蛋白的变性和复性备课讲稿

蛋白的变性和复性

蛋白的变性和复性

变性：蛋白质的空间结构是体现生物功能的基础，蛋白质折叠则是形成空间结构的过程。蛋白质一级结构决定其高级结构的著名学说, 认为蛋白质折叠是受热力学因素控制的. 天然蛋白质处于能量最低(即热力学最稳定)的状态. 一般来说, 天然蛋白质的结构是相对稳定的, 结构的稳定性也是其保持生物个体功能和物种的相对稳定所要求的.

蛋白质担负着复杂的生化反应, 同时在生物合成以后, 蛋白质本身也经历着繁杂的生理过程. 蛋白质自翻译以后, 还需进行一系列的翻译后过程, 包括跨膜转运、修饰加工、折叠复性、生化反应、生物降解等. 这些过程似乎都伴随着蛋白质的结构转换, 不但受蛋白质肽链自身的热力学稳定性所控制, 而且还受动力学过程控制.

变性原因：蛋白质因受某些物理或化学因素的影响，分子的空间构象被破坏，从而导致其理化性质发生改变并失去原有的生物学活性的现象称为蛋白质的变性作用（denaturation）。变性作用并不引起蛋白质一级结构的破坏，而是二级结构以上的高级结构的破坏，变性后的蛋白质称为变性蛋白。

引起蛋白质变性的因素很多，物理因素有高温、紫外线、X-射线、超声波、高压、剧烈的搅拌、震荡等。化学因素有强酸、强碱、尿素、胍盐、去污剂、重金属盐（如Hg2+、Ag+、Pb2+等）三氯乙酸，浓乙醇等。不同蛋白质对各种因素的敏感程度不同。

蛋白质变性后许多性质都发生了改变，主要有以下几个方面：

（一）生物活性丧失

蛋白质的生物活性是指蛋白质所具有的酶、激素、毒素、抗原与抗体、血红蛋白的载氧能力等生物学功能。生物活性丧失是蛋白质变性的主要特征。有时蛋白质的空间结构只有轻微变化即可引起生物活性的丧失。

（二）某些理化性质的改变

蛋白质变性后理化性质发生改变，如溶解度降低而产生沉淀，因为有些原来在分子内部的疏水基团由于结构松散而暴露出来,分子的不对称性增加，因此粘度增加，扩散系数降低。

（三）生物化学性质的改变

蛋白质变性后，分子结构松散，不能形成结晶，易被蛋白酶水解。蛋白质的变性作用主要是由于蛋白质分子内部的结构被破坏。天然蛋白质的空间结构是通过氢键等次级键维持的，而变性后次级键被破坏，蛋白质分子就从原来有序的卷曲的紧密结构变为无序的松散的伸展状结构（但一级结构并未改变）。所以，原来处于分子内部的疏水基团大量暴露在分子表面，而亲水基团在表面的分布则相对减少，至使蛋白质颗粒不能与水相溶而失去水膜，很容易引起分子间相互碰撞而聚集沉淀。

复性：如果变性条件剧烈持久，蛋白质的变性是不可逆的。如果变性条件不剧烈，这种变性作用是可逆的，说明蛋白质分子内部结构的变化不大。这时，如果除去变性因素，在适当条件下变性蛋白质可恢复其天然构象和生物活性，这种现象称为蛋白质的复性（renaturation）。

外源基因在大肠杆菌中的高表达常常导致包涵体的形成，虽然包涵体具有富集目标蛋白质、抗蛋白酶、对宿主毒性小等优点，但包涵体蛋白质的复性率一般都很低, 一般说来，蛋白质的复性效率在20%左右。

包涵体：包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗

粒。一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1um，具有很高的密度（约1.3mg/ml），无定形，呈非水溶性，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等

一般的水溶液很难溶解包涵体，只有在变性剂溶液中才能很好溶解，这时，溶解的包涵体蛋白获得完全变性，即除一级结构和共价件保留外，所有的氢键、疏水键全被破坏，疏水侧链全暴露。然后，在一定条件下除去变性剂促使产物蛋白完成正确的蛋白折叠过程，获得天然结构，该过程称为复性。

主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键,经过多个中间折叠最终形成天然三维结构，包涵体很可能就是表达蛋白不适当的中间折叠高浓度积聚在一起的不溶物。

由于包涵体中的重组蛋白缺乏生物学活性，加上剧烈的处理条件，使蛋白的高级结构破坏，因此重组蛋白的复性特别必要。通过缓慢去除变性剂使目标蛋白从变性的完全伸展状态恢复到正常的折叠结构，同时去除还原剂使二硫键正常形成。一般在尿素浓度4M左右时复性过程开始，到2M 左右时结束。对于盐酸胍而言，可以从4M开始，到1.5M 时复性过程已经结束。

包涵体蛋白复性方法

1稀释复性：直接加入水或缓冲液，放置过夜，缺点是体积增加较大，变性剂稀释速度太快，不易控制。目前稀释法主要有一次稀释、分段稀释和连续稀释三种方式。