凝胶渗透柱层析法

凝胶渗透柱层析法

南大生科院基础实验中心庄苏新、罗喜牛

4、试剂与配制：

4-1、试剂：

(1)、葡聚糖凝胶

(2)、磷酸氢二钠

(3)、磷酸二氢钠

(4)、血红蛋白

(5)、核黄素

4-2、试剂配制：

(1)、磷酸缓冲液（0.05 mol / L,pH 7.4）的配制：

分别称取磷酸二氢钠克；磷酸氢二钠克于一烧杯中，加蒸馏水毫升，搅拌溶解即可。

(2)、样品溶液的配制：

分别称取血红蛋白20.0毫克;核黄素20.0毫克于一烧杯中，加磷酸缓冲液10.0毫升，

搅拌溶解即可(2.0mg/ml)。

5、操作步骤：

（1）、选择固定层析柱：

观察层析柱底端过滤及其它部件连接是否完好？将选择的层析柱垂直固定到台式铁架上，关闭柱底端出口，并向柱内注入一定量的平衡缓冲液，然后再打开柱底端出口，排除柱低端和连接出口的塑料管道内气泡，气泡排除完毕，再次关闭柱底端出口，并在层析柱内留有适量的平衡缓冲液。

（2）、装柱方法：

将烧杯中处理好的葡聚糖凝胶，用玻棒充分搅拌成悬浮液，随即用玻棒引流缓缓倒入层析柱中，静置约5分钟（或出现明显分层现象），再打开层析柱底端出口，让其柱内液体流出，同时柱内葡聚糖凝胶此时也向柱底端下沉，当柱床体积表面不下沉时，此时的高度即为柱床体积的实际高度，观其柱床体积高度是否与实验要求相一致。如果柱床体积过高或过低，则需要弃去多余或添加适量的葡聚糖凝胶，但是，无论是弃去多余葡聚糖凝胶还是添加适量的葡聚糖凝胶，首先需要关闭层析柱底端出口。然后用玻棒将柱床体积上部（要有足够的磷酸缓冲液，便于搅匀）1/3处充分搅匀，搅匀后用滴管吸去多余的葡聚糖凝胶或继续添加适量的葡聚糖凝胶悬浮液，如此反复多次操作，直至沉积高度达到实验所需的柱床体积高度为止。同时在装柱过程中要防止柱床流干。柱装好后，应无节痕，气泡，斑纹，界面平整等。（3）、平衡方法：

柱装好后，使柱床体稳定5.0—10.0分钟，然后接上恒流泵，打开柱下端的出口，用

2.0倍于床体积的磷酸缓冲液进行充分的平衡。同时也使层析柱床体稳定。平衡完毕，关闭恒流泵，打开柱上端端口，让其柱内平衡缓冲液继续流出至与柱床体积表面相平时，关闭层析柱底端出口，准备加样。

（4）、加样方法：

加样前先启动已调试完毕的色谱工作站（如：电脑、紫外检测仪和恒流泵等装置），使整个装置处于工作状态。然后按实验要求吸取1.0毫升样液沿柱管内壁缓缓加入，加样完毕，打开层析柱底端出口，等样液面流至与柱床体积表面相平时，关闭层析柱底端出口，准备洗涤。（5）、洗涤方法：

a、洗涤柱内壁：取少量磷酸缓冲液（与上样量等体积），沿柱内壁四周缓缓加入柱内，加完毕，打开层析柱底端出口，等洗涤液面流至与柱床体积表面相平时，关闭层析柱底端出口。

重复上述方法洗涤柱内壁2次。为防止冲坏床体表面，最后一次洗涤完毕后，将柱内洗涤溶液加至2-3cm高，连接柱上端端口与已调好流速的恒流泵。

b、洗涤吸附剂表面的杂质：继续用恒流泵以0.8ml/min的流速，自动洗涤至该条件下被洗涤的峰回到基线后10分钟止，停止洗涤。洗涤完毕后，关闭恒流泵，打开柱上端端口，让其柱内洗涤缓冲液继续流出至与柱床体积表面相平时，关闭层析柱底端出口，准备洗脱。（6）、洗脱方法：

为防止冲坏柱床体表面，先将柱内加洗脱溶液至2-3cm高，此时接上已调好流速的恒流泵进行自动洗脱。当电脑屏幕出现的第二个洗脱峰回到基线后，继续洗脱10分钟，停止洗脱（约60—80分钟）。

（7）、保存和打印结果：

层析完毕，将结果保存到老师要求的文件夹中，并给出结论性的结果。

（8）、结束实验：

最后移去层析柱，回收柱内的葡聚糖凝胶，清洗层析柱和梯度混合仪装置，同时用恒流泵输送蒸馏水清洗所有与紫外检测仪相连的管道10分钟。并将所有器皿也清洗干净，结束实验。