菌株鉴定

菌株鉴定

姓名

摘要：pUC载体系列质粒较小，约为2.7 kb，是E.coli最常用的理想质粒克隆载体。当pUC19质粒载体导入到E.coli DH5α后，在IPTG存在下，在含有生色底物X-gal的培养基上形成蓝色菌落。另外质粒pUC19携带有氨苄青霉素抗性基因（Amp r），质粒pUC19进入E.coli DH5α后，通过α-互补作用，在MAC培养基平板上转化子利用β-半乳糖苷酶分解培养基中的乳糖产生有机酸，pH降低，培养基中的中性红指示剂变红，转化子的菌落变成红色。不含pUC19质粒的E.coli DH5α利用培养基中的有机碳源，不使培养基pH降低，在不含有氨苄青霉素的MAC培养基上形成白色菌落。本实验就是利用这些实验原理进行相应的菌株鉴定实验，其目的是更好地掌握培养基菌落生长情况及菌落颜色的原理，熟悉菌株鉴定的实验步骤，同时学会观察培养基中菌落的颜色特征。通过此次实验，我们达到了预期目的，取得了很好的实验效果。

关键词：pUC19质粒、E.coli DH5α、氨苄青霉素抗性基因（Amp r）、LB培养基、MAC培养基

1.引言

质粒是染色体外的遗传因子，广泛存在于原核生物中，在部分真核生物中也存在。细胞内自然存在的质粒通常不能作为基因工程操作的载体，需要对其进行改造，如根据载体必备的条件插入结构元件和删除质粒上非功能的DNA片段。标记基因是载体所必需的结构元件，按其用途可将标记基因分为选择标记基因和筛选标记基因。选择标记基因用于鉴别目标载体的存在，用于挑选成功转化载体的宿主细胞。筛选标记主要用来区别重组质粒与非重组质粒，将具有特殊表型的重组质粒挑选出来。α-互补是E.coli最常用的筛选标记，其原理是：β-半乳糖苷酶基因（LacZ）N端多肽和C端多肽单独存在时都无β-半乳糖苷酶活性，当两者存在于同一个细胞即可进行互补而形成完整β-半乳糖苷酶活性。在pUC系列质粒载体上插入了β-半乳糖苷酶的调控序列和β-半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编码序列，并在这个编码区域中引人多克隆位点，但不破坏LacZ的阅读框架，即不影响其正常功能。而这类载体对应的宿主菌如E.coli DH5α的染色体上整合有β-半乳糖苷酶C端序列的遗传信息。当质粒载体导入到相应宿主菌后，载体上合成的β-半乳糖苷酶N端多肽可以与宿主细胞染色体编码的C 端多肽片段互补形成完整的蛋白质，即表现出β-半乳糖苷酶活性。在乳糖或其结构类似物IPTG存在下，可以诱导β-半乳糖苷酶的合成。在含有生色底物X-gal的培养基上形成蓝色菌落。

pUC载体系列质粒较小，约为2.7kb，是E.coli最常用的理想质粒克隆载体。它们由以下结构元件构成：①来自于E.coli质粒ColE1的松弛型复制起始点。在含有氯霉素的培养基中细胞生长停止后，该复制子仍能继续复制，由此可得到大量质粒DNA。②氨苄青霉素抗性基因(Amp r)。③E.coliβ-半乳糖苷酶基因（LacZ）的启动子及编码β-半乳糖苷酶N端的DNA 序列。④多克隆位点（MCS）区段，包含十几个单一限制性内切酶识别位点，使目的DNA 片段可定向插入。

质粒载体pUC18和pUC19的结构基本相同，只是在LacZ基因的启动子后面多克隆位点的限制性核酸内切酶以互为相反方向排列。在载体pUC18中，EcoRⅠ位点紧接于启动子Plac 下游，而载体pUC19的Hin dⅢ位点紧接于Plac下游，它们共有13个单一限制性核酸内切酶位点。

质粒pUC19携带有氨苄青霉素抗性基因（Amp r），没有导入质粒pUC19的受体细胞，在

含有氨苄青霉素（Amp）培养基上不生长。质粒pUC19进入E.coli DH5α后，通过α-互补作用，形成完整的β-半乳糖苷酶。在麦康凯培养基平板上，转化子利用β-半乳糖苷酶分解培养基中的乳糖产生有机酸，pH降低，培养基中的中性红指示剂变红，转化子的菌落变成红色。不含质粒的E.coli DH5α，没有β-半乳糖苷酶活性，不能利用培养基中的乳糖产生有机酸，而是利用培养基中的有机碳源，不使培养基pH降低，在不含有氨苄青霉素的麦康凯培养基上形成白色菌落。

2.材料和方法

2.1材料和试剂

实验菌株：E.coli DH5α和E.coli DH5α（pUC19）

实验材料：LB固体培养基、氨苄青霉素母液

实验试剂：150mL LB固体培养基、200mL MAC固体培养基、IPTG母液（储存浓度为500mM）、X-gal母液（储存浓度为40mg/mL）、Amp母液（储存浓度为100mg/mL）、实验仪器：高压蒸汽灭菌锅、微量移液器、200μL黄色枪头、EP管架、接种环、恒温培养箱、酒精灯、火柴、记号笔

2.2方法

2.2.1M平板、M+Amp平板、LB平板与LB+Amp平板的制作

（1）1组、10组制作M平板

①从高压蒸汽灭菌锅里取出已经灭菌完成的盛有200mL MAC固体培养基的三角瓶。

②待其融化冷却至55～60℃左右，无菌操作，倒平板，最终每组制得10～12个平板。

③待平板凝固后标记，待用。

（2）2组、3组制作M+Amp平板

①从高压蒸汽灭菌锅里取出已经灭菌完成的盛有200mL MAC固体培养基的三角瓶。

②待其融化冷却至55～60℃左右，无菌操作，用微量移液器向培养基中加入Amp母液200μL（终浓度为100μg/mL）。

③无菌操作，倒平板，最终每组制得10～12个平板。

④待平板凝固后标记，待用。

（3）4组、5组、6组制作LB平板

①从高压蒸汽灭菌锅里取出已经灭菌完成的盛有150mL LB固体培养基的三角瓶。

②待其融化冷却至55～60℃左右，无菌操作，用微量移液器向培养基中加入IPTG母液150μL（终浓度为0.5mM），X-gal母液150μL（终浓度为40μg/mL）。

③无菌操作，倒平板，最终每组制得8～10个平板。

④待平板凝固后标记，待用。

（4）7组、8组、9组制作LB+Amp平板

①从高压蒸汽灭菌锅里取出已经灭菌完成的盛有150mL LB固体培养基的三角瓶。

②待其融化冷却至55～60℃左右，无菌操作，用微量移液器向培养基中加入IPTG母液150μL（终浓度为0.5mM），X-gal母液150μL（终浓度为40μg/mL）。

③无菌操作，用微量移液器向培养基中加入Amp母液150μL（终浓度为100μg/mL）。

④无菌操作，倒平板，最终每组制得8～10个平板。

⑤待平板凝固后标记，待用。

2.2.2 分配M平板、M+Amp平板、LB平板与LB+Amp平板

全班分配四种制作好的平板，每个小组分配得到每种平板各2个，共计8个平板。

2.2.3划线接种、培养和观察记录

无菌操作，对8个平板进行划线接种，E.coli DH5α菌株和E.coli DH5α（pUC19）菌株分别接种M平板、M+Amp平板、LB平板与LB+Amp平板。接种后将培养基置于37℃恒温培

养箱培养24～48小时。观察记录培养基中菌株的生长情况。

3.结果

实验结果由图一所示。接种E.coli DH5α菌株的MAC培养基中有白色菌落产生（图1）；接种E.coli DH5α菌株的MAC+Amp培养基中没有菌落产生（图2）；接种E.coli DH5α菌株的LB+IPTG+X-gal培养基中有白色菌落产生（图3）；接种E.coli DH5α菌株的LB+IPTG+X-gal+Amp 培养基中没有菌落产生（图4）；接种E.coli DH5α（pUC19）菌株的MAC培养基中有红色菌落产生（图5）；接种E.coli DH5α（pUC19）菌株的MAC+Amp培养基中有红色菌落产生（图6）；接种E.coli DH5α（pUC19）菌株的LB+IPTG+X-gal培养基中有蓝色菌落产生（图7）；接种E.coli DH5α（pUC19）菌株的LB+IPTG+X-gal+Amp培养基中有蓝色菌落产生（图8）。

1 2 3 4

5 6 7 8

图一各个培养基中菌落的生长情况

图1：MAC培养基接种E.coli DH5α菌株

图2：MAC培养基接种E.coli DH5α（pUC19）菌株

图3：MAC+Amp培养基接种E.coli DH5α菌株

图4：MAC+Amp培养基接种E.coli DH5α（pUC19）菌株

图5：LB+IPTG+X-gal培养基接种E.coli DH5α菌株

图6：LB+IPTG+X-gal培养基接种E.coli DH5α（pUC19）菌株

图7：LB+IPTG+X-gal+Amp培养基接种E.coli DH5α菌株

图8：LB+IPTG+X-gal+Amp培养基接种E.coli DH5α（pUC19）菌株

质粒pUC19携带有氨苄青霉素抗性基因（Amp r），导入质粒pUC19的E.coli DH5α菌株可以在含有氨苄青霉素（Amp）培养基上生长（如图6、图8所示）。质粒pUC19进入E.coli DH5α后，通过α-互补作用，形成完整的β-半乳糖苷酶。在MAC培养基平板上，转化子利用β-半乳糖苷酶分解培养基中的乳糖产生有机酸，pH降低，培养基中的中性红指示剂变红，转化子的菌落变成红色（如图5、图6所示）。

没有导入质粒pUC19的E.coli DH5α菌株，不携带氨苄青霉素抗性基因(Amp r)，在含有氨苄青霉素（Amp）培养基上不生长（如图2、图4所示）。另外E.coli DH5α菌株没有β-半乳糖苷酶活性，不能利用培养基中的乳糖产生有机酸，而是利用培养基中的有机碳源，不使培养基pH降低，因此在不含有Amp的MAC培养基上形成白色菌落（如图1所示）。

β-半乳糖苷酶基因（LacZ）N端多肽和C端多肽单独存在时都无β-半乳糖苷酶活性，当

两者存在于同一个细胞即可进行互补而形成完整β-半乳糖苷酶活性。在pUC系列质粒载体上插入了β-半乳糖苷酶的调控序列和β-半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编码序列，并在这个编码区域中引人多克隆位点，但不破坏LacZ的阅读框架，即不影响其正常功能。而这类载体对应的宿主菌E.coli DH5α的染色体上整合有β-半乳糖苷酶C端序列的遗传信息。当质粒载体导入到E.coli DH5α菌株后，载体上合成的β-半乳糖苷酶N端多肽可以与宿主细胞染色体编码的C端多肽片段互补形成完整的蛋白质，即表现出β-一半乳糖苷酶活性。在IPTG 存在下，可以诱导β-半乳糖苷酶的合成。在含有生色底物X-gal的培养基上形成蓝色菌落（如图7、图8所示）。没有导入质粒pUC19的E.coli DH5α菌株，在含有IPTG和X-gal的LB培养基上形成白色菌落（如图3所示）。

4.讨论

此次实验的重点是对培养基中有无菌落以及菌落颜色形成的原因的掌握，尤其是蓝白菌落和红白菌落形成的原因。这些实验原理掌握好便可以对实验结果进行准确地分析。本实验操作过程中无菌操作很重要，这样可以保证培养基上菌种的单一，从而保证实验结果的准确性。最后，实验结束后一定要记得及时清洗培养皿，把废弃培养基扔到垃圾袋里。

参考文献

［1］汪天虹.分子生物学实验.北京：北京大学出版社，2009年.