westernblot原理及步骤

1.western blot

即蛋白免疫印迹( Western Blot) 是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF 膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术，现已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。

2.原理

简单来说就是原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息

3.步骤

（一）蛋白样品制备

培养的细胞（定性）

1.去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。

2.对于6孔板来说每孔加200~300uL，60~80℃的1×loading buffer。

3.刮下的细胞在EP管中煮沸10min，期间vortex 2~3次。

4.用干净的针尖挑丝，将团块弃掉，如果没有团块但有拉丝现象，可将EP管置于0℃后在

5.14000~16000g离心2min，再次挑丝。若无团块也无丝状物但溶液有些粘稠，可使用1ml注射器反

6.复抽吸来降低溶液粘滞度，便于上样。

7.待样品恢复到室温后上样。

培养的细胞（定量）

1.去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。

2.加入适量的冰预冷的裂解液后置于冰上10~20min。

3.刮下的细胞收集在EP管后超声（100~200w）3s，2次。

4.12000g离心，4℃，2min。

5.取少量上清进行定量。

6.将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀后加loading buffer后直接上样最好，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃1~2天，每次上样前98℃，3min。

（二）SDS－PAGE电泳

（1）清洗玻璃板

（2）灌胶与上样

（3）电泳

（三）转膜

（四）免疫反应

（五）化学发光，显影，定影

（六）凝胶图象分析将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。