分子信标：新型核酸分子探针要点
分子信标：新型核酸分子探针
摘要：
分子信标是基于荧光共振能量传递原理设计的一种发夹型寡聚核酸分子荧光探针，能够与待测核酸序列分子相互作用发生结构变化产生不同强度的荧光信号及电化学信号等，具有高灵敏度、高选择性、适于活体检测等优点。本文介绍了分子信标的作用原理，不同的分子信标类型以及应用，最后对前景作出了预测。
关键词：分子信标荧光探针灵敏度选择性活体检测
引言：
从20世纪60年代初至今，分子信标（Molecular beacon,MB）已被广泛地应用于生物、药物、化学等多个领域【1,2,3,4】。近年来，MB特别是基于DNA结构的MB，已成为一种重要工具，用于核酸的复制、重组、翻译和表达的研究【5,7,12】。为了满足后基因组时代的发展需求，人们通过各种分子工程策略，发展了许多敏锐性更高、选择性更优的MB。
自从1996年Tyagi和Krame【6】首次建立了分子信标探针，由于其独特的性质和多功能性，如操作简单、灵敏度高、特异性强等。在它出色地完成了液相靶标测定(实时PCR测定)任务之后，人们又将其应用于核酸实时定量测定、活体分析、化学与生物传感、疾病基因检测与诊断等研究中【8,9,10,11】。又由于易于对其进行修饰和改性，在这十来年的发展中，人们在经典分子信标模型的基础上，设计出了许多新型的分子信标，如无茎分子信标，用PNA【13】链代替ssDNA形成的PNA分子信标，以及LNA分子信标等。这些新型的分子信标是为了满足不同的需要而设计的，特异性更强，稳定性更好，为许多新的研究领域提供了一个平台。为了满足基因组学和蛋白质组学的发展，对分子信标的固定化也成了必然的发展趋势，自从谭蔚泓【14】首次将分子信标固定在硅胶上以来，固定化分子信标也迅速发展起来。尤其是后来设计的将分子信标固定在金表面【15,16】，利用金的强摩尔消光系数进行淬灭，简化了分子信标的设计，更加方便对其进行操作，大大促进了基因微阵列技术的发展。
1 分子信标的结构和作用原理
分子信标的结构(图1)：分子信标是一种设计巧妙的荧光探针。常规的分子信标是由一段包含了茎一环结构的单链寡聚核苷酸组成，形成一个发夹型结构。在其环状部分，一般是一段长度为15—30碱基的序列，能与目标分子特异结合，茎区是长度为5—8碱基的互补序列，茎区的两端分别连接有荧光基团和淬灭基团。为了保证分子信标的灵敏度和热力学稳定性，在其茎干区设计的碱基数目一般为其环区的一半。过长，则灵敏度下降；过短，则稳定性下降。由于分子信标杂交前后环状区与目标分子的双链结构之间存在热力学平衡关系，使它的杂交特异性明显高于常规的线状探针。
近来，Dubertret等【17】用金纳米粒子簇代替DABcYL做淬灭剂，可以通过调节金纳米簇的形状、大小和组成而得到不同的淬灭剂。由于金纳米簇对荧光试剂有着更高的淬灭效率，所以用金纳米粒子代替DABcYL后，大大提高了分子信标的灵敏度和特异性。其它的淬灭基团还有铜离子螯合物【18】、超分子淬灭剂【19】以及直接利用碱基【20】本身做淬灭剂等。
图1 典型分子信标结构
另一种结构的分子信标是无茎分子信标。与经典分子信标结构类似，无茎分子信标只是不再含有双链结构的茎杆区，只含有单链的环状结构，具有很好的柔韧性。目前的无茎分子信标有PNA【21,22,23】和DNA【24,25,26】两种，自由状态时，由于荧光分子与淬灭分子之间的疏水作用使得无茎分子信标近似于一个闭环结构。当分子信标与靶序列结合后，探针与靶标形成的双链由于具有刚性使得荧光分子与淬灭分子分开，荧光恢复。无茎分子信标与标准分子信标相比，由于其柔韧性增加，所以在体系中检测时，对靶标的响应加快，特异性也增强，又因为其不需要茎的结构，在设计和合成上相对简单，成本降低。但其结构上缺少了茎区，稳定性有所下降，背景荧光相对增强。
分子信标作用原理：在自由状态下，分子信标以发夹结构存在，茎区的碱基互补配对，使连接在探针的5’端荧光基团及3’端的淬灭基团相互接近(约为7—10 nm)。当一定波长的激发光照射时，荧光分子和淬灭分子之间发生荧光共振能量转移。荧光基团受激所产生的荧光被淬灭基团吸收，并以热量的形式散发，荧光几乎完全淬灭，此时荧光背景极低(如图2)。加入与环状区互补的靶核苷酸序列后，分子信标可与之形成相对刚性并且更加稳定的双链体，使茎干区的互补链被拉开，从而使得荧光基团与淬灭基团分开，空间距离增大，根据Forster理论，中心荧光能量转移效率与两者距离的6次方成反比。杂交后，分子信标的荧光几乎完全恢复。并且荧光强度与溶液中靶标序列的量成正比，所以可以用来作定量分析。
图2. 分子信标作用原理
2 分子信标的类型
2.1 双重荧光共振能量转移(FRET)分子信标
双重荧光共振能量转移(FRET)(图3)分子信标【27】是指在一个体系中同时设计了两种分子信标，只有通过这两种分子信标的相互作用才能实现检测。其中一个分子信标包含一个荧光给体基团和一个淬灭基团，另一个分子信标包含一个荧光受体基团和一个淬灭基团。在自由状态时，荧光给体基团和荧光受体基团都处于荧光淬灭状态，当在体系中加入目标分子时，这一对分子信标同时打开，荧光给体基团与荧光受体基团头对头地与目标分子特异性结合，此时，两基团彼此挨得很近(<6 nm)，发生荧光共振能量转移，给体分子将能量传递给受体分子，受体分子获得能量发出特征荧光。通常用来做荧光给体的是镧系元素螯合物，有机荧光团作为荧光受体。因为镧系元素螯合物的荧光发光寿命很长(约1 ms)，发出的光的带分布很窄，在某一些波长区域，几乎不发荧光，而且还能有效地降低荧光受体基团、实验中干扰物以及池子自身的荧光，使得在某一些波长区域的背景荧光几乎接近零，大大地提高了信噪比，从而提高了检测的灵敏度，所以很适合于作为荧光给体材料。因为常规的分子信标用于活体检测时，由于细胞内的环境比较复杂，如可能被细胞内的核酸酶降解或非特异性地与核酸结合蛋白结合，而导致假阳性信号。但采用这种双重荧光共振能量转移(FRET)分子信标，因为只有当荧光给体基团与荧光受体基团同时发生杂交时，才能发出受体基团的特征荧光，所以能大大地减小假阳性信号。与以前的双线型探针相比，采用这种方法能显著地降低由于光谱重叠而产生的高背景信号，提高检测灵敏度，还能区分单碱基多态性【28,29】。因此，这种分子信标将会成为基因表达实时监测，活体细胞定量检测的有力工具【30,31】。
图3 FRET双分子信标
2.2超级猝灭基团分子探针(SQ-MB)
SQ-MB是一个一端具有多个猝灭基团的荧光分子探针【32,33】，如图4所示。近年来，MB被广泛地应用于生物技术研究的各个领域。但由于MB结构中的荧光基团不能被有效地猝灭，较高的背景噪音严重影响了实际应用过程中测试结果的准确性。因此，通过结构的优化以降低体系的背景噪音越来越受到关注。据报道，应用多个猝灭基团与一个荧光基团配对，可以有效地提高猝灭效率。这是由于多个猝灭基团可以提高吸收效率、增强猝灭基团与荧光基团问的偶极一偶极配位能力，从而提高猝灭效率。
图4 包含3个淬灭基团的分子信标
2.3 锁定分子信标
随着分子生物学的发展，对分子信标的应用也不仅仅限于体外检测。活体检测是目前发展的一个很重要的方向，但由于活体内的环境比体外要复杂得多，如活体内存在的核酸酶能快速地将常规的分子信标分解，造成假阳性信号。对分子信标进行修饰【34】就是为了有效地避免核酸酶等外在物质的影响而进行的。而锁定分子信标正是为了满足这一发展需求而设计的一类稳定性、选择性和灵敏度都非常高的核酸探针。LNA【35,36】是将核苷酸中的核糖的2’一O和4’一C用一个亚甲基连结起来，形成一个核糖双环结构，改变了它的几何和立体性质，减小了核糖结构的柔韧性，从而显著地提高了它的稳定性。但修饰后的核酸依然保持了双螺旋结构，对互补链的亲和度不受影响，在水中的溶解度也能保持一样，还因其带有一定的负电荷，用带正电荷的脂质体就能很容易地将其导入细胞内，且它的合成方法也与合成DNA的方法类似。因此，鉴于LNA的上述性质，在实验室用LNA操作起来就比DNA方便，能够简化实验过程。
图5 LNA/2′-O-methyl RNA探针
Irina【37】等用LNA/2′-O-methyl RNA嵌合探针用于活细胞中mRNA中的动态成像。实验结果表明该方法与普通的分子信标相比，与mRNA的杂化率更高。
2.4 无茎分子信标
在实际的检测中，荧光基团和淬灭基团仅仅只是一个辅助基团，真正起识别作用的只是分子信标的环状部分。无茎PNA能快速地与目标链结合，减少检测时间，并且在复杂的体系中也能保持相对的稳定性。如将其与PNA 结合使用，还可用于DNA和RNA的检测，背景信号低【38】(图6)。
图6 stemless FIT–PNA beacons in the detection of complementary nucleic acids
2.5 荧光波长转移型分子信标
图7 荧光波长转移型分子信标
在常规的分子信标基础上，Carolin【39】等设计了另一种分子信标。他们在分子信标茎部加入两个发色团噻唑橙和噻唑红作为人工碱基，两者间可发生能量转移，用490nm的光照射，发射峰在670nm，由绿光变为红光，然而当该分子信标与目标链结合后，荧光降为530nm，该方法的优势在于不需要淬灭剂，而且背景信号低。
3 固定化分子信标
分子信标对靶序列的检测尽管十分灵敏，但早期发展起来的分子信标都是用于液相中的检测，这样就限制了分子信标在活体生物医学研究和DNA生物传感中的大规模应用。但如果能将不同序列的多种分子信标固定在固体基片表面，并保持其原有性质不变，无疑将可用于DNA的大规模并行检测，大大提高分析效率。而目前固定化的分子信标从检测方式上来分有基于荧光和基于电化学的两种。
3.1 基于荧光检测的固定化分子信标
这一方向的固定化分子信标开展得相对较早，而且在这几年的发展中也取得了不小的进步。谭蔚泓等【14,41】于1999年首次通过生物素一抗生物素蛋白将分子信标固定在硅片表面(图8)。他选取靠近淬灭基团的茎干区做固定点，将生物素标记到ssDNA上，因为这样对分子信标的荧光、淬灭以及杂交影响最小，再将标记好的分子信标连接到标记有亲和素的硅胶表面。为了尽可能地减小固定化的分子信标产生的光漂白现象，他们采用罗丹明作为荧光基团。这种固定化的分子信标可以用于均相液态环境以及固液界面等较为复杂的环境中，其杂交能力，亲和性等性质基本不变，能检测到的靶序列浓度达纳摩尔级。
图8 固定化分子信标
3.2 基于电化学检测的固定化分子信标
分子信标的荧光检测方法在过去的十来年中在实验室已经取得了很大的发展, 然而，固定化分子信标用于电化学检测也有报道。2011年，湖南大学的Liu C 【40】等人用固定化分子信标通过电化学方法检测铜绿单胞杆菌的rRNA，如图9所示，起初，信标环成闭合状态，当加入目标链和链霉素辣根过氧化物酶（HRP)后，分子信标构型发生改变，目标链与信标环杂交，导致茎部打开，底部的生物素结合到基底上，而HRP结合到另一端，同时产生电化学信号。该方法的检测限可达到0.012pg/mL，显示了极高的灵敏度。
图9 基于电化学方法的固定化分子信标
4 分子信标的应用
4.1 用于核酸检测分析
分子信标在液相反应体系中的一个最大的优势就是不需对多余的分子信标进行分离就可以检测，所以它最开始的应用便是用于PCR的检测体系中【42】。由于它的背景信号很低，在每一轮的反应中当在反应体系中加入与扩增序列互补的分子信标时，根据荧光强度的变化即可对扩增过程进行实时监测，还可对体系中的扩增靶标量进行定量。Michael【43】等用锁定分子信标作为荧光探针用于细胞内核酸检测在DNA的体外检测中。Wu【44】等用分子肽信标比率计传感检测核酸，通过结合核酸前后荧光截然不同的变化，该信标还可用于细胞内核酸成像。Fu【45】等用DNA酶分子信标探针用于靶诱导信号放大比色法检测核酸，该方法通过巧妙的设计，使得待检测DNA循环检测，信号放大，达到了10nm的检测限，比已报道方法低20倍。
4.2 用于蛋白质检测分析
尽管最初设计分子信标的目的是用来特异性地检测核酸，但当这些探针与蛋白质结合时，发现其荧光强度也会增加，这说明分子信标对蛋白质也有一定的识别能力，而核酸识体对蛋白质的亲和力和特异性可与蛋白质的抗体相媲美，解离常数通常在纳摩尔到皮摩尔之间，且与抗体相比具有许多优越性。如核酸识体是体外人工化学合成，合成简单，稳定性、重现性好，容易修饰，可以按需要对序列中的核苷酸定点标记各种官能团和报告基团(如荧光基团)，便于核酸识体的固
定化和信号的检测，检测目标广泛等。所以将分子信标和核酸识体有机地结合起来，这样得到的组装体叫做分子信标识体，它一般是一种单链DNA或RNA分子，通常含有25～60个核苷。
目前将分子信标识体用于蛋白质的研究中，研究得比较多的是凝血酶的检测。Zhang【46】等设计了一个基于G四聚体结构分子信标的双功能比色寡核苷酸探针，可以用于凝血酶的检测。它是将识体的两端分别连接上荧光基团和淬灭基团，在凝血酶的存在下，分子信标主要是以四螺旋(Quadruplex form)的形式存在，迫使荧光基团靠近淬灭基团，使荧光淬灭，但当不存在凝血酶时，它可以采用任意的构型，结合前后构型的变化就是分子信标识体信号转变的基础。
4.3 DNA芯片与DNA传感器
传统的DNA芯片是采用线型DNA探针作为捕获探针，这种方法最大的缺点是需要对目标链进行标记，这样既耗时耗力，又容易增加在分析过程中误差。而基于分子信标的DNA芯片，展现出更好的稳定性、选择性和更高的特异性，而且与其它类型探针的DNA芯片相比，分子信标芯片具有背景荧光低、无需除去多余的探针、可多次使用等优点。鉴于分子信标在核酸、蛋白质检测分析中的这些优点，分子信标作为生物芯片、生物传感器中的探针分子，具有很大的意义【47】。
5 小结与展望
分子信标作为一种核酸探针，由于其巧妙的设计和独特的性质，引起了研究者们极大的兴趣。尽管其最初的设计目的是利用它在检测前后荧光强度的变化来对核酸进行定量检测，特别是用作实时荧光PCR反应的探针。在这十来年的研究中，针对分子信标在实际应用中遇到的种种问题，出现了一系列新型的分子信标，从DNA→PNA→LNA，其应用领域也从对一般PCR产物进行实时定量、定性分析、基因的点突变、SNP(单碱基多态性)、等位基因分析发展到用于活体的核酸代谢分析、DNA与蛋白质相互作用分析、DNA传感器、DNA芯片等【48,49,50】。随着分子信标在分子生物学应用领域中的进一步拓宽，分子信标在以下几个方面有望得到进一步的突破：(1)在保持其精简构型的前提下，拓宽分子信标适应的条件范围，增强其稳定性，提高选择性，使其能应用于大量疾病诊断和复杂条件下基因表达检测中。(2)进一步降低背景信号，提高分子信标的信噪比，使其灵敏度和特异性有进一步的突破，如选择合适的荧光基团淬灭基团对，或对分子信标进行修饰。以满足基因结构、疾病诊断、疾病机制、药物筛选等方面的应用【51,52】。
(3)优化分子信标的碱基序列和设计，使其能更好地应用于功能基因组、蛋白质组学的研究中。
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分子信标：新型核酸分子探针要点
分子信标：新型核酸分子探针 摘要： 分子信标是基于荧光共振能量传递原理设计的一种发夹型寡聚核酸分子荧光探针，能够与待测核酸序列分子相互作用发生结构变化产生不同强度的荧光信号及电化学信号等，具有高灵敏度、高选择性、适于活体检测等优点。本文介绍了分子信标的作用原理，不同的分子信标类型以及应用，最后对前景作出了预测。 关键词：分子信标荧光探针灵敏度选择性活体检测 引言： 从20世纪60年代初至今，分子信标（Molecular beacon,MB）已被广泛地应用于生物、药物、化学等多个领域【1,2,3,4】。近年来，MB特别是基于DNA结构的MB，已成为一种重要工具，用于核酸的复制、重组、翻译和表达的研究【5,7,12】。为了满足后基因组时代的发展需求，人们通过各种分子工程策略，发展了许多敏锐性更高、选择性更优的MB。 自从1996年Tyagi和Krame【6】首次建立了分子信标探针，由于其独特的性质和多功能性，如操作简单、灵敏度高、特异性强等。在它出色地完成了液相靶标测定(实时PCR测定)任务之后，人们又将其应用于核酸实时定量测定、活体分析、化学与生物传感、疾病基因检测与诊断等研究中【8,9,10,11】。又由于易于对其进行修饰和改性，在这十来年的发展中，人们在经典分子信标模型的基础上，设计出了许多新型的分子信标，如无茎分子信标，用PNA【13】链代替ssDNA形成的PNA分子信标，以及LNA分子信标等。这些新型的分子信标是为了满足不同的需要而设计的，特异性更强，稳定性更好，为许多新的研究领域提供了一个平台。为了满足基因组学和蛋白质组学的发展，对分子信标的固定化也成了必然的发展趋势，自从谭蔚泓【14】首次将分子信标固定在硅胶上以来，固定化分子信标也迅速发展起来。尤其是后来设计的将分子信标固定在金表面【15,16】，利用金的强摩尔消光系数进行淬灭，简化了分子信标的设计，更加方便对其进行操作，大大促进了基因微阵列技术的发展。
荧光探针设计原理
荧光化学传感器是建立在光谱化学和化学波导与量测技术基础上的将分析对象的化学信息以荧光信号表达的传感装置。其主要组成部件有三个(图1．1)：1．识别结合基团(R)，能选择性地与被分析物结合，并使传感器所处的化学环境发生改变。这种结合可以通过配位键，氢键等作用实现。2．信号报告基团(发色团,F)，把识别基团与被分析物结合引起的化学环境变化转变为容易观察到的输出信号。信号报告基团起到了信息传输的作用，它把分子水平上发生的化学信息转换成能够为人感知(颜色变化)或仪器检测的信号(荧光等)。3．连接基团(S)，将信号报告基团和识别结合基团连接起来，根据设计的不同连接基团可有多种选择，一般用做连接基团的是亚甲基等短链烷基。连接基团的合适与否将直接影响是否有输出信号的产生。信号表达可以是荧光的增强或减弱、光谱的移动、荧光寿命的变化等。 图1.1荧光探针的结构 1.1.1荧光探针的一般设计原理 (1)结合型荧光探针[21] 图1.2共价连接型荧光探针 结合型荧光探针是利用化学共价键将识别基团和荧光基团连接起来的一类荧光探针，是比较常见的一类荧光探针。该类探针通过对比加入分析物前后荧光强度的变化、光谱位置的移动或荧光寿命的改变等实现对分析物的检测。在该类荧光化学传感器的设计中，必须充分考虑下列三个方面的因素。(a)受体分子的荧光基团设计、合成：考虑到用于复杂环境体系的荧光检测，要求荧光基团要有强的荧光（高荧光量子产率，有利于提高检测的灵敏性），Stokes位移要大（可有效消除常规荧光化合物如荧光素等具有的自猝灭现象），荧光发射最好要在长波长区（最好位于500nm以上，可避免复杂体系的常位于短波长区的背景荧光的干扰，另外由于长波长区发射的荧光能量的降低可减少荧光漂白现象的发生而延长传感器的使用寿命）。(b)受体
分子信标
分子信标（molecular beacon）是一种在5和3末端自身形成一个8个碱基左右的发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，两端的核酸序列互补配对，因此标记在一端的荧光基团与标记在另一端的淬灭基团紧紧靠近。并且不会产生荧光。荧光基团被激发后产生的光子被淬灭剂淬灭，由荧光基团产生的能量以红外而不是可见光形式释放出来。 分子信标的茎环结构中，环一般为15-30 个核苷酸长，并与目标序列互补；茎一般5-7 个核苷酸长，并相互配对形成茎的结构。荧光基团标记在探针的一端，而淬灭剂则标记在另一端。在复性温度下，因为模板不存在时形成茎环结构，当加热变性会互补配对的茎环双链解开，如果有模板存在环序列将与模板配对。与模板配对后，分子信标将成链状而非发夹状，使得荧光基团与淬灭剂分开。当荧光基团被激发时，因淬灭作用被解除，发出激发光子。荧光强度与溶液中模板的量呈正比。所以可以用与PCR定量分析。由于是酶切作用的存在，分子信标也是积累荧光。常用的荧光基团：FAM ，Texas Red 。 特点：采用非荧光染料作为淬灭分子，所以荧光本底低。 不足：杂交时探针不能肯定完全与模板结合，所以稳定性差，、探针合成时标记较复杂分子信标技术结合不同于荧光标记，可用于基因多突变位点同时分析和结核杆菌耐药基因rpoB的耐药分析不足 2结构分子信标的设计一般包括三个部分： （1）环状区：一般为长度15～30碱基的序列，能与目标分子特异结合； （2）信标茎干区：通常为长度5～8 个碱基的互补序列，茎干区与杂交后环状区- 目标分子的双链结构之间的热力学平衡关系，使分子信标的杂交特异性明显高于常规的 线状探针； （3）荧光基团和淬灭基团，荧光基团一般联接在信标分子的5 端；淬灭基团联接 在3’端。图1 为经典的分子信标结构，其中1—氨基萘—8—羧酸(EDANS)为荧光素, 二甲氨基偶氮苯甲酰(DABSYL)为淬灭剂。分子信标中常用4—(4’—二甲基氨基偶氮 苯基)苯甲酸(DABCYL)作为淬灭基团，德克萨斯红(TexasRed)、荧光素(Fluoresein)等作 为荧光基团。 3原理自由状态时，发夹结构的两个末端，使荧光分子与猝灭分子靠近(约为7— 10nm)。此时发生荧光共振能量转移,使荧光分子发出的荧光被猝灭分子吸收并以热的形式散发，荧光几乎完全被猝灭，荧光本底极低。，当分子信标与序列完全互补的靶标分子结合形成双链杂交体时，信标茎杆互补区被拉开，荧光分 子和猝灭分子距离增大。根据Foerster理论, 中心荧光能量转移效率与两者距离的6 次方成反比。杂交后，信标分子的荧光几乎100%恢复。且所检测到的荧光强度与溶液中靶标的量成正比。 4应用（1）核酸检测分析 （2）分子信标用于研究DNA—蛋白质的相互作用 （3）分子信标用作生物芯片和生物传感器的探针
荧光探针汇总
1.Fluo-3 AM （钙离子荧光探针） 原理Fluo-3 AM是一种可以穿透细胞膜的荧光染料。Fluo-3 AM的荧光非常弱，进入细胞后可以被细胞内的酯酶剪切形成Fluo-3，从而被滞留在细胞内，和细胞内游离 的钙离子结合，结合钙离子后可以产生较强的荧光。 生理意义细胞内钙离子增多是细胞损伤的结果，因此此探针能表征细胞损伤程度 激发波长506nm 发射波长526nm （绿色） 备注推荐使用 2.Mag-fura-2 AM（钙离子荧光探针） 原理Fura-2 AM是一种可以穿透细胞膜的荧光染料。Fura-2 AM进入细胞后可以被细胞内的酯酶剪切形成Fura-2，从而被滞留在细胞内。Fura-2可以和钙离子结合，结合 钙离子后在330-350nm激发光下可以产生较强的荧光，而在380nm激发光下则会 导致荧光减弱。这样就可以使用340nm和380nm这两个荧光的比值来检测细胞内 的钙离子浓度，可以消除不同细胞样品间荧光探针装载效率的差异，荧光探针的渗 漏，细胞厚度差异等一些误差因素。 生理意义细胞内钙离子增多是细胞损伤的结果，因此此探针能表征细胞损伤程度 激发波长为340nm和380nm 发射波长510nm （蓝色） 备注仪器滤光片不适用 3Fluo-4-AM （钙离子荧光探针） 原理Fluo 4 是一种将Fluo 3结构中的Cl替换成F的钙荧光探针。由于将Cl替换成了电子吸引力更强的F，它的最大激发波长会向短波长处偏离10 nm左右。所以用氩 激光器激发时，Fluo 4的荧光强度比Fluo 3强1倍。由于Fluo 4与钙离子的亲和力 和Fluo 3近似，所以使用上和Fluo 3也基本相同 生理意义细胞内钙离子增多是细胞损伤的结果，因此此探针能表征细胞损伤程度 激发波长494nm 发射波长516nm （绿色） 备注用激光器激发时荧光强度强，因此不推荐 4.DCFH-DA （活性氧荧光探针） 原理DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。 生理意义检测细胞内活性氧表征细胞损伤程度 激发波长485nm 发射波长520nm （绿色） 备注推荐使用 5.DHR 123 （活性氧荧光探针） 原理本身无荧光, 在超氧化酶存在时可被过氧化氢(H2O2)氧化, 转变成发射绿色荧光的罗丹明123 (Rhodamine 123), 因此广泛应用于检测细胞内活性氧(ROS), 如过氧化物, 次氯酸和过氧亚硝基阴离子等。 生理意义检测细胞内活性氧表征细胞损伤程度 激发波长507nm 发射波长529nm （绿色） 备注氧化后成罗丹明123，荧光强度可能受到线粒体膜电位的影响 6.RhodamineI23 （线粒体膜电位荧光探针） 原理细胞膜通透的阴离子绿色荧光染料, 能够迅速被活线粒体摄取, 而无细胞毒性。 生理意义标记线粒体膜电位 激发波长488nm 发射波长515 ~ 575nm （绿色） 生理意义检测线粒体膜电位
核酸检测基本 知识
核酸检测基本知识 1.什么是核酸检测 核酸的定义：核酸是由核苷酸或脱氧核苷酸通过3′，5′-磷酸二酯键连接而成的一类生物大分子。 核酸具有非常重要的生物功能，主要是贮存遗传信息 和传递遗传信息。 2.核酸的分类 核酸大分子可分为两类：脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）。 3.核酸的组成
DNA和RNA都是由一个一个核苷酸(nucleotide)头尾相连而形成的，由C、H、O、N、P，5种元素组成。DNA是绝大多数生物的遗传物质，RNA是少数不含DNA的病毒（如HIV病毒，流感病毒，SARS病毒等）的遗传物质。RNA平均长度大约为2000个核苷酸，而人的DNA却是很长的，约有3X10^9个核苷酸。 4.核酸的功能 在蛋白质的复制和合成中起着储存和传递遗传信息的 作用。核酸不仅是基本的遗传物质，而且在蛋白质的生物 合成上也占重要位置，因而在生长、遗传、变异等一系列 重大生命现象中起决定性的作用。 DNA与RNA都是核酸，它们在化学组成上有什么区别如 下： DNA与RNA的比较DNA RNA 主要存在部位细胞核细胞质 基本组成单位脱氧核苷酸核糖核苷酸碱基种类A、G、C、T A、G、C、U 五碳糖种类脱氧核糖核糖 核苷酸链两条脱氧核苷酸链一条核糖核苷酸链 5.检测方法 核酸检测方法，主要通过同时进行靶核酸扩增和可检 测信号的生成来检测样品中的靶核酸。可应用于临床微生
物学、血液筛选、遗传病诊断和预防、法医学等领域的核 酸检测。 目前主要使用的方法有以下几种： a.核酸序列依赖性扩增法 NASBA是由一对引物介导的、连续均一的、体外特异性 核苷酸序列等温扩增RNA的新技术。反应在42℃进行,可在2h内将RNA模板扩增约109倍。NASBA原理是提取病毒RNA,加入AMV逆转录酶、RNA酶H、T7RNA聚合酶和引物进行扩增。 整个反应分非循环相和循环相:在非循环相中,引物I与模板RNA退火后在AMV逆转录酶的作用下合成cDNA,形成RNA:DNA 杂合体,随即RNaseH降解RNA,引物Ⅱ与cDNA退火,在反转录酶作用下合成第2条DNA互补链。双链DNA可在T7RNA聚合酶的作用下,经其启动子序列起动而转录RNA，RNA又可在反转录酶的作用下反转录成DNA，进入循环相,对模板进行大量 扩增。 b.转录介导的扩增技术 TMA技术原理与NASBA基本一致，略有不同之处是TMA利用的是MMLV逆转录酶及T7RNA聚合酶两种酶，MMLV逆转录酶既有逆转录酶的活性又具有RNA酶H活性。反应在41.5℃进行,可在1h内将RNA模板扩增约109倍。 c.连接酶酶促链式反应(LCR) LCR是基于靶分子依赖的寡核苷酸探针相互连接的一种
用金纳米-分子信标的荧光定量PCR新技术研究6个miRNAs在心肌缺血患者中的表达
·基础实验研究论著· 用金纳米－分子信标的荧光定量ＰＣＲ新技术研究６个 ｍｉＲＮＡｓ在心肌缺血患者中的表达＊ 何凤屏，徐 新，马绍椿，唐良秋，刘凤莲，马占忠，刘彦明 （汕头大学医学院附属粤北人民医院心血管研究所，广东韶关５１２０２６） 摘 要：目的 探讨新建立金纳米－分子信标探针的实时荧光定量ＰＣＲ技术及其分析不同程度心肌缺血患者的６个微小ＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ，ｍｉＲＮＡ）：ｍｉＲＮＡ－１、ｍｉＲＮＡ－２１、ｍｉＲＮＡ－１３３、ｍｉＲＮＡ－１９９、ｍｉＲＮＡ－２０８、ｍｉＲＮＡ－４９９的表达水平。方法 用新构建金纳米－分子信标探针引入实时荧光定量ＰＣＲ技术分析２００例不同程度心肌缺血患者血清中的以上６个ｍｉＲＮＡｓ的表达水平，并用ｘＭＡＰ液态芯片技术验证以上ｍｉＲＮＡｓ的表达。结果 急性心肌缺血组：在急性心肌梗死（ＡＭＩ）发病后１～３ｈ检测到ｍｉＲＮＡ－２１、ｍｉＲＮＡ－１３３、ｍｉＲＮＡ－１９９、ｍｉＲＮＡ－２０８、ｍｉＲＮＡ－４９９的表达上调；慢性心肌缺血组：通过对原发性高血压并发心肌缺血患者研究显示ｍｉＲＮＡ－２１、ｍｉＲＮＡ－１３３、ｍｉＲＮＡ－１９９、ｍｉＲＮＡ－１的表达上调，以上两组分别与健康对照组比较差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０．００１）。新构建的金纳米－分子信标探针检测的特异度为８６．７％，灵敏度为９０．２％，均高于常规分子信标（５３．４％、６６．８％），两种方法比较差异有统计学意义（Ｐ＜０．００１），与ｘＭＡＰ液态芯片技术比较差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５）。结论 新建立的金纳米－分子信标探针的实时荧光定量ＰＣＲ技术可作为早期检测ｍｉＲＮＡｓ新的实验方法，为心肌梗死患者的早期诊断提供新的检测手段。 关键词：金纳米； 核酸探针； 微ＲＮＡｓ； 聚合酶链反应； 心肌缺血 ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７３－４１３０．２０１３．０４．００２文献标识码：Ａ文章编号：１６７３－４１３０（２０１３）０４－０３８７－０３ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｓｉｘ ｍｉＲＮＡｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｅａｃｏｎ ａｎｄ ｇｏｌｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ＊ Ｈｅ Ｆｅｎｇｐｉｎｇ，Ｘｕ Ｘｉｎ，Ｍａ Ｓｈａｏｃｈｕｎ，Ｔａｎｇ Ｌｉａｎｇｑｉｕ，Ｌｉｕ Ｆｅｎｇｌｉａｎ，Ｍａ Ｚｈａｎｚｈｏｎｇ，Ｌｉｕ Ｙａｎｍｉｎｇ （Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，ｔｈｅ Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ Ｙｕｅｂｅｉ Ｐｅｏｐｌｅ′ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｓｈａｎｔｏｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｏｇｕａｎ，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ５１２０２６，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｕｓａｇｅ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒａｔｉｏｎ（ＲＴ－ＰＣＲ）ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｕ－ｔｉｌｉｚｉｎｇ ｇｏｌｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ（ＡｕＮＰ）ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｅａｃｏｎ（ＭＢ）ｐｒｏｂｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ６ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ（ｍｉＲＮＡｓ）ｉｎ ｐａ－ｔｉｅｎｔｓ ａｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｔａｇｅ ｏｆ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ６ｍｉＲＮＡｓ ｉｎ ２００ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｉｓｃｈｅｍｉｃｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ，ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｗｅｒｅ ｖａｌｉｄａｔｅｄｂｙ ｆｌｅｘｉｂｌｅ ｍｕｌｔｉ－ａｎａｌｙｔｅ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ（ｘＭＡＰ）．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｇｒｏｕｐ ｗｉｔｈ ａｃｕｔｅ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ，ｔｈｅ ｓｅｒｕｍ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｍｉＲＮＡ－２１，ｍｉＲＮＡ－１３３，ｍｉＲＮＡ－１９９，ｍｉＲＮＡ－２０８ａｎｄ ｍｉＲＮＡ－４９９ｗｅｒｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｉｎ １－３ｈｏｕｒｓ ａｆｔｅｒ ｔｈｅ ｏｎｓｅｔ ｏｆ ａｃｕｔｅｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ．Ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｇｒｏｕｐ ｗｉｔｈ ｃｈｒｏｎｉｃ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ，ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｉＲＮＡ－２１，ｍｉＲＮＡ－１３３，ｍｉＲＮＡ－１９９ａｎｄ ｍｉＲＮＡ－１ｗｅｒｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｐｒｉｍａｒｙ ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ ａｎｄ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ．Ａｎｄ ｔｈｅ ｅｘ－ｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉＲＮＡｓ ｍｅｎｔｉｏｎｅｄ ａｂｏｖｅ ｗｅｒｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｈｉｇｈｅｒ ｉｎ ｔｈｅ ｔｗｏ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｇｒｏｕｐｓ ｔｈａｎ ｔｈｏｓｅ ｉｎ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０．００１）．Ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｗａｓ ８６．７％ａｎｄ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｗａｓ ９０．２％ｏｆ ＡｕＮＰ－ＭＢ ａｓｓａｙ，ｗｈｉｃｈ ｗｅｒｅ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ５３．４％ａｎｄ ６６．８％，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｏｆ ＭＢ ａｓｓａｙ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｎｏｖｅｌ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ＲＴ－ＰＣＲ ａｓｓａｙ ｕｓｉｎｇ ＡｕＮＰ－ＭＢ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｉｎｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ，ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅａｒｌｙ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉＲＮＡｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｅａｒｌｙ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅｓ； ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ； ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ； ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ 近年来，国内外报道ｍｉＲＮＡｓ在心血管病理生理中发挥着重要的调控作用，ｍｉＲＮＡｓ的特异性表达使其可能成为心肌损伤的重要分子标志物［１－２］。因此，建立一种特异性强、灵敏度高、成本较低检测ｍｉＲＮＡｓ的实验方法是目前国内外研究热点。本文拟采用新构建金纳米－分子信标探针引入实时荧光定量ＰＣＲ技术分析２００例不同程度心肌缺血患者的６个ｍｉＲ－ＮＡｓ：ｍｉＲＮＡ－１、ｍｉＲＮＡ－２１、ｍｉＲＮＡ－１３３、ｍｉＲＮＡ－１９９、ｍｉＲ－ＮＡ－２０８、ｍｉＲＮＡ－４９９表达水平的变化以及建立早期诊断不同程度心肌缺血的实验方法，现报道如下。 １ 资料与方法 １．１ 一般资料 １．１．１ 样本 选取２０１０年３月至２０１１年１０月在粤北人民医院心内科住院的心肌缺血患者２００例［包括１００例急性心肌梗死（ＡＭＩ）组和１００例原发性高血压并发心肌缺血组］作为研究组，年龄４５～６５岁，其中男１２４例，女７６例；同时选取１００例粤北人民医院健康体检人群作为对照组，所有受试者均签有知情同意书。以上受试者清晨空腹肘静脉采血６ｍＬ，其中３ｍＬ用于检测心肌损伤标志物，另３ｍＬ用于检测６个ｍｉＲ－ＮＡｓ。 心肌梗死的诊断标准是根据心肌梗死全球统一定义的诊断标准［３］。 原发性高血压诊断标准：根据１９９９年《ＷＨＯ／国际高血压学会高血压防治指南》收缩压大于或等于１４０ｍｍＨｇ（２１．３ｋＰａ）和／或舒张压大于或等于９０ｍｍＨｇ（１２．６ｋＰａ）定义为高 · ７ ８ ３ · 国际检验医学杂志２０１３年２月第３４卷第４期 Ｉｎｔ Ｊ Ｌａｂ Ｍｅｄ，Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２０１３，Ｖｏｌ．３４，Ｎｏ．４ ＊基金项目：广东省自然基金资助项目（编号９１５１００８９０１００００３９）。 作者简介：何凤屏，女，教授，主要从事心血管疾病的分子诊断研究。
荧光探针汇总
精心整理 1. Fluo-3AM （钙离子荧光探针） 原理Fluo-3AM 是一种可以穿透细胞膜的荧光染料。Fluo-3AM 的荧光非常弱，进入细胞后可以 被细胞内的酯酶剪切形成Fluo-3，从而被滞留在细胞内，和细胞内游离的钙离子结合，结合钙离子后可以产生较强的荧光。 生理意义细胞内钙离子增多是细胞损伤的结果，因此此探针能表征细胞损伤程度 激发波长506nm 发射波长526nm （绿色） 备注推荐使用 2. Mag-fura-2AM （钙离子荧光探针） 原理Fura-2AM 是一种可以穿透细胞膜的荧光染料。Fura-2 AM 进入细胞后可以被细胞内的酯 3 4. 成5. 原理本身无荧光,在超氧化酶存在时可被过氧化氢(H2O2)氧化,转变成发射绿色荧光的罗丹明 123(Rhodamine123),因此广泛应用于检测细胞内活性氧(ROS),如过氧化物,次氯酸和过氧亚硝基阴离子等。 生理意义检测细胞内活性氧表征细胞损伤程度 激发波长507nm 发射波长529nm （绿色） 备注氧化后成罗丹明123，荧光强度可能受到线粒体膜电位的影响 6. RhodamineI23（线粒体膜电位荧光探针） 原理细胞膜通透的阴离子绿色荧光染料,能够迅速被活线粒体摄取,而无细胞毒性。 生理意义标记线粒体膜电位 激发波长488nm 发射波长515~575nm （绿色） 生理意义检测线粒体膜电位
备注正在使用 7.Hoechst33342（DNA荧光探针） 原理Hoechst33342是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂，常用于细胞凋亡检测。Hoechst 染料可透过细胞膜在聚AT序列的富集区域的小沟处与DNA结合并对DNA染色而发出强 烈的蓝色荧光。 生理意义标记双链DNA 激发波长355nm发射波长465nm（蓝色） 备注正在使用 8.FDA 原理FDA可透过细胞膜并作为荧光素积蓄在活细胞内。 生理意义反映细胞膜完整性和细胞活力 9.PI（ 倍。 10.EB 11.DAPI 20 12.CalceinAM 原理Calcein-AM由于在Calcein(钙黄绿素)的基础上加强了疏水性，因此能够轻易穿透活细胞膜。当其进入到细胞质后，酯酶会将其水解为Calcein(钙黄绿素)留在细胞内,发出强绿色 荧光，且细胞毒性很低，适合用于活细胞染色。 生理意义检测细胞膜完整性 激发波长494nm发射波长517nm（绿色） 备注跟FDA功能类似，细胞毒性很低，可以长时间标记细胞，但价格比较贵 13.BCECF-AM(pH荧光探针) 原理BCECF-AM是一种可以穿透细胞膜的荧光染料，BCECF-AM没有荧光，进入细胞后被细胞内的酯酶水解成BCECF，从而被滞留在细胞内。BCECF在适当的pH值情况下可以被激发 形成绿色荧光。 生理意义检测细胞内pH
如何自制核酸探针
如何自制核酸探针？ 什么是核酸探针？ 核酸探针是能与特定的靶分子发生特异性结合的一段核苷酸分子。通过在核酸探针上连接一些小分子化合物，如生物素、荧光素、地高辛等，或者放射性同位素标记核苷酸，可以达到检测靶基因序列和纯化的目的。这一过程被称为核酸杂交。其原理是碱基互补的两条核酸分子退火形成双链。 探针应用 核酸探针技术作为分子生物学中最常见的技术之一，是印记杂交，原位杂交，实时荧光PCR，microarray（微阵列）等技术不可或缺的组成部分。探针技术能定性或者检测特异性DNA/RNA序列，还可用于病原微生物和寄生虫的检测，疾病诊断等领域。 探针制备 探针标记主要分为放射性和非放射性标记法。探针制备流程如图1所示。Southern印迹、Northern印迹等需要较长的DNA探针，常使用缺口平移法和随机引物法进行标记。而这些方法对于较短的DNA（200 bp以下）来说，效率很低，常使用末端标记法。除了这三种方法，常见的还有PCR标记法。 图1. 探针制备流程。 随机引物法 随机引物法的原理是利用随机引物（random primer，即DNA 水解、分离得到的六聚脱氧核苷酸作）与单链DNA随机互补结合，在Klenow大片段酶的作用下，合成互补链，直至下一个引物。如果模板是RNA，则使用反转录酶。随机引物法可以使标记均匀跨越探针全长。相比于缺口平移法，探针的活性更高，但是产量相对较低。
图2. 随机引物法的原理。 Protocol 试剂： [α-32P]dCTP (3000Ci/mmol), dATP,dTTP,dGTP (5 mmol/L),Klenow大片段（2U/uL），模板，随机引物， NA终止/贮存缓冲液（50 mmol/L Tris-Cl (pH 7.5)，50 mmol/L NaCl，5 mmol/L EDTA (pH 8.0)，0.5% (m/V) SDS） 5X 随机引物缓冲液（250 mmol/L Tris (pH 8.0)，25 mmol/L MgCl2，100 mmol/L NaCl，10 mmol/L 二琉苏糖醇（DTT)，1 mol/L HEPES ( 用 4 mol/L NaOH 调至 pH 6.6），1 mol/L DTT 贮存于 -20℃，临用前用水稀释，使用后弃去稀释的 DTT。） 实验步骤： 1、在一个 0.5 mL 的微量离心管中加入溶于 30 uL 水的模板 DNA ( 25 ng ) 及 1 uL 随机脱氧核苷酸引物（约 125 ng）。 2、使用PCR或者预热的水浴锅95℃热变性10min，迅速放冰上1min。 3、4℃离心混合物10s，重新置于冰上。 4、引物和模板的混合物中加入： dATP, dTTP, dGTP 各1 uL 5X 随机引物缓冲液 10 uL
分子信标PCR检测志贺菌ipaH基因_赵丽华.caj
志贺菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）细菌通称痢疾杆菌，在我国感染性腹泻病原菌中居首位，是一类具有高度传染性和危害严重的革兰阴性肠道致病菌，每年全球有１．６亿人患病，约有１１０万人死亡，绝大多数为５岁以下儿童［１］。 抗生素的大量使用，导致Ｓｈｉｇｅｌｌａ耐药菌株不断增加，使治疗越来越困难。因此，准确、快速的检验手段是对细菌性食物中毒病原菌进行有效、迅速的预防和控制的迫切需要。 传统的检测方法费时、费力，近年来，随着微生物基因组学的发展，微生物基因检测迎来了新的机遇。１９９６年，由ＴＹＡＧＩ等［２］首次建立一种新型分子信标荧光探针技术，其特异性好、灵敏度高。目前，尚无Ｓｈｉｇｅｌｌａ分子信标探针应用的研究。本研究试图将分子信标探针技术应用于 Ｓｈｉｇｅｌｌａ的检测。 １ 材料与方法 １．１ 菌株与试剂１．１．１ 样本来源 福氏志贺菌（２αＴ３２）１株、 痢疾志贺菌（４８０９７）１株、 宋氏志贺菌（５１２８３）１株、大肠杆菌（８０９９）１株、肠炎沙门菌（５００４１）１株、金黄色葡萄球菌（６５３８）１株、 Ｔｏｐ１０大肠杆菌１株，由本系保存；福氏志贺菌（５０７０５６）２ 株、鲍氏志贺菌（２２０５０）１株、宋氏志贺菌（０５０１２）１株，由南方医院检验科惠赠；福氏志贺菌（临床分离株）３株、宋氏志贺菌（临床分离株）２株，由广州市疾病预防控制中心惠赠；福氏志贺菌（临床分离株）２株、痢疾志贺菌（临床分离株）１株、链球菌（临床分离株）１株，由广东省武警总队医院检验科惠赠；鲍氏志贺菌（５１５８２）购于中国药品生物制品检定所；８种细菌共２１株。细菌的分离与培养均按照卫生部颁布《全国临床检验操作规程》 进行［２］。１．１．２试剂ｐＧＥＭ－Ｔ载体克隆系统为Ｐｒｏｍａｇｅ产品； ＰＣＲ产物纯化试剂盒为北京赛百盛基因有限公司产品；质 粒快速提取试剂盒为北京鼎国生物技术有限公司提供； 分子信标ＰＣＲ检测志贺菌ｉｐａＨ基因 赵丽华，周 勇，万成松＊ （南方医科大学公共卫生与热带医学学院微生物学系，广州５１０５１５） 【摘要】目的 用分子信标探针ＰＣＲ快速检测志贺菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）。方法 根据ＧｅｎＢａｎｋ上公布的福氏志 贺菌Ｍ３２０６３株ｉｐａＨ基因序列，设计引物和分子信标探针，以４种细菌进行对照，进行特异性和灵敏度分析，建立Ｓｈｉｇｅｌｌａ的实时ＰＣＲ技术快速检测，应用于食物中毒和食品检测。结果检测２０个样本，Ｓｈｉｇｅｌｌａ呈阳性，其 它呈阴性，时间约２ｈ。结论 Ｓｈｉｇｅｌｌａ分子信标探针技术具有快速、 灵敏度高、特异性强等特点，可用于Ｓｈｉｇｅｌｌａ食物中毒快速诊断和食品微生物检测，为食源性疾病的早期、准确诊断提供新的检测手段。 【关键词】Ｓｈｉｇｅｌｌａ；分子信标；实时ＰＣＲ；ｉｐａＨ中图分类号：Ｒ３７８．２５ 文献标识码：Ａ ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＳｈｉｇｅｌｌａＧｅｎｅｉｐａＨＵｓｉｎｇＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｅａｃｏｎｓ ＺＨＡＯＬｉ－ｈｕａ，ＺＨＯＵＹｏｎｇ，ＷＡＮＣｈｅｎｇ－ｓｏｎｇ （ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ＳｃｈｏｏｌｏｆＰｕｂｌｉｃＨｅａｌｔｈａｎｄＴｒｏｐｉｃａｌＭｅｄｉｃｉｎｅＳｏｕｔｈｅｒｎＭｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ５１０５１５，Ｃｈｉｎａ） 【Ａｂｓｔｒａｃｔ】 ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｄｅｖｅｌｏｐａｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｅａｃｏｎｂａｓｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＰＣＲａｓｓａｙｆｏｒｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＳｈｉｇｅｌｌａｇｅｎｅｉｐａＨ．ＭｅｔｈｏｄｓＰｒｉｍｅｒｓａｎｄｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｅａｃｏｎｗｅｒｅｄｅｓｉｇｎｅｄａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｃｏｒｅｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｉｐａＨ ｇｅｎｅｐｕｂｌｉｓｈｅｄｉｎＧｅｎＢａｎｋ． Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲｍｅｔｈｏｄｗａｓｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ．２０ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓａｍｐｌｅｓｗｅｒｅｔｅｓｔｅｄ． Ｒｅｓｕｌｔｓ Ａｌｌ Ｓｈｉｇｅｌｌａｓｔｒａｉｎｓｗｅｒｅｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓｃｏｕｌｄｂｅｏｂｔａｉｎｅｄｗｉｔｈｉｎｔｗｏｈｏｕｒｓ． Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｅａｃｏｎ－ｂａｓｅｄｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲａｓｓａｙｉｓａｒａｐｉｄ，ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ，ａｎｄｓｐｅｃｉｆｉｃｍｅｔｈｏｄ．Ｉｔｃａｎｂｅｕｓｅｄｆｏｒｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆＳｈｉｇｅｌｌａｉｎｆｏｏｄｓ． 【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】Ｓｈｉｇｅｌｌａ；ｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｅａｃｏｎ；ｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲ；ｉｐａＨ 基金项目：广东省科技计划项目（Ｎｏ．２００２Ｂ３１００１０１）。作者简介：赵丽华（１９７９～），女，硕士研究生。 ＊ 通讯作者：万成松，Ｅ－ｍａｉｌ：ｇｚｗｃｓ＠ｆｉｍｍｕ．ｃｏｍ ?论著? ［文章编号］１６７２－３６１９（２００６）０５－０４９９－０４
分子信标荧光定量PCR技术检测结核分枝杆菌方法建立及其临床应用
分子信标荧光定量PCR技术检测结核分枝杆菌方法建立及其 临床应用 摘要】目的：探析分子信标荧光定量PCR技术检测结核分枝杆菌方法建立及其 临床应用效果。方法：选取167份肺结核患者痰液为研究标本，分别采用分子信 标荧光定量PCR技术、抗酸染色法、集菌培养法对标本进行检测，回顾性分析三 种检测方法的阳性检出率。结果：分子信标荧光定量PCR技术的阳性检出率为70.66%，抗酸染色法为29.34%，集菌培养法为42.51%，分子信标荧光定量PCR 技术的阳性检出率优于其他两种检测方法（P＜0.05）。结论：分子信标荧光定量PCR技术检测结核分枝杆菌的阳性检出率、特异性、敏感性较高，可为肺结核的 临床诊断和治疗提供借鉴，值得进一步推广和应用。 【关键词】分子信标荧光定量PCR技术；结核分枝杆菌；临床应用效果 【中图分类号】R37 【文献标识码】A 【文章编号】1007-8231（2015）16-0118-02 结核病临床上较为常见的传染类疾病，结核菌入侵人体的各器官，严重影响 患者的生存质量。结核病的病原检测可为疾病的诊断和治疗提供重要依据，在结 核病的防治中也占据极其重要的地位[1]。本文选取167份肺结核患者痰液为研究 标本，对分子信标荧光定量PCR技术检测结核分枝杆菌方法建立及其临床应用效 果进行评价，具体如下。 1.资料与方法 1.1 一般资料 选取2014年1月～2014年12月我院收治的167例肺结核患者为研究资料，其中，男性患者98例，女性患者69例，年龄区间为17～62岁，平均年龄为（35.69±2.33）岁。收集167份肺结核患者痰液为研究标本，进行结核分枝杆菌 检测。 1.2方法 1.2.1分子信标荧光定量PCR技术取0.5ml标本与1ml4%的氢氧化钠溶液混合，在室内温度适宜的条件下，放置10分钟，并进行离心，将上清液去掉。稍 许沉淀后，在标本中融入0.5ml的灭菌蒸馏水，将其摇匀，离心2分钟。洗涤三 次后沉淀，并在沉淀液体中提取50μL的DNA，摇匀，冷却至室温适宜温度，离 心5分钟，取溶液上清液进行分子信标荧光定量PCR（深圳中洪博元生物技术有 限公司）检测，并严格遵守说明实施操作。 1.2.2抗酸染色法首先，使用玻璃片夹将检测标本夹住，放置在火焰高处进 行加热，使其逐渐升温，当标本出现蒸汽后离开。增加染液，继续加热，加热时 间为3～5分钟，标本冷却后，用水冲洗。其次，使用3%盐酸酒精进行脱色，时 间为0.5～1min，并用水冲洗。最后，使用碱性的美兰溶液进行复染，时间为 1min，经水洗，并使用吸水纸将水分吸干，使用油镜观察。 1.2.3集菌培养法抽取标本通过集菌器，使用生理盐水进行灭菌，并通过蛋 白水洗过滤膜进行过滤，至少需过滤三次，每次200ml。再将培养基打入到集菌 器中，完成上述操作后，将其放置在20～25℃的孵室中。 1.3 统计学处理 本研究所有数据均采用SPSS13.0统计软件进行数据统计，计数资料用%表示，以P<0.05表示差异具有统计学意义。 2.结果
地高辛标记核酸探针的标记方法
地高辛标记核酸探针的标 记方法 Last revision on 21 December 2020
地高辛标记核酸探针的标记方法 核酸探针已被广泛用于筛选重组克隆、基因多样性的种性检测和真菌种群内及种群之间的系统发育关系评价。最早使用的放射性同位素标记核酸探针具有敏感性高、特异性好、分辨力强的特点，但放射性同位素标记也存在着一系列令人困扰的问题,如成本高、探针半衰期短、放射性物质危害人体健康等。而且在进行放射性同位素标记实验时,需要有专门的实验室及相应的实验保护设施，还需要由经过培训的专业人员来操作,因而限制了在普通实验室进行分子生物学实验。 近几年发展起来的非放射性核酸探针大多通过酶促、光化学和化学手段掺入一种报道基团,这种报道基团可通过高灵敏度的冷光、荧光或金属沉淀等检测系统检测。另外,应用pH电极或感应器技术的电化学检测系统也有报道。在这些检测系统中,灵敏度最高的是生物素- 亲合素检测系统和半抗原-抗半抗原地高辛检测系统。由于生物样品中常含有内源性生物素及生物结合蛋白，生物素标记的核酸探针会发生一些非特异性结合，从而影响实验效果。与生物素-亲合素系统同样具有高灵敏度，却减少了非特异性结合的地高辛检测系统，已为人们所接受,并得到广泛的应用。 地高辛(Digoxigenin ,DIG) 又称异羟基洋地黄毒甙元，是一种类固醇半抗原分子。其化学结构如图1 所示。 采用人工方法可以将地高辛的线型间隔臂与dUTP 连接起来,形成DIG-11-dUTP，通过随机引物法或PCR法将其掺入到DNA
探针中。RNA探针的标记是使用噬菌体信息编码的RNA聚合酶，通过体外转录将DIG-11-dUTP掺入到RNA探针中。寡核苷酸探针的标记则是通过末端转移酶催化，在3'末端加上DIG-11-dUTP/dATP 或DIG-11-ddUTP 尾巴。 对于目的DNA 或RNA 来说，分子杂交后,杂交部分可通过ELISA 实验程序加以检测，即加入一种结合有碱性磷酸酶的地高辛-特异性抗体，它与地高辛半抗原分子形成酶联抗体-半抗原(DIG) 复合物，再加入相应的显色底物，使杂交部分得以显示。 1 地高辛标记核酸探针的主要标记方法 1. 1 DNA 探针的标记方法 1. 1. 1 PCR 掺入法这种标记方法是通过聚合酶链式反应，在Taq 酶的作用下，将DIG-11-dUTP 掺入到新合成的DNA 链中。以本法标记的探针不但灵敏度高，产量也很高。少量的基因组DNA(1ng～50ng) 便可直接通过PCR 进行扩增、标记。 1. 1. 2 随机引物法用随机引物法可将DIG-11-dUTP 标记于DNA 链上。为得到最佳标记效果，标记前模板DNA 需作线性处理，而且至少要用苯酚-氯仿进行一次抽提，再用乙醇沉淀。100～10000 碱基的模板链均可被有效地标记，但大于10000 碱基的模板链则需要在标记前作限制酶切消化。处理好的模板加入随机引物，按碱基互补原则，随机引物与模板DNA 退火后由Klenow 片段从引物3' 端延伸引物，便可将DIG-11-dUTP 均匀掺入到新合成的DNA 链中。
分子信标
荧光探针与荧光引物 上个世纪90年代原美国Perkin Elmer( PE)公司开发出了Taqman荧光探针定量技术，将定量PCR带入了更广阔的应用空间。Taqman探针法的出现是定量PCR技术的重要里程碑，之后在此基础上发展出了杂交探针法，以及荧光引物法，是对探针法的不断改进和简化。如果希望全面掌握定量PCR技术的研究人员就不能错过这些定量检测技术。 要提到荧光探针或者荧光引物，有一个基础概念需要首先明确，那就是荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)：一对合适的荧光物质可以构成一个能量供体(donor) 和能量受体(acceptor) 对, 其中供体的发射光谱与受体的吸收光谱重叠，当它们在空间上相互接近到一定距离(1—10 nm)时，激发供体而产生的荧光能量正好被附近的受体吸收，使得供体发射的荧光强度衰减，受体荧光分子的荧光强度增强。能量传递的效率和供体的发射光谱与受体的吸收光谱的重叠程度、供体与受体的跃迁偶极的相对取向、供体与受体之间的距离等有关。定量PCR所涉及的荧光探针和荧光引物的检测都这个FRET原理相关。实时荧光PCR中另一个很重要的概念，即Ct值.C代表循环(Cycle)，T代表阈值(Threshold).Ct值是指每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数.。一般取PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧
光本底信号，荧光阈值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可做出标准曲线.因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。 一：水解探针法 TaqMan技术原理：除了一对特异性引物，TaqMan探针法增加一条和模版互补的基因特异性探针（通常20—30bp），探针上5'端和3'端分别标记了一个报告荧光基团（供体）和一个淬灭荧光基团（受体），在反应初始（探针完整）时系统激发供体而产生的荧光信号被临近的淬灭基团吸收，所以此时检测不到供体荧光信号；而当PCR过程中TaqDNA聚合酶扩增到探针结合模版的位点时，其5'-3'核酸外切酶的活性（也就是切口平移）切割掉探针5'端的报告基团——游离的报告基团远离淬灭基团，打破能量的传递，激发报告基团产生的荧光信号就可以被荧光检测系统检测到。这样每扩增一条DNA链，就对应有一个游离的荧光分子（报告基团）形成，保证了荧光信号的累积与PCR 产物形成完全同步，因此对荧光信号进行检测就可以实时监控PCR的过程，准确定量PCR的起始拷贝数。但是实际上探针较长使得两端基团距离较远，会导致荧光淬灭不彻底，而且淬灭基团也会产生不同波长的荧光，都会使得本底偏高 MGB技术
分子信标
分子信标的原理分子信标的原理、、应用及研究进展 李舒艳 200425038 摘要：分子信标是一种设计巧妙的高灵敏度、高特异型的新型荧光标记核酸探针。本文介绍了分子信标的结构、原理、影响分子信标的主要因素、分子信标的标记及其在聚合酶链反应（PCR ）、核酸序列的分析、活细胞内核酸的动态检测、蛋白质(酶)与核酸的相互作用等方面的应用和研究进展。 关键词：分子信标；荧光核酸探针；荧光共振能量转移；聚合酶链反应（PCR ） 1996年Tyagi 和Kramer 报道了一种具有发夹结构的新型荧光核酸探针——分子信标(molecular beacon)[1]，最初目的是能在液相中定量测定靶标的量。自由状态时的分子信标呈发夹结构，此时由于荧光基团与猝灭基团靠得很近，荧光被猝灭；当与靶序列结合后，分子信标的空间构型发生改变，荧光恢复。分子信标技术以其操作简单、灵敏度高、特异性强、可对核酸进行实时定量测定、甚至可以用于活体分析等特点不仅在生物学研究中有着广泛的应用，而且在疾病基因检测与诊断等生物医学基础和临床研究中也将充当重要的角色。近来,人们通过改变经典分子信标的结构，设计出许多新型的分子信标，如用ssDNA 链做环、用RNA-DNA 双链做茎的RNA-DNA 嵌合型分子信标，用PNA 链代替ssDNA 形成的PNA 分子信标等。新型分子信标的出现为分子信标的进一步应用拓宽了领域。 1．分子信标的结构 分子信标的设计一般包括三个部分： （1）环状区：一般为长度15～30碱基的序列，能与目标分子特异结合； （2）信标茎干区：通常为长度5～8个碱基的互补序列，茎干区与杂交后环状区-目标分子的双链结构之间的热力学平衡关系，使分子信标的杂交特异性明显高于常规的线状探针； （3）荧光基团和猝灭基团，荧光基团一般联接在信标分子的5端；猝灭基团联接在3’端。图1为经典的分子信标结构，其中1—氨基萘—8—羧酸(EDANS)为荧光素,二甲氨基偶氮苯甲酰(DABSYL)为猝灭剂。分子信标中常用4—(4’— 二甲基氨基偶氮苯基)苯甲酸(DABCYL)作为猝灭基团，德克萨斯红(TexasRed)、荧光素(Fluoresein)等作为荧光基团。
生物化学与分子生物学进展(基础)期末考试总结
生物化学与分子生物学进展（基础） 概论、目的基因 分子克隆的载体 核酸序列分析 聚合酶链反应（自学） 分子克隆技术常用的工具酶（自学） 肿瘤转移的分子机制 新生血管研究与转化医学 细胞周期与细胞增殖 基因打靶的设计与实现 细胞分化的分子机制 医学系统生物学和蛋白质组学 细胞信号转导 一、1.操纵子那张图 以乳糖操纵子为例，其组成：大肠杆菌乳糖操纵子含Z、Y、A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和半乳糖苷乙酰转移酶，此外还有一个操纵序列O，一个启动子P和一个调节基因I 存在诱导物（乳糖）时，mRNA得到转录；不存在诱导物时，mRNA无法转录。 （1）阻遏蛋白的负性调节：没有乳糖存在时，I基因编码的阻遏蛋白结合于操纵序列O处，乳糖操纵子处于阻遏状态，不能合成分解乳糖的三种酶；有乳糖存在时，乳糖作为诱导物诱导阻遏蛋白变构，不能结合于操纵序列，乳糖操纵子被诱导开放合成分解乳糖的三种酶。（2）CAP的正性调节：在启动子上游有CAP结合位点，当大肠杆菌从以葡萄糖为碳源的环境转变为以乳糖为碳源的环境时，cAMP浓度升高，与CAP结合，使CAP发生变构，CAP结合于乳糖操纵子启动序列附近的CAP结合位点，激活RNA聚合酶活性，促进结构基因转录，调节蛋白结合于操纵子后促进结构基因的转录，对乳糖操纵子实行正调控，加速合成分解乳糖的三种酶。 2.概念 （1）基因诊断：利用分子生物学技术，通过检测基因及基因表达产物的存在状态，对人体疾病作出诊断的方法。基因诊断检测的目标分子是DNA、RNA，也可以是蛋白质或者多肽。（2）基因治疗：指将目的基因通过基因转移技术（病毒载体介导或者非病毒载体介导的基因转移技术）导入靶细胞内，目的基因表达产物对疾病起治疗作用。包括直接导入外源正常基因、采用适当的技术抑制细胞内过度表达的基因、将特定的基因导入非病变细胞等。（3）pBR322：大小为4.36kb的环状双链DNA，其碱基序列已经全部清楚，是最早应用于基因工程的大肠杆菌质粒载体之一，有过百个限制性内切酶切点，一种限制性内切酶只有单一切口的位点也多达数十个。 （4）pUC质粒系列：是在pBR322基础上改建成的。大小约2.69kb，去除了pBR322的抗四环素区段，含LacZ基因及其启动子的操纵基因、M13的多聚接头polylinker。含有易于检测是否有外源DNA插入的标记基因LacZα，可利用α互补原理进行蓝白筛选。 3.分子医学的主要研究内容 分子医学是指从基因的角度重新认识疾病，运用基因技术预防、诊断和治疗疾病。研究内容主要包括疾病的分子机理、基因诊断、基因治疗和基因预防这四个方面。 （1）疾病的分子机理：探索疾病的原因，是有效治疗疾病的前提。基因科学的发展，为人类从细胞内部的微观生理学和分子生物学水平上寻找病因提供了新的思路。以尿黑酸症为例，