min，各样品等量上样。根据目标蛋白的分子量选择合适的分离胶（8% 10%）和浓缩胶（5%）进行电泳，湿式恒压电转至NC膜。室温封闭后加入兔来源一抗PP2A（SAB）、PKA（BioVision）、AMPK （Cell）、MLx（SANTA）、ChＲEBP（SANTA）孵育60min，洗涤后加入荧光二抗（Li－Cor）室温避光孵育30 60 min，PBS冲洗后以Odyssey近红外双色激光成像系统进行扫描和分析。
1．5数据统计
实验数据用平均值?标准差表示，以SPSS14．0统计学软件包进行t检验，显著性水平为P＜0．05，极显
黄森，等有氧训练对大鼠腓肠肌ChＲEBP及其调节因子的影响No．52013
著性水平为P＜0．01。
2实验结果
由表1可见，经过4周有氧训练后，运动组大鼠腓肠肌PP2A和AMPK mＲNA表达显著高于安静组（P＜0．01），而PKA、MLx和CHＲEBP mＲNA表达在两组间无显著差别（P＞0．05）。
表1有氧训练对大鼠腓肠肌PP2A、PKA、AMPK、MLx和CHＲEBP mＲNA表达的影响
组别n PP2A PKA AMPK MLx ChＲEBP 安静组101．32?0．252．58?0．702．31?0．652．42?0．051．26?0．03运动组104．14?0．55＊＊2．98?0．994．06?0．75＊＊2．15?0．381．22?0．09 *:与安静组比较P＜0．05，＊＊:与安静组比较P＜0．01，下同。
由表2可见，相对安静组，4周有氧训练显著提高运动组大鼠腓肠肌AMPK和MLx蛋白表达水平（P＜0．05和P＜0．01），却显著降低PP2A和CHＲEBP表达水平（P＜0．01），PKA则无显著差异（P＞0．05）。
表2有氧训练对大鼠腓肠肌PP2A、PKA、AMPK、MLx和CHＲEBP蛋白表达的影响
组别n PP2A PKA AMPK MLx ChＲEBP
安静组108．09?1．022．08?0．742．29?0．8278．25?4．03100．25?11．15运动组104．66?0．80＊＊3．12?0．773．70?0．87*135．25?9．00＊＊64．75?3．30＊＊
3讨论
ChＲEBP是首先在大鼠肝脏中发现的一种大分子蛋白，随后在多种哺乳动物的组织中均有检测到。ChＲEBP分子量为9．46kDa，包含有864个氨基酸，其氨基酸链主要分为四个功能区，即位于N端的负责核定位信号的核定位区（Nuclear Localization Signal，NLS）、位于中间的富脯氨酸区（Pro－rich）以及位于C 端的类亮氨酸拉链区（Zip－like）和负责DNA结合的碱性螺旋－环－螺旋－亮氨酸拉链区（basic Helix－Loop－Helix/Leucine Zipper，bHLH/LZ）［4］。
磷酸化和去磷酸化是影响ChＲEBP功能的主要方式，因此其氨基酸链上的四个磷酸化位点尤为重要。PP2A将Ser196的磷酸化位点去磷酸化后，ChＲEBP从细胞质转运到细胞核，而PKA将Ser196的磷酸化位点磷酸化后，ChＲEBP则留滞在细胞质无法进入细胞核。在细胞质中磷酸化的Thr666进入细胞核中需要在PP2A的去磷酸化作用后才能使ChＲEBP产生DNA结合活性，而同样被PKA和PP2A调控着磷酸化和去磷酸化的Ser626以及被AMPK磷酸化调控的Ser568也在调节ChＲEBP的DNA结合活性上发挥作用，其中Ser568的磷酸化也能导致ChＲEBP失去DNA结合活性，而Ser626可能仅仅起到了附属的辅助作用［1，5］。总之，Ser196位点的去磷酸化使ChＲEBP从细胞质转运到细胞核，Ser626、Thr666和Ser568位点的去磷酸化活化ChＲEBP的DNA结合活性，从而使ChＲEBP能与靶基因的ChＲE序列结合，调节靶基因的转录过程。
本研究显示，经过4周有氧训练后，运动组大鼠腓肠肌PP2A mＲNA表达显著高于安静组，而蛋白表达却显著下降，提示有氧训练对PP2A的影响在基因和蛋白层次存在差异。PP2A是异源三聚体，由α结构亚基、β调节亚基和γ催化亚基组成，是丝氨酸/苏氨酸磷酸化酶调节细胞内的多种磷酸化机制，涉及细胞代谢、细胞周期、细胞凋亡、信号转导、基因表达和翻译等过程，在细胞内的表达受到严密调控，其表达水平相对恒定，但在某些情况下全反式维甲酸、过氧化物酶体增殖物激活受体γ、游离的ATP和焦磷酸盐等可以使PP2A表达发生改变［6］，针灸和艾灸也能上调PP2A的活性及表达［7－8］，但其调节机制仍需进一步研究。
PKA的分子是由2个调节亚基和2个催化亚基构成的异四聚体。当cAMP不存在时，PKA以无活性的全酶状态存在；当PKA的调节亚基与cAMP结合时，导致调节亚基的构象改变而与催化亚基解离，产生2个激活的催化亚基单体。激活的PKA催化亚基通过对靶基因调节蛋白的磷酸化作用，进而影响到基因的表达或翻译，诱导细胞的应激反应。众多研究表明，运动对心脏、肝脏、血液、大脑海马等不同组织cAMP浓度有一定的影响［9］。侯伊玲等［10］在实验中发现大鼠急性心肌梗死后有氧训练8周，心肌cAMP含量及PKA蛋白表达水平显著高于假手术组，通过有关信号途径改善心室功能。本研究显示运动使腓肠肌PKA mＲNA和蛋白表达分别升高了15．5%和50．0%，但无显著性意义。
AMPK是一个异三聚体，由α催化亚基和β、γ调节亚基构成。AMPK是维持细胞能量代谢平衡的重要因子，激活AMPK的关键因素是ATP的下降和AMP 的上升，AMP通过不同途径直接或间接激活AMPK，AMPK通过对下游相关能量代谢的靶蛋白的调节促进葡萄糖和脂肪酸的分解代谢和增加ATP含量同时降低糖原、甘油三酯和胆固醇的合成代谢、减少ATP的消耗，在葡萄糖、脂肪和胆固醇的代谢中具有重要作用。研究表明，运动对AMPK的激活由于强度、时间的不同，各个亚基的激活程度有所区别，而长时间的运动可使AMPK三个亚基的表达均有所上调，并且AMPK的活性亦随之上升［11］。而有的研究目前还存分歧，如在运动对骨骼肌中AMPKα1的诱导效应中升高、降低和无变化的结果均有报道［12］。本研究显示，
山东体育学院学报第29卷第5期2013年10月
四周的有氧训练显著升高大鼠腓肠肌AMPK mＲNA
和蛋白表达水平。
Mlx属于转录因子bHLH/ZIP家族的成员之一，分为α、β、γ三种亚型，组成Mlx环的氨基酸残基中的疏水性残基通过疏水键与ChＲEBP相结合，必须在Mlx存在的环境下，ChＲEBP才能与含有ChoＲE的低聚核苷酸结合［13］。研究表明，显性抑制肝细胞Mlx，则使糖脂代谢的丙酮酸激酶、脂肪酸合酶、乙酰辅酶A 羧化酶等也完全受到抑制［14］。因此，Mlx是ChＲEBP 在糖脂代谢中的重要功能性调节因子。本研究显示，运动组大鼠腓肠肌Mlx mＲNA表达与安静组无显著差别，蛋白表达显著升高，提示有氧训练对大鼠骨骼肌Mlx的影响主要也是诱导蛋白表达。
本实验结果显示，运动组大鼠腓肠肌ChＲEBP mＲNA表达水平与安静组无明显差异，提示有氧训练对骨骼肌ChＲEBP基因表达影响不大，这与我们早期研究［15］中发现的有氧训练对正常大鼠肝脏ChＲEBP 基因表达影响结果相类似。但我们以往也发现有氧训练能使高糖高脂诱导的肝脏ChＲEBP基因过表达显著下降［16］，提示ChＲEBP在机体的表达具有良好的平衡调节机制，能根据机体的不同状态适当调节以适应机体生理机能的需要。运动组大鼠腓肠肌ChＲEBP蛋白表达水平显著低于安静组，提示有氧训练显著降低ChＲEBP蛋白含量。Iizuka等［1］在实验中发现，ChＲEBP基因敲除小鼠肝脏中参与脂肪酸合成的酶，包括脂肪酸合酶、乙酰辅酶A羧化酶等、ATP－柠檬酸裂解酶和脂酰CoA去饱和酶1等的基因表达水平均较对照小鼠明显降低，导致肝脏脂肪酸合成率下降，体内脂肪组织含量显著降低。因此有氧训练降低ChＲEBP蛋白表达可能也是有氧运动降低体内脂肪含量的原因之一。有氧训练对ChＲEBP与Mlx蛋白表达影响不一致，提示它们各自可能存在其它的调节机制，具体仍需进一步研究。
本研究通过对影响ChＲEBP功能相关因子的观察显示，有氧训练降低使ChＲEBP去磷酸化的PP2A蛋白表达水平，同时升高使ChＲEBP磷酸化的PKA和AMPK蛋白表达水平，不利于ChＲEBP从细胞质转运到细胞核及ChＲEBP的DNA结合活性，使ChＲEBP的功能受到抑制，虽然MLx蛋白含量升高，但由于ChＲEBP本身蛋白和活性水平受到抑制，因此可能导致了其下游包括脂肪合成在内的相关靶基因转录水平的下调，进一步解释了有氧训练降低体脂的可能机制之一。
4总结
有氧训练一方面降低ChＲEBP蛋白表达水平，另一方面降低PP2A和升高PKA、AMPK蛋白表达水平，不利于ChＲEBP的转运及DNA结合活性，使ChＲEBP 功能受到抑制，可能是有氧训练降低体脂的机制之一。参考文献：
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