大豆低聚糖的研究进展

大豆低聚糖的研究进展

摘要:大豆低聚糖是一种新型的功能性低聚糖,它具有许多功能特性。本文论述了大豆低聚糖的结构理化性质、生理功能、制备纯化及其测量,对大豆低聚糖的发展前景提出展望。

进一步为大豆低聚糖在食品工业中的应用和开发提供参考依据。

关键词:大豆低聚糖生理功能制备研究进展

前言

大豆低聚糖是指大豆中所含有的低聚糖类（主要成分是水苏糖，棉籽糖，蔗糖）的总称。它可作为一种甜味剂。大豆低聚糖在成熟大豆中的含量最高, 约占大豆总质量的10%。此外,大豆低聚糖中还含有葡萄糖、果糖、半乳糖肌醇甲醚、右旋肌醇甲醚等,它不能被胃酸及酶降解, 是一种功能性低聚糖]1[。

大豆低聚糖主要来源于工业上生产大豆分离蛋白( SPL) 和大豆浓缩蛋白( SPC) 副产物的乳清中。我国盛产大豆, 大豆产量在全世界排名第三, 全国现有30 多家规模较大的生产大豆蛋白的厂家, 生产1吨大豆分离蛋白就要排放10 吨大豆乳清, 因此大豆低聚糖的资源十分丰富。近年来，随着人们对大豆保健功能的关注，大豆低聚糖也日益受到重视。我国是大豆的主要生产国家之一，研制开发大豆低聚糖具有良好的条件。国外尤其是日本，对大豆低聚糖的开发和应用位居世界前列，其开发的大豆低聚糖产品在1988年已推向市场，现已广泛应用于饮料、酸奶、水产制品、果酱、糕点和面包等食品中，并形成了工业化生产规模。到目前为止, 大豆低聚糖还是美国FDA 惟一认可应用于食品中的功能性低聚糖, 我国对大豆低聚糖的研究尚属起步阶段

一大豆低聚糖的结构含量及分布

大豆低聚糖是指大豆中所含有的低聚糖类其分子结构由2～10个单糖分子以糖苷键相连接而形成的糖类总称。分子量300～2000，界于单糖（葡萄糖、果糖、半乳糖）和多糖（纤维、淀粉）之间，又有二糖、三糖、四糖之分（主要成分是指单糖数为3～4的蔗糖（双糖）、棉子糖（三糖）和水苏糖（四糖）等。）的总称。其中，蔗糖占4.2%~5.7% , 水苏糖占2.7%~4.7% , 棉子糖占1.1% ~1.3% , 此外, 还含有少量其他糖类, 如葡萄糖、果糖、右旋肌醉甲醚、半乳糖肌醇甲醚等。]2[。水苏糖和棉籽糖的化学结构式是在蔗糖分子的葡萄糖一侧，以糖苷键（一个环状单糖半缩醛（或半缩酮）羟基与另一个分子（例如醇、糖、嘌呤或嘧啶）的羟基、胺基或巯基之间缩合形成的缩醛键或缩酮键，常见的糖苷键有O-糖苷键和N-糖苷键。）分别结合两个和一个半乳糖分子构成的糖。其化学结构式见图一。水苏糖，棉籽糖广泛分布于植物中，尤以豆科植物中含量最多。

图1.大豆低聚糖的化学结构

二大豆低聚糖的理化性质]43[

大豆低聚糖浆是一种无色透明液体,甜味纯正,近似蔗糖,甜度为蔗糖70%~75%,其黏度高于蔗糖和高果糖浆( 含55%果糖的果葡糖浆),低于麦芽糖浆( 含麦芽糖55%)。大豆低聚糖与其他糖浆一样, 当温度升高时,黏度降低;大豆低聚糖的吸湿性、保湿性比蔗糖小,但优于果葡糖浆;大豆低聚糖的渗透压略高于蔗糖,低于含量为55%的高果糖浆。

大豆低聚糖浆具有良好的热稳定性、酸稳定性和酸性贮存稳定性。大豆低聚糖在温度140 ℃短时间加热时不会分解,即使加热到温度160 ℃,对水苏糖和棉子糖的破坏也很少;在酸性条件下( pH 值为5~6),将大豆低聚糖加热到温度120 ℃仍很稳定,即使在pH 值为3 的酸性条下,大豆低聚糖稳定性也优于蔗糖。

大豆低聚糖还有很好的酸性贮存稳定性, 在pH 值为3, 温度20 ℃下, 贮存120 天的残存率为85% 以上,温度37 ℃下贮存120 天的残存率仍大于60%。因此大豆低聚糖可应用于高温加热的罐头食品及酸性食品与饮料中。研究表明,大豆低聚糖具有明显抑制淀粉老化的作用，且抑制效果随着添加量的增加而加强。因此,在面包等淀粉类食品中添加大豆低聚糖,能延缓淀粉老化,防止产品变硬,延长产品的货架寿命。

三大豆低聚糖的生理功能

研究表明传统大豆发酵食品中的功能性低聚糖具有提高免疫力,降低血压,保护肝脏、促进益生菌增殖、调节肠道平衡等生理机能,通过摄入大豆低聚糖可以有效改善人体的胃肠道机能。

1 大豆低聚糖直接的生理功能

由于大豆低聚糖的难消化特性,这使之具有膳食纤维的功能[7],摄入人体后可以增加大便持水

性和容量,使其易于排出,达到防止便秘的作用。并且大豆低聚糖还可以吸附胃肠道中的阴离子和胆汁酸,从而降低血脂和胆固醇。同时它还可与进入人体胃肠道的某些病原菌细胞结合,抑制其在肠壁

上的定植和生长

,起到预防感染的作用[8]。

2 大豆低聚糖的益生机制

2.1 大豆低聚糖通过促进益生菌增殖改善胃肠道机能

由于人体中缺乏-D-半乳糖苷酶,当大豆低聚糖进入机体后并不会被分解吸收,而是进入大肠后被肠道内的乳酸菌、双歧杆菌等益生菌利用,从而使得大豆低聚糖具有促进肠道内益生菌增殖生长的作用。同时改善肠道微生态系统,进而人体健康产生良性影响[5], 其作用机制见图2。

图 2 大豆低聚糖对人体的影响

病原菌能通过其表面或绒毛上的特异性凝集素与人体肠壁黏膜上皮细胞表面上的糖类或糖蛋白相结合[10],进而附着在肠黏膜上繁殖。例如大肠埃希菌I型菌毛[9],便是与肠黏膜上皮细胞的 D-甘露糖受体结合。然而低聚糖的结构与此糖受体的结构比较相似,可以竞争性地与病原菌相结合, 从而减少其在肠道内的粘附,最终导致病原菌随粪便排出体外,从而降低对人体的危害。同时益生菌还能利用大豆低聚糖进行发酵, 产生醋酸、乳酸、植物乳杆菌素NA、乳链菌肽等抗菌物质。这些抗菌物质可以抑制外源性致病菌及人体肠道内原有有害细菌的繁殖, 同时有研究证实植物乳杆菌素NA能有效抑制李斯特菌生长繁殖,引起李斯特菌的自溶;而乳链菌肽可以对葡萄球菌、链球菌、微球菌等革兰阳性菌起到抑制作用。并且益生菌还可以分泌磷脂酸与肠黏膜形成一层生物膜屏障,使得有害微生物难以附着在肠道内,从而降低致病菌的感染机会。

2.2 促进免疫, 降胆固醇及保护肝脏的作用

乳酸菌的细胞壁主要是由肽聚糖、多糖和磷壁酸组成,肽聚糖对免疫反应具有促进作用。乳酸菌细胞壁肽聚糖的主要组分是胞壁酰二肽,它能够刺激巨噬细胞释放白细胞介素-1,从而活化 T 淋巴细胞,并诱导其产生-干扰素。细胞壁中的磷壁酸还能刺激单核细胞产生白细胞介素-1和肿瘤坏死因子。乳酸菌的代谢产物也可以增强机体的免疫力

,乳酸菌发酵能产生大量的游离氨基酸和短肽, 例如谷胱甘肽能够促进淋巴细胞的分裂反应,激活淋巴因子白细胞介素-2的活性,并且抑制内源性和外源性的致癌物。

乳酸菌还可以降低血液中胆固醇的含量,在pH 降低时,乳酸菌的共轭活性增加,使胆固醇与胆盐形成了沉淀,从而降低了血液中胆固醇的含量。GILLI- LAND[10]等进行的体外实验也表明,嗜酸乳杆菌可以降低培养液中的胆固醇含量, 而菌体细胞的胆固醇含量却增加了。其机制目前虽然还未被揭露,但是人们推测是细菌细胞吸收了肠道中的胆固醇并导致血清胆固醇含量的下降。

肠道内的腐生菌在代谢过程中会产生大量的吲哚、硫化氢、胺和酚等代谢产物[12],这些产物在肝脏中经酸降解解毒, 随后以葡糖醛酸盐和硫酸盐等形式经尿排出体外,如若它们不能被及时解毒,将导致肝功能紊乱和循环系统失常。然而大豆低聚糖能有效增殖双歧杆菌等益生菌,增殖的细菌可以通过拮抗、分泌细菌素产酸等方式抑制有害细菌的生长繁殖,并由此达到减少有害物质产生的目的。双歧杆菌[11]等益生菌还能分解一些因食物腐败变质等原因所产生的有害物质,同时产生对人体有益的物质,从而促进人体的正常新陈代谢,同时起到保护肝脏的作用。

3 抗肿瘤作用

细菌和某些植物的细胞壁可吸附肠道内的毒素,而肉类食品在烹饪过程中常产生一些诸如杂环胺、吡啶、喹啉等导致突变的物质。这些物质一旦被人体摄入后,对其健康产生潜在的威胁。大量研究表明[11], 益生菌中乳脂链球菌的胞壁肽聚糖和多糖成分可以对这类致突变物质进行吸附, 其中对最主要的致突变物吡啶的吸附率可以达到 50% 以上,而传统大豆发酵食品中的大豆低聚糖可以有效增殖人体肠道内的益生菌,从而达到抗肿瘤作用。

同时有理论表明, 传统大豆发酵食品中的大豆低聚糖被人体摄入后, 人体中的肿瘤细胞会被杀伤。其主要原因是大豆低聚糖能促进人体肠道内的益生菌增殖, 并由其激活 Mφ, 从而诱导机体产生非特异性免疫反应。激活的 Mφ可以增强其吞噬细菌的功能, 还可以使 Mφ内酸性磷酸酶的活性增高, 从而加强 Mφ的毒性。激活的 Mφ可以释放白细胞介素 2 与 IFN- γ等多种细胞因子, 这些免疫调节因子可以调节人体免疫系统, 从而增强人体的免疫机能, 达到抗肿瘤作用。

另具研究证实[6],益生菌所分泌的可溶性代谢产物可以明显降低人类肠癌细胞 HT-29 的存活率,并提高分解 HT-29 的二肽多肽酶 IV 的活性,二肽多肽酶 IV 是分解 HT-29 的特性指标,这说明乳酸菌可以促进这些肿瘤细胞的分解。然而就抗肿瘤机制而言, 还有待进一步研究。传统大豆发酵食品中的大豆低聚糖可以有效地增加益生菌的数量揭示可溶性代谢产物的含量,从而达到抑制肿瘤细胞生长的作用。

4 大豆低聚糖的其他生理功能

传统大豆发酵食品中的大豆低聚糖还可以被肠道内的益生菌发酵,进而产生有机酸,其中绝大多数的有机酸都可以被人体吸收

,为人体供应能量[14]。同时有机酸还可以有效降低肠道的pH, 从而抑制由一级胆酸转变具有致癌性的次级胆酸的反应。并且有机酸还可以与有毒的氨结合, 形成不扩散的铵离子,降低血液中氨的浓度,从而降低老年痴呆症的发病机率[13]。大豆低聚糖本身还具有一定的吸附胆固醇的作用,使之随大便排出体外,达到调节血脂[9]的目的。

四大豆低聚糖的制备

大豆低聚糖多是从生产大豆分离蛋白时的副产物大豆乳清中提取的，乳清液中含有多种低分子蛋白、多糖类、肽、低聚糖类等物质,其中碳水化合物约为62％,粗蛋白约为21％,灰分5％，其它12％，而碳水化合物中含量较高的是大豆低聚糖。以脱脂豆粕为原料，制备大豆低聚糖浆的生产工艺见图3：

图3 大豆低聚糖的生产工艺

五大豆低聚糖的提取纯化

大豆低聚糖是以工业生产大豆分离蛋白时的副产物大豆乳清为原料制得。乳清大部分为碳水化合物，约占62%，其中又含有约为42%的大豆低聚糖,乳清中其他各组份分别为：粗蛋白约21%、灰分5％、其它12％。大豆低聚糖分离纯化的典型工艺流程如下：

大豆→脱脂大豆→大豆低聚糖粗提→大豆乳清→脱除蔗糖→蛋白质分离→过渡→脱色→脱盐→浓缩→喷雾干燥→造粒→颗粒大豆低聚糖。

1大豆低聚糖的粗提

大豆低聚糖的粗提一般采取水浸取、碱液提取、膜分离技术等方法得到。其中水浸取效率较低；碱液浸取有效成分含量高，但时间太长；膜分离技术设备投资大，工艺较复杂。采用碱液为提取剂，在微波条件下提取大豆中的低聚糖，既保持了碱液提取的优点，又有操作简单、效率高、时间短的特点，是一种较佳的低聚糖提取技术。微波提取因升温速度快且受热均匀已成功用于蔗糖、辣椒素、

果胶等的提取，主要是利用微波的介电加热效应。以碱液中有效成分含量较高。有报道微波提取大豆低聚糖最佳条件为：微波功率5OOW，碱液浓度1%-2%

,提到时间6min。金华丽[15]等研究了较优的碱液提取工艺为:log脱脂大豆粉,加人150m11%浓度的Na2C03, 55℃恒温水浴加热并搅拌，浸提时间2h。而赵贵兴等研究认为pH10-12、60℃、1.5h 的提取工艺有助于大豆低聚糖的溶出。比较二者具有相似的最优工艺条件。

2脱除蔗糖

经过上述方法得到大豆乳清后，因其具有较高的蔗糖含量，糖尿病人不能直接服用，也不适用于肥胖症患者。如果脱除蔗糖，适用于所有人群，应用范围广泛。

大豆低聚糖通常通过柱层析的方法或离子交换技术脱除蔗糖，不过困难较大且成本较高。微生物发酵法是一种新型的精制大豆低聚糖的制备方法，即考虑微生物对底物利用的选择性，通过菌种的筛选，得到能选择性利用蔗糖的微生物，控制合适的发酵条件，以除去大豆低聚糖中的蔗糖。大豆乳清糖浆中含有一定量蛋白质，可以作为酵母生长的氮源，如果以之为原料，经过发酵除去蔗糖，再进行后续工序处理，则可以大幅度降低生产成本。

另外，可以利用酶技术将大豆低聚糖中的非功能性因子—蔗糖进行酶工程改性，将蔗糖转化为低聚糖。该方法可以降低大豆低聚糖中蔗糖含量，提高低聚糖的含量。使用酶工程法，可将其中约60%的蔗糖转化为低聚糖，使得最终产品的纯度达到要求。此法与日本采用的柱色谱除蔗糖方法相比，生产成本大大降低。李晓东等采用从米曲霉中提取的β-D-呋喃果糖苷酶，有效地将蔗糖水解成葡萄糖和果糖，并将果糖转移到蔗糖分子的果糖残基上，通过β糖苷键连接1-2个果糖基，形成蔗果三糖和蔗果四糖，该法可降低糖浆制品中的蔗糖含量，提高低聚糖的含量，将其中大部分的蔗糖转化为低聚糖，使其中功能性低聚糖的含量提高，后续工序更易操作。

3蛋白质的分离

大豆乳清一般通过碱提酸沉的方法分离大豆蛋白后获得，此法蛋白质分离不彻底。另外，利用醇法制取大豆浓缩蛋白过程中的也得到大豆乳清。两种大豆乳清中蛋白质含量均较高，且含有其它杂质。需经过预处理，除去大部分的残余蛋白质。

除去大豆乳清中的残余蛋白质除了加热沉淀法外，还可采用等电点法或絮凝剂法。等电点法的去除效果不太理想，絮凝剂沉淀法效果较好。可用来沉淀蛋白质的凝剂有醋酸铅、醋酸锌、石灰乳、亚铁氰化钾、硫酸铜和氢氧化铝等，其中有应用价值的是石灰乳沉淀法。

此外，还可根据蛋白质受温度、pH,金属离子浓度影响的特性，对大豆乳清采用加热、调节酸度、加人絮凝剂三种方法结合，除去大豆乳清中的蛋白质。为满足较大的蛋白质沉淀率和较高的大豆低聚糖保存率，有研究认为大豆乳清中蛋白质分离的最优工艺参数为：加热温度为80℃-90℃，pH=4.3 （可以用盐酸、碳酸或者磷酸调节，碳酸效果较好），CaCl2浓度为3%-5%，加热时间为20min。

经过沉淀离心后，乳清液中仍含有蛋白质。而这些残留蛋白具有起泡性而影响浓缩。且与糖类发生的美拉德反应，使得大豆低聚糖浆颜色发黑，味苦，质量差。因此可以再利用超滤技术有效除去残留蛋白。影响超滤过程中的主要因素是超滤液的温度、超滤压力以及超滤用膜的选择。马莺[16]等经过试验得出大豆乳清超滤的最佳条件为，超滤温度:40℃-50℃，超滤压力3.Opsi-4.5psi ,膜的截留分子量：NMWL10000。在上述条件下可以获得比较好的分离效果。

4脱色[17]

经过超滤的大豆乳清含有色素物质，如不去除会影响产品的质量。可以采用微生物絮凝剂脱色、活性炭脱色、二氧化硫脱色等。其中活性碳脱色应用较为广泛。

二扭送化硫是通过保鲜粉（连二亚硫酸钠， Na2S04）在水中的分解产生，亚硫酸（二氧化硫）能与许多有机物的双键发生加成反应，发生了此反应的有机物的吸收波长将降低，色泽变浅。亚硫酸和糖浆中两类有色物质反应：一类是含有共轭双键的色素，另一类是还原糖与氨基酸反应生成的类黑精。但是，亚硫酸与有机物的加成反应通常是可逆的，它们的结合物能分解为原来的物质，特别是在有氧或其它氧化剂存在时，反应会更多的向分解方向进行，这样被脱色的物质会重新呈现颜色,使产品色泽不稳定。

活性炭脱色主要是利用不同大小的糖分子在活性炭上吸附力的差异，再用不同洗脱条件从而达到脱色的目的。影响活性炭吸附作用的因素有活性炭用量、吸附时间、温度、粮液pH值。经过实验分析，生产中选择1.2%（对固形物）的活性炭用量和吸附时间为40min。如果延长脱色时间和增加活性炭的用量，尽管脱色率有所增加，但是糖的损失也会随之增加。温度对脱色效果的影响不显著，因此采用在40℃下吸附脱色。另外，糖液的pH控制在 3.5-4.5之间脱色较好。故活性炭对糖液脱色的最佳条件为：1.2%（对固形物）的活性炭用量，吸附时间40min，温度40℃，pH=4.O。

5脱盐

大豆蛋白乳清液经超滤、活性炭脱色后仍残留有色素物质和盐类物质，浓缩前必须经过脱盐处理。一般采用离子交换树脂脱盐。

离子交换树脂具有离子交换和吸附作用，糖液经过脱色后再用离子交换树脂精制，能除去几乎全部的灰分和有机杂质等，进一步提高纯度。离子交换树脂除去蛋白质、氨基酸、羟甲基糠醛和有色物质等的能力比活性炭强。应用离子交换树脂精制过的糖液质量大有提高，糖浆的灰分含量降低到约 0.03%，因为有色物质和能产生颜色的物质被彻底除去，放置经久也不致变色。选择使用强酸型阳离子交换树脂（O01X7）和强碱型阴离子交换树脂 (201X4）进行脱盐。离子交换的主要影响因素有糖液温度及其流速。分别在不同的温度和流速下对糖液进行离子交换脱盐，测量糖液电导率。可知，柱的脱盐效果随柱温的增加而增强，但超过50℃时变化平缓，考虑到节能间题，确定离子交换的操作温度为50-60℃为宜；随着流速的降低电导率降低，当流速达到35m3糖液/m3树脂·h 时，其电导率超于稳定，故糖液经过柱的流速应控制在35m3糖液／ m3树脂·h为宜。糖液经过上述阴阳离子交换树脂处理后，色泽明显变浅，说明离子交换树脂还有一定的吸附色素的能力，可起到辅助脱色的作用[18]。

另外，王炳南[20]也报道了电渗析脱盐系统在糖液脱盐中的应用。它是利用直流电场的作用使糖液中阴、阳离子定向迁移，并利用阴、阳离子交换膜对水溶液中阴、阳离子的选择透过性（即阳膜具有选择透过阴离子而阻挡阳离子通过的作用），使原糖液在通过电渗析器时，一部分被淡化，另一部分则被浓缩，从而达到了分离糖类和盐类的目的。此脱盐系统脱盐效果较好，处理量大，可连续进行生产，但成本较高。

6浓缩

经超滤净化和离子交换除后，选用真空浓缩将提纯后的糖液浓缩到70%（干物质）左右，浓缩过程中糖液沸点控制为70℃左右。也可以用反渗透膜对糖液进行分离浓缩。工艺设计90%以上的水透过，使低聚糖浓度达到8%以士。透过液不含低聚糖，作为工艺水回用。采用反渗透浓缩乳清液浓度可达10%，透过液中基本不含低聚糖。还可以将糖液先浓缩到50%左右，再进行喷雾干燥，可制成粉末状大豆低聚糖，经造粒制成颗粒状制品[19]。

目前, 我国生产的大豆低聚糖产品中,功性性低聚糖的含量较低,为30%~40%。利用米曲霉产生的β- D- 呋喃果糖苷酶,将大低聚糖中的蔗糖水解为葡萄糖和果糖,并将果糖转移到蔗糖分子的果糖残基础上,通过β- 1, 2- 糖苷键连接1-2 个果糖基,形成蔗果三糖或果糖, 实现低聚糖酶法改性,但此方法不适合工业生产

[。

20

]

马莺]21[研究了在制取大豆低聚糖的同时,通过酶改,将其中非功能性蔗糖转化为功能性低聚糖,以增加大豆低聚糖中功能因子的含量,提高了大豆低聚糖的功能性。

徐忠[22]等人对脱色的工艺条件进行研究,得出大豆低聚糖脱色最佳工艺条件为:活性炭用量为1.5%,pH 值为3.5, 脱色温度为50 ℃,脱色时间为40 min]22[。

六大豆低聚糖含量的测定

大豆低聚糖的分析方法有物理化学法和色谱法两大类]23[,其中物理化学法多用于定性分析。如果要求样品纯度较高,也可以进行粗略的定量测定(如蒽酮比色法和DNS 法);色谱法有纸色谱、薄层色谱、气相色谱和高效液相色谱等,其中气相色谱法( GC) 、薄层色谱法( TLC) 和高效液相色谱( HPLC) 法较为常用。

目前大豆低聚糖的检测方法虽然较多,但较准确的方法主要是气相色谱法和高效液相色谱法[25]。由于采用气相色谱法样品需制备成易挥发、对热稳定的衍生物后才能测定;而高效液相色谱法可直接测定,样品处理简单,且减少了糖的损失或偶然误差。故本文以高效液相色谱法[26]来开展检测方法的研究介绍。

1 高效液相色谱(HPLC)

1.1实验仪器与材料

1）主要仪器

日本岛津LC- 4A高效液相色谱仪,PID-2AS示差折光检测器,WatersTCM柱恒温箱, WATERS745积分仪。

2）试剂

乙晴( 色谱纯)、95%乙醇、棉子糖(光谱纯 Sig ma 生产, 以下糖的试剂同) 、水苏糖( 光谱纯)、蔗糖( 光谱纯) 、乳糖 (光谱纯) 、葡萄糖(光谱纯)、果糖( 光谱纯) 。

3）试验材料

大豆粉(100目)、其他食品( 奶粉) 。

1.2试验方法

1）色谱柱的选择

本研究共选择了氨基柱、钙离子型交换柱、铅离子型交换柱、钠离子型交换柱等四种色谱柱作为分析柱。通过不同条件下的对比实验研究, 上述色谱柱都可以有效分离测定大豆低聚糖的成分, 进行定性或定量测定。但考虑到色谱柱的使用成本( 氨基柱价格较离子柱低 4 倍) 、使用条件

( 离子交换柱要求纯水做流动相, 样液中存在的大量离子等严重影响测定结果的重现性)及寿命,选择氨基柱作为研究测定不同样品中大豆低聚糖的试验用柱更为合适。

2）色谱分析条件的选择

(1) 柱温:由于采用示差折光检测器测定糖时,温度直接影响了基线的稳定性,必须配有柱恒温室。考虑在氨基柱所能承受的最高温度为50左右,同时为缩短样品保留时间,通过30 、35 、40、45 四个柱温试验,选定柱温为40作为试验条件。本着既可使有效成分进行有效分离,又可尽量缩短分析时间的原则, 后两个流动相虽然分离效果好,但保留时间过长( 棉子糖为 22 分钟, 水苏糖36 分钟);第一种流动相则使成分无法有效分离( 蔗糖与棉子糖两成分重叠,保留时间都在 6 分钟

作用) : 70:30 的配比较合适,分离效果好,蔗糖、棉子糖、水苏糖的保留时间分别为 7. 14、11. 05、17. 45 分, 整个分离测定过程可在 20 分钟的时间内完成。

(2) 色谱条件:色谱柱: Waters Spherisorb5mNH2 4.6250mm;柱温:40;流动相:乙晴:水为

7:3;流速:1ml/min ;示差折光检测器: 量程为 0.5。

3）样品处理方法的选择

a、大豆粉

(1) 用1份水把样品溶解后,再用4份洒精定容并充分震荡溶解,滤纸过滤后滤液通过0. 45m的有机滤膜过滤后上机测定

(2) 用3份水把样品溶解后,用7份乙晴定容

并充分震荡溶解, 滤纸过滤后滤液通过 0. 45 m 的有机滤膜过滤后上机测定。

b、其他食品

除采用上述样品处理方法外,可采用盐进行沉淀。但由于处理后的样液中含有较高浓度的金属离子等,可导致色谱柱的使用寿命大大缩短,所以一般不采用。

在上述样品处理方法中, 采用与流动相相似的方法较好,可排除溶剂峰带来的干扰。

1.3 结果与分析

1.3.1 标准曲线的测定

标准溶液的配制:分别准确称取0.2500g棉子糖和水苏糖,用水溶解定容至 10ml, 浓度20mg/ ml的储备液; 然后配制成浓度分别为 2. 5、5. 0、7. 5、10. 0、15. 0mg/ml的使用液。葡萄糖、果糖、蔗糖分别配制成2mg/ml的标准溶液,用于对这三种糖进行定性。

分别吸取使用液 10ul,在 2.2 (3) 的色谱条件测定峰高。计算出回归方程，判断相关性，用于外标法进行定量测定。

2 GC法方法原理[23]

方法：用GC对糖进行定量时,对分子量大的四碳糖、五碳糖的衍生物必须选用在高温下稳定的固定液。本法给定的TMS化条件为: 在室温下, 五碳糖完全TMS化后, 至少要在7小时内保持稳定。使用不锈钢柱, 固定液用2% Silicone OV-17(担体Chromosorb W(AW, DMCS)], 采用10℃/min的程序升温分析, 进样口温度高达350℃各种低聚糖分离效果良好。方法适用于含有蔗糖、棉子糖、水苏糖等低聚糖的大豆、小豆、豌豆制品及一般农产食品。

3 薄层色谱法( TLC)[27]

方法:运用薄层层析技术分离单糖与低聚糖,展开剂为V(乙腈):V(冰乙酸):V(水)=6:3:2,显色剂为苯胺-二苯胺-磷酸,点样量为5μL,层析显色后,苯酚-硫酸法比色测定。结果:薄层层析可将大豆低聚糖中蔗糖、棉籽糖和水苏糖等组分分开,通过苯酚-硫酸法分析其中的棉籽糖,线性范围为20～80mg/mL(R2=0.9932),精密度RSD为1.56%,平均加样回收率为98.14%,RSD为3.99%。结论:以薄层层析-苯酚-硫酸法检测食品或大豆低聚糖中棉籽糖含量,测定结果与HPLC法对照,相对误差为3.22%,可用于大豆低聚糖中棉籽糖的检测。

以上3 种测定方法中, TLC 法设备简单、操作方便、成本低、重现性好, 但灵敏度和精密度较低, 因此多用于定性分析; GC 法和HPLC 法的分离效果和准确性都很好, 定性定量分析时都可采用。用GC 法测定时, 由于糖受热时没有足够的挥发性, 因此要将其制备成易挥发、对热稳定的衍生物; 用HPLC 检测时,则不必对样品进行衍生, 可以直接测定, 减少了糖的损失或偶然误差]22[, 且分离效果好,重现性及平均回收率比采用气相色谱法的好,所以是大豆低聚糖分析检测中最常采用的方法。

然而, 在使用氨基柱分离糖时,一些还原糖容易与固定相的氨基发生化学反应,产生席夫碱。因此,氨基柱的使用寿命一般较短。另外,作为流动相组分的乙腈要求纯度高,价格昂贵。乙腈是一种有毒的致癌物质,易挥发,对人体有害。因此,有人提出以十八烷基修饰的硅胶( ODS) 作为固定相,以纯水作为洗脱液来分离单糖和寡搪,其特点是流动相价廉,无污染,分离方法快速简便, 所得结果与常用的氨基柱PLC 一致。经实验研究得出, 在柱温12 ℃时可达到较好的分离效果, 流速为

1.01mL/min时, 9 min内即可以完成1个样品的分离,且流动相价廉,无污染。

除此之外,还有人用纸层析法和比色法测定大豆低聚糖的含量。这2 种方法虽然简单、快捷, 但与GC,HPLC的测糖含量方法相比, 测定结果不是特别准确, 目前仍在探索中。

七大豆低聚糖的发展前景

我国大豆资源丰富, 而大豆低聚糖具有许多重要的生理保健功能。大豆低聚糖作为一种新兴的功能性低聚糖，其产品优质，成本低，具有良好的理化性能及生理活性，附加值高，社会效益好，功效显著，可以广泛应用于食品、饮料生产、医药和饲料添加剂中，故其开发和应用具有广阔的发

展前景。我国有丰富的大豆原料且人口众多，特别是老龄人口的增多，消费市场广阔。随着人民生活水平的提高，人们的生活观念已不仅仅满足于食品表面的色、香、味、形，而是越来越向食品内在质量的科学性、结构合理性及对人体产生特殊功效的方面转变。随着消费者对健康和具有生理功能食品的重视和了解，对保健食品的需求量将会日益增加，大豆低聚糖作为低热量甜味剂和双歧杆菌增殖促进物质是很有发展前途的功能性物质。制取大豆低聚糖的原料来源广泛，价格低廉，提取、精制工艺简单，可大大提高植物蛋白生产的附加值。