生物工程大实验报告
生物工程大实验
30L发酵罐上黄原胶发酵实验
姓名:
学号:
学院:生命学院
专业:生物工程
年级:
同组成员:
1.材料和方法
1.1菌株:HYJ
1.2培养基
1.2.1斜面培养基(100ml)
葡萄糖 3.0;蛋白胨0.5;酵母粉0.3;
氯化钠0.5;琼脂 2.0;pH 7.0-7.3
灭菌条件:115℃,20min;培养温度:30℃;培养时间:24-48 h
1.2.2种子培养基(100ml)
葡萄糖 2.0;蛋白胨0.5;酵母粉0.1;
牛肉膏0.3 g;pH 7.0-7.3
灭菌条件:115℃,20 min;培养温度:30℃;培养时间:10-15 h
1.2.3发酵培养基(100ml)
葡萄糖 3.0;蛋白胨0.2;酵母粉0.1;Na2HPO4·12H2O 0.252;KH2PO4 0.3;
K2SO4 0.1;MgSO4·7H2O 0.1;pH 7.0-7.3
灭菌条件:115℃,20 min;培养温度:30℃;培养时间:48-62 h
1.3. 培养条件
1.3.1斜面培养
1)配置400 ml的斜面培养基,分装试管,于115℃下灭菌20 min,之后摆斜面,冷却至室温后,将凝固后的斜面放于30℃培养箱过夜。
2)转接斜面菌种,将转接好的斜面菌放于30℃培养箱培养24-48 h。
1.3.2一级种子培养
1)配置种子培养基:按照种子培养基配方配制3000 ml,分别分装到5000 ml 和500 ml的三角瓶中,装液量分别为100 ml/500 ml三角瓶(用于一级种子培养);1000 ml/5000 ml三角瓶(用于二级种子培养),于115℃下灭菌20 min。
2)接种:将培养好的斜面菌种接种到一级种子培养基中(100 ml/500 ml三角瓶),
接种量为每瓶2-3接种环,放在30℃摇床培养10-15 h,转速为200 rpm。
1.3.3二级种子培养
将培养好的一级种子接种到二级种子培养基中(1000 ml/5000 ml三角瓶),接种量为10%(v/v),放在30℃摇床培养6-8 h,转速为200 rpm。
1.3.4发酵罐培养
1)配置发酵培养基20 L,考虑到接入的种子液的体积(10%, 2000 ml),所以培养基配置定容时为18 L。
2)将培养好的二级种子接种到发酵罐中,接种量为10%(v/v),温度30℃,发酵罐初始搅拌转速约为100 rpm,通风量1.5-2.0 vvm,初始pH为7.0-7.3,中间过程不控制pH。
1.4 检测方法
1.4.1发酵液OD
取一定体积的发酵液进行适当稀释,然后用分光光度计在620 nm波长下测定吸光度。
1.4.2葡萄糖含量
取一定发酵液进行适当稀释,8000 rpm/min 离心15 min,取上清,采用SBA 检测。
1.4.3发酵液粘度
发酵过程中取大约100 ml发酵液,用Blankspoon粘度计(DV-E,VISCOMETER)测定其粘度。
1.4.4黄原胶产量测定
发酵结束后取10 ml发酵液,用3倍体积无水乙醇沉淀黄原胶,8000 rpm/min 离心15 min,去上清,沉淀的黄原胶50℃通风箱内干燥至恒重,用分析天平称重。
1.4.5 pH值测定
用pH计测定发酵液的pH值。
1.4.6菌体干重的测定
取发酵液10 ml加入20 ml去离子水稀释,放置在80℃水浴锅中用1 mol/l NaOH调节pH10后,水浴15 min,然后再用1 mol/l HCl调节pH7.0,迅速12000 rpm离心20 min,去上清,留沉淀,于50℃通风箱内干燥至恒重(8-10 h)。
1.4.7计划取样时间及待测参数:
前24 h发酵过程中,每隔4 h取一次样测定pH、发酵液OD、黄源胶产量、菌体干重,葡萄糖含量、发酵液粘度。
2. 结果与讨论
2.1实验图片
其中A为斜面上菌的镜检图B为二级种子镜检图C为28.5h镜检图D为70h镜检图
2.2 30L发酵罐上的发酵曲线
a)发酵曲线汇总
b)菌干重
上图为菌干重数据以及拟合曲线(OD实际也是反映菌体浓度,因此在此不做讨论),可以看出实际的数据与拟合曲线拟合的并不是很好。而且我们由于接种量比较大,为15%的接种量,且经过二级种子的培养也没有延迟期,故最大生长速率应该在20h左右,但由于发酵液后期产胶过大,粘度过大,而我们分离菌的方法比较简单原始,故后期很难将菌从发酵液中分离下来,故后期所测的菌的干重实际是菌和部分胶的重量,后期数据不准因而导致实验结果误差较大。
c)胶干重曲线
其中A为原始数据作图,B为删掉0小时数据作图
在0h我们取样时可能未等发酵液混匀后便取,因而测得的胶干重数据异常,可以看出A图数据拟合的并不是很好,在B图中我将0h胶干重设为0,可以看出拟合度大大提高。从数据来看,胶干重测量还是不错的,当然由于提取胶的方法比较简单,会有部分菌带到胶中,这也是不可避免的误差。可以看出在15小时左右时胶的产生速率最大,而到30小时左右时胶的产生速率有所下降并在逐渐降低,这与底物的消耗、溶氧的降低等因素有关。
d)残糖曲线
从图中可以看出所测的数据与拟合直线拟合的较好,这证明实际的操作比较规范。从一开始糖的消耗来看,消耗量较小,原因可能是菌种有延迟期;但从8h开始,糖的消耗量迅速增加,到30h左右残糖量已经到了一个较低的值,这证明在这段时间内菌体大量繁殖消耗了糖分。到发酵后期,发酵液中溶氧量和菌对糖的消耗量处在一个很低的水平,此时菌体进入衰退期。e)溶氧曲线
在最初的4个小时内通风量变化不大,转速也较低的情况下氧变化比较小,因为此时菌体处于适应期,没有大量繁殖,消耗的氧气不多。在对数生长的初期,比耗氧速率达到最大值,但此时细胞浓度还很低,摄氧率并不高。随着细胞浓度的迅速增高,培养液的摄氧率也迅速增高,并在对数生长的后期达到峰值。于是表现为发酵液中溶氧迅速降低,最后低至负值。由于接种量为15%,比一般接种量偏大,所以菌体生长及产生速度也偏快,因此在最初的10h内溶解氧就降到了一个很低的水平。之后由于培养基中营养物质的消耗,以及培养装置氧传递能力的限制,到对数生长阶段结束,溶氧已经降到了一个极低的水平,虽然细胞浓度可能还会有所增加,但溶解氧量也不会再升高。此后,由于本实验菌种产生的黄原胶分子量较大,粘度较大,因此即使再加大通风量提高转速,发酵液的溶氧量也不会再增加。
f)粘度曲线
本次实验统一使用S4转子进行粘度的测量,可以看出前8个小时并未测出发酵液的粘度,但从测得的胶干重来看,此时应该会有一定的粘度,可能由于转子测量范围有限,因此并未测出一定的数值。可以看出在30h左右粘度开始迅速增加,此时菌体数量已达到一个比较稳定数值,开始大量产生黄原胶,所以随着产胶量的不断增加,发酵液的粘度在不断变大。在后期随着营养物质消耗殆尽以及代谢产物不断增多,菌体数量也会逐渐减少,因此产胶能力也下降,所以虽然粘度仍不断增加,但其增长速率已经大大下降,
最后会达到一个峰值。
g)pH曲线
从最上方汇总的发酵曲线中可以看出,随着发酵过程的进行,发酵液的pH 有下降的趋势。在生产阶段,一般发酵液的pH趋于稳定,稳定在最适合产物生成的pH范围。
2.2 菌体比生长速率
2.3 产物比生成速率
2.4 底物比消耗速率
3、实验总结
通过本次实验,我系统学习了微生物发酵的全过程,包括发酵过程中各个环节的基础理论,如菌种培养及种子的扩大培养、发酵过程控制、发酵动力学等。了解了发酵设备的种类及结构。学习实验室阶段发酵方法及如何进行工艺放大。由于我们组做这个实验总共做了两遍,因此对发酵罐已经比较了解。整体来说两次实验都比较顺利。但最后测量菌体干重时可能由于操作不规范(我认为是我们在调节pH时没有很好的把握好应该加多少酸碱量,所以每个管加的量都不大一样)以及本次实验固有的误差的影响,菌干重的测量数据不够好。
在写实验报告的过程中我感觉我确确实实学到了很多,通过与老师和同学的沟通交流中,我现在已经比较熟练的用Origin作图,这是我最大的收获。
4、致谢
附件:发酵实验原始数据
黄原胶发酵实验数据记录表
发酵时间(h)粘度
(cP)
胶干重
(g/l)
葡萄糖
(g/l)
发酵
OD62
菌体
干重
g/l)
温
度℃
溶氧
(%)
转速
(rpm
)
通风
量
vvm
pH
0 0 3.66 26 1.12 0.66 35.2 40.8 150 1.6 6.7 4 0 3.00 25.5 3.9 0.36 34.7 20.0 250 1.75 6.7 8 0 4.17 23.5 8.07 2.78 34.6 37.2 350 1.7 6.7 12 8.7 5.83 17 11.34 5.06 35.1 11.5 350 2.15 6.7 16 169 7.91 14 11.88 6.95 34.7 -14.4 400 2.2 6.5 20 486 8.66 12 11 8.23 35.0 -17.7 400 2.3 6.5 24 360 8.96 10 17.78 10.85 35.1 -17.4 400 2.0 6.5 29.5 930 9.47 8 21 13.24 35.4 -17.6 400 2.4 6.3 38.5 2700 10.03 7 16.65 43.67 35.6 -17.3 400 2.4 6.3 42.5 3570 10.11 6 15.8 58.81 35.4 -17.6 400 2.1 6.3 47.5 3990 11.12 5.5 20.15 58.9 35.8 -17.5 400 2.1 6.1 53.5 4020 11.3 4.5 15.25 65.87 36.3 -17.6 400 2.4 6.1 63.5 4440 11.93 4 16.85 61.35 36.4 -17.6 400 2.1 6.0 70 6150 12.40 3 17.6 63.4 36.2 -18 400 2.45 6.0
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4.将重铬酸钾试剂分别滴在比色板的凹槽内,并分别标注1号、2号(作对照)、3号。在3号试剂上滴1滴酒精,在1号试剂上滴1滴酵母菌发酵液。发现1号和3号都由橙色变成了灰绿色。 通过上述实验,让我们对酵母菌“发酵现象”所需要的原料、条件及产生的物质都有了较直观的感受,比较容易理解课本上阐述的“酵母菌可以把葡萄糖转化为酒精和二氧化碳”等有关内容,而且印象深刻。使我们养成很好的节约意识。 1.闻到了发酵后特殊的甜酒的芳香气味。 2.详见【实验操作4】 3.澄清的石灰水变浑浊 实验一摇瓶发酵法制备糖化酶 (1)掌握摇床发酵法制备糖化酶的工艺流程及操作方法 (2)了解利用黑曲霉菌菌种发酵时的生长条件及注意事项 (3)熟练掌握实验过程中的无菌操作和培养条件的选择 菌种:黑曲霉 仪器:锥形瓶(500ml)、移液管、恒温水浴锅、秒表、50mL 比色管、牛皮纸、纱布(8层)、pH计。 药品:三水乙酸钠、冰醋酸、硫代硫酸钠、碘、氢氧化钠、硫酸、可溶性淀粉、玉米粉、豆饼粉、麸皮
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一、实验目的 1、抑制或杀死微生物的一些物理、化学及生物的因素抑菌、杀菌的原理。 2、掌握物理、化学及生物的因素抑菌、杀菌的试验方法。 3、了解细菌的形态特征、染色特点。 4、了解细菌在普通培养基、选择培养基、血平板上的菌落特征。 5、掌握细菌分离划线培养的方法。 6、掌握细菌的初步生化反应。 7、掌握细菌密集划线法,掌握细菌K-B药敏纸片法。 二、实验内容 1 细菌Gram’s stain染色,镜检,观察记录细菌形态和特色特征 1.1 实验原理:染色原理:G+菌与Gˉ菌细胞壁不同,G+菌比Gˉ菌细胞内核糖核酸镁盐含量高,G+菌比Gˉ等电点低。 1.2 实验步骤: 1.2.1.制片:○1涂片:取半滴生理盐水置一洁净玻片上,以无菌操作技术自平板上去菌落少许,与生理盐水混匀,均匀涂布约1cm2大小,自然干燥; ②固定:取含菌膜的玻片与酒精灯火焰上来回三次,使菌膜牢固附于玻片表面; 1.2.2染色:①初染:取结晶紫一到两滴覆盖于菌膜表面,轻微摇动,维持30〃~40〃,细流水冲洗,切勿直接冲洗涂片区域; ②媒染:取卢氏碘液1~2滴覆盖菌膜表面,轻微摇动,维持30〃~40〃,用上法细流水冲洗; ③脱色:取95%酒精2~3滴于菌膜表面,轻微摇动,局部接近无色即可, 用上法细流水冲洗; ④复染:取1:10稀释石炭酸复红覆盖涂片区域,轻微摇动,用上法细流水冲洗; ⑤吸水纸初步吸干玻片水分,然后自然干燥; 1.2.3 镜检:于涂片区域加半滴香波油,油镜(100倍目镜)下。 图1:Gram’s stain(1000×)图2:染色试验 三、分离培养 1实验原理:四区划线法是把混杂着在一起的微生物或同一微生物群体的不同细胞用接种环在平板培养基表面通过分区划线稀释而得到较多独立分布的单个细胞,经培养繁殖后生成个菌落。有时这些单菌落并非由单个细胞繁殖而来,故必须反复分离多次才能得到纯种。其原理是微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离的目的。
(完整版)馒头发酵方法与过程实验报告
馒头发酵方法与过程实验报告 馒头的发酵方法很多,有老面发酵法、酒曲发酵法、化学膨松剂发酵法、酵母发酵法等等。实验证明无论从食品营养的角度,还是从操作的角度,酵母发面都有很强的优势。用酵母发面不仅适合家庭和工业化生产线,也适合小型作坊式馒头房,特别是对于要求不增加成本的用户也是非常合适的。酵母发酵是馒头生产中最关键的环节,它对于馒头质量的好坏有着直接的关系。 一.常见的酵母发酵工艺 酵母的发酵原理是利用面粉中的糖份与其他营养物质,在适宜的生长条件下繁殖产生大量的二氧化碳气体,使面团膨胀成海绵状结构。 在酵母馒头的生产中,常见的发酵工艺简单的归纳起来主要有以下两种: 1.一次发酵法 原辅料: 和面、压面、成型、发酵、汽蒸 (1)操作方法: 和面: 将所有的原辅料一次加入和成面团,干酵母用量0.3%,鲜酵母用量为1%左右,加水量38-40%,和好的面团温度一般应控制在28℃。 成型: 馒头成型由馒头成型机来完成,家庭制作由手工完成,根据需要制成各种形状和大小的馒头坯。 发酵: 在温度30-32℃,湿度为75-80%的条件下让面团发酵35分钟。没有恒温恒湿条件的,也可以采取其它相应的保温措施。 蒸煮: 面团发酵完成以后,沸水上笼蒸20分钟。 (2)发酵特点: 用一次发酵法生产馒头,具有工艺线路短,生产周期短,生产效率高劳动强度低等许多优点,并且生产出来的馒头有很好的咀嚼感。因此该方法被许多馒头厂家广泛使用。 2.二次发酵法 部分原辅料:第一次和面、第一次发酵、第二次和面 压面、成型、第二次发酵、汽蒸 (1)操作方法: 第一次和面取30%左右的面粉加入所需的干酵母(添加量以第一次所加面粉量的0.16%计)再加上50%左右的水(加水量以第一次所加面粉量计),和成面团。 第一次发酵和好的面团在温度26-28℃,湿度70-80%的条件或温暖的自然条件下发酵8-12小时。发酵时间也可以根据自己生产的实际情况通过调整酵母的用量、两次和面时面粉的配比以及发酵温度、湿度来灵活调节。