分子生物学

分子标志物：指可以反映机体生理、病理状态的核酸、蛋白质（多肽）、代谢产物等生物分子。

DNA结构：

DNA的二级结构是双螺旋结构：DNA分子由两条相互平行但走向相反的脱氧多核苷酸链组成，两链以-脱氧核糖-磷酸-为骨架，以右手螺旋方式绕同一公共轴盘。螺旋直径为2nm，形成大沟(major groove) 及小沟(minor groove)相间。碱基垂直螺旋轴居双螺旋内側，与对側碱基形成氢键配对（互补配对形式：A=T;G=C）。相邻碱基平面距离0.34nm，螺旋一圈螺距3.4nm，一圈10对碱基。

DNA的三级结构是超螺旋结构：DNA双螺旋链再盘绕即形成超螺旋结构。正超螺旋(positive super coil)盘绕方向与DNA双螺旋方同相同负超螺旋(negative super coil)盘绕方向与DNA双螺旋方向相反。

原核生物DNA的是环状超螺旋结构

核小体(nucleosome)

是染色质的基本组成单位，由DNA和蛋白质构成。组蛋白：H1、H2A、H2B、H3、H4 RNA结构：

一级结构：核苷酸连接方式同DNA。RNA的一级结构即指核苷酸的连接方式、数量和排列

方式。

主要结构特征：①含有稀有碱基（修饰碱基）；②不遵守Char gaff原则；③多数为单链分子，形成链内双链二级结构（发夹结构）；④碱基配对：A-U，G-C。

t RNA二级结构：DHU环反密码环额外环 TΨC环氨基酸臂

t RNA的三级结构是倒L型

t RNA的功能：活化、搬运氨基酸到核糖体，参与蛋白质的翻译。

m RNA的结构与功能:

1）基本特点：含量低（约占总RNA的1%～5%）；种类多（上万种）；分子大小差异大（几百～约2万个核苷酸）；半衰期短。

2）结构特点：编码区——决定蛋白质的一级结构，包括起始密码子、终止密码子、外显子。非编码区——与蛋白质生物合成的调控有关，包括5′非编码区（帽结构、核蛋白体识别结合位点等）、3′非编码区（多聚腺苷酸尾）、间隔序列（内含子）。大多数真核m RNA 的5′末端均在转录后加上一个7-甲基鸟苷，同时第一个核苷酸的C′2甲基化，形成帽子结构m7GpppN-。大多数真核m RNA的3′末端有一个多聚腺苷酸(poly A)结构，称为多聚A尾3）功能：作为蛋白质合成的模板。

帽子结构和多聚A尾的功能：m RNA核内向胞质的转位、m RNA的稳定性维系、翻译起始的调控

增色效应：核酸分子在变性过程中，其溶液的A260会增大，此现象称为增色效应。

融解温度（Tm）：DNA分子热变性程度达到50%时所对应的温度，称为融解温度或解链温度。

Tm的影响因素：

①DNA分子的碱基组成Tm与DNA分子碱基组成的关系 AT富集区先解链，GC富集区后解链。

②溶液的离子强度一般情况下，在低离子强度溶液中，DNA的Tm较低，

且解链温度范围较宽；在高离子强度溶液中，Tm较高，解链温度范围较窄。

③ pH 一般情况下，核酸溶液的pH在5~9范围内，DNA的Tm变化不明显；当溶液的pH<4或>11时，DNA的Tm会降低。

④变性剂 变性剂可降低DNA 的Tm

分子杂交：核酸分子杂交是指来源不同的具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下按碱基配对原则形成双链的过程。

分子杂交分类：

1.液相杂交：是指待测核酸和探针都存在于杂交液中，探针与待测核酸在液体环境中按照碱基互补配对形成杂交分子的过程。

2.固相杂交：①反向点杂交：（RDB ）：特点：高灵敏度、高特异性和准确性好等。应用：用于病原体检测，基因分型检测，基因突变检测等

②Southern 印迹：用于DNA 的检测，不但能检测出特异的DNA 片段，还能进行定位和测定分子量，可用于基因的限制性内切酶图谱分析、基因突变分析等。

③Northern 印迹:杂交用于RNA 的检测，能对组织细胞中总RNA 或mRNA 进行定性和定量分析

3.原位杂交：是细胞学技术与核酸杂交结合的一种核酸分析检测技术。用标记核酸探针与细胞涂片、压片、细胞悬液滴片或组织切片上具有互补序列的单链DNA 或RNA 进行杂交，然后通过放射自显影或酶底物显色或激发荧光等方法检测待测核酸分子。

4.DNA 芯片技术：特点：高通量、微型化、自动化。技术基础是核酸分子杂交技术 探针技术：

1.探针的种类：①DNA 探针（最常用，一般长度为400--500个碱基）：单链cDNA 是与mRNA 互补的DNA 分子。

② RNA 探针 （长度实际上取决于将重组DNA 分子线性化的限制性内切酶的酶切位点）

③寡核酸探针（一般由17--50个核苷酸组成）：易于大批量生产和标记。最大优势是可以区分仅仅一个碱基序列的靶序列，最大的缺陷是寡核苷酸不如长的杂化核酸稳定，需优化杂交和洗脱条件以保证寡核苷酸杂交的特异性。

2.标记物：①放射性标记物：H S P 33532、、

②非放射性标记物：生物素、地高辛或荧光素标记。

3.探针标记方法的选择：①随机引物的标记：最常用的DNA 探针标记，在标记dNTP 存在的条件下，DNA 聚合酶Ⅰ的Klenow 片段催化引物延伸产生标记产物。

②DNA 缺口平移标记：DNase Ⅰ和大肠埃希菌DNA 聚合酶Ⅰ的协同作用，只标记一种dNTP 。

③化学法全程标记：I 125标记法、光敏生物素标记法。

影响杂交速率和杂化分子稳定性的因素：①探针的选择。②探针的标记方法。③探针的浓度，探针用量均为0.5--5.0μg/ml 。④杂交率。⑤杂交温度（随着逼近Tm 值杂交速率降低，最佳选择低于探针Tm 值20-25℃）。⑥杂交的严谨性。

核酸酶：水解核苷酸之间的磷酸二酯键。限制性核酸内切酶及其识别位点特征: 具有回文序列结构。

基因组（genome ）：泛指一个细胞或病毒的全部遗传信息。

真核生物基因组：指一套完整单倍DNA （染色体DNA ）的全部序列，既包括编码序列，也包括大量存在的非编码序列。

原核生物基因组结构特征：其结构比较简单，通常由环状双链DNA 分子组成，具有操纵子结构，基因密度高，编码序列比例大，含有编码同工酶的同基因，不同元和生物基因组中的GC 含量变化大。其非编码区域主要是一些调控序列，细菌的基因组可产生转座现象，

还含有可以自主复制的质粒DNA。

操纵子（operon）：原核生物的绝大多数结构基因按功能相关性成簇地排列于染色体上，连同其上游的调控区（包括启动子和操作元件）以及下游的转录终止信号共同组成一个基因表达单位。

质粒：是细菌细胞内携带的染色体外的DNA分子，是共价闭合的环状DNA分子，能独立进行复制。质粒只有在宿主细胞内才能够完成自己的复制。可具有兼容性或不兼容性，可发生构象变化，出现超螺旋、半开环、线状三种构象。

质粒的生物学特性：可移动性；自我复制；携带筛选标记；不相容性

R型质粒（抗药性质粒）：生物学特性：可移动性，自我复制能力，携带筛选标记，不可相容性。

真核生物基因组结构特征：真核基因组一般比较庞大，结构基因所占的比例小，编码序列就更少，且存在大量重复序列。由染色体DNA和染色体外DNA组成，非编码序列多于编码序列，具有多基因家族和假基因

转座因子类别及其遗传效应：类别：插入序列、转座子、Mu噬菌体。遗传效应：①转座因子的转座不是本身的移动，而是由转座因子复制出一个新拷贝转移到基因组中的新位置上去。②新的转座因子转到靶点后，靶点序列会倍增成为两个靶点序列，并分别排列在转座因子的两侧，形成同向重复序列。③在转座过程中能够形成共合体。④转座因子转座后能促使染色体畸变。⑤转座因子可以从原来位置上切除，这个过程称为切离。⑥转座可引起插入突变。⑦带有标志基因，给受体基因组增添了新的基因。

真核生物基因组重复序列：高达总DNA量的50％。分为1）串联重复序列：高重复序列DNA，重复次数可高达数百万次。有卫星DNA和反向重复序列。卫星DNA又分为大卫星DNA、小卫星DNA和微卫星DNA。2）散在重复序列：中重复序列DNA：散在分布于基因组中，约占基因组DNA总量的35％，常与单拷贝基因间隔排列，有一段结构基因：HLA、rRNA、组蛋白、免疫球蛋白。

多态性：当某种变异相对常见，在群体中的频率高于1％时，则称为多态性。主要包括：限制性片段长度多态性（RELP），可通过Southern杂交等分析。小卫星和微卫星多态性（短串联重复序列多态性），通常通过PCR扩增，扩增产物通过电泳分析检测。单核苷酸多态性（SNP）可通过点杂交、PCR--RFLP、荧光定量PCR、DHPLC以及基因测序、基因芯片分析等分析。拷贝数多态性（CNP），可通过荧光原位杂交、芯片比较基因组杂交和SNP芯片检测分析。

突变：DNA序列的改变或重排，可分为：①染色体数目的改变（基因组突变）；②染色体机构的改变（染色体突变）；③涉及单个基因的突变，也是通常所讲的基因突变：点突变、插入缺失和动态突变几种类型。

人类基因组计划的内容

遗传图谱、物理图谱、序列图谱、转录图谱

DNA聚合酶的作用

1、5′→3′聚合酶活性与延伸能力

活性与校对功能（保真性）

2、5′→3′外切

酶

3、5′→3′外切酶活性与切口平移

端粒

1、端粒的结构特点

1）、GT链的5′→3′总是指向染色体的末端。

2）、重复次数不保守。

3）、链区内有缺口即游离的3′-端羟基存在。

4）、DNA的最末端不能进行末端标记，推测其分子是一个回折结构。

2、端粒酶

端粒酶的概念（telomerase）

反转录酶，由蛋白质和RNA共同组成，含有引物特异的识别位点，能以自身的RNA为模板反复延伸端粒的重复序列。

3、端粒的功能

1）保护染色体末端：使染色体末端免于被化学修饰或被核酶降解；防止端粒酶对端粒进行进一步延伸的作用。

2）防止染色体复制时末端丢失

3）决定细胞的寿命：端粒的长度决定了细胞的寿命，故而被称为“生命的时钟”。

4）固定染色体位置：人类端粒DNA和核基质中的蛋白相互作用，以′TTAGGG′结构附着于细胞核基质

与转录有关的DNA结构

1、启动子：是指DNA分子中能被RNA聚合酶特异的识别、结合并开始转录的一段DNA 序列。

1）、原核生物启动子：起始点、结合部位（Pribnow盒）、识别部位（Sextama盒）2）、真核生物启动子结构：帽子位点：CAT规律

TATA盒： -25～ -30bp,作用：控制转录起始点的选择

上游启动子元件:包括CAAT盒（CCAAT）和GC盒（GGGCGG）等, 作用：控制转录起始频率。

CAAT：-70 ～ -80bp

GGGCGG：-80 ～ -110bp

2、增强子：远上游序列，一般在－100bp以上。核心序列为TGGAAG。作用：增强启动子转录活性的DNA序列。特点：增强效应与位置与取向无关；组织与细胞特异性。

3、终止子：细菌DNA中有两类：1）强终止子－内部终止子；2）弱终止子－需要ρ因子，又称为ρ依赖性终止子。

钛链合成的起始

蛋白质合成的起始产生多肽链的N末端，原核和真核都是甲硫氨酸（Met）作为N末端的氨基酸。它是由mRNA的AUG编码。细胞中可携带Met的tRNA有两类，一种识别起始密码子AUG，另一种识别内部密码子AUG。原核生物分别为tRNAfMet和tRNAMet。

氨基酸的活化：

又称氨基酸负载，其活化形式为氨酰tRNA。氨酰tRNA表示方法Ala-tRNA Ala

、Ser-tRNA

Ser

、

Met-tRNA Met

。由氨基酰-tRNA合成酶催化，氨基酰-tRNA合成酶对底物氨基酸和tRNA都有高

度特异性。

核酸酶

核酸分离与纯化的原则：DNA 保证一级结构完整性，排除其他大分子的污染。RNA 要注意防止RNase （RNA 酶）的降解。

核算纯度的鉴定：紫外分光光度法。通常纯DNA 溶液的1.08.1/280260 值为A A ，若比值高说明RNA 污染，比值低提示蛋白质污染。

沉淀洗涤：DNA 是用70％乙醇。RNA 是用75％乙醇。

核酸分离纯化的技术路线设计

收集细胞→破碎裂解细胞或细胞器→去除蛋白质→沉淀核酸并去除其它蛋白质（纯化）

核酸沉淀的原理（乙醇）

乙醇能够消除核酸的水化层，使带负电荷的磷酸基团暴露出来。Na+之类的平衡离

子能够与这些带电基团结合，在沉淀形成部位降低多核苷酸链之间的排斥作用。因此只有在阳离子的量足以中和暴露的磷酸残基的电荷时才会发生乙醇沉淀。

沉淀洗涤常用的有机溶剂

异丙醇、乙醇

荧光分光光度法的三个公式

1）50×A260样本×稀释倍数／1000＝双链DNAug/ul

2）40×A260样本×稀释倍数／1000＝单链DNA ／RNA ug/ul

3）33×A260样本×稀释倍数／1000＝单链寡聚核苷酸ug/ulDNA

PCR

PCR 的主要步骤及引物设计的基本要求

①PCR 的主要步骤：PCR 又称聚合酶链式反应，是在体外进行的DNA 复制反应过程。其基本过程包括：A 、双链DNA 模板加热变性成单链(变性),温度95度左右。B 、在低温下引物与单链DNA 互补配对(退火),85-90度。C 、延伸：在四种DNTP 底物及Mg 2+

存在条件下，TaqDNA 聚合酶在最适作用温度（70~75℃）下，根据碱基互补配对原则，从特异结合到DNA 模板上的引物3′-OH 端开始掺入单核苷酸，合成新的DNA 分子。②引物设计的基本要求：A 、引物长度一般为15~30个核苷酸。B 、引物中的碱基组成尽可能随机分布，避免出现嘌呤、嘧啶碱基堆积现象，尤其在3′端避免连续3个G 或C 。C 、引物自身不应存在互补序列以避免折叠成发夹结构，引物自身存在的连续互补序列，一般不超过3bp 。D 、两个引物之间不应存在互补序列，尤其应避免3′端的互补重叠。E 、引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%，引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列。F 、引物与模板结合时，引物的5′端可以修饰。

平台效应：与模板的初始量有关，反应模板的初始量越多，平台期出现的越早。

PCR 特点：高度的灵敏性，但假阳性率也较高；引物序列及其与模板结合的特异性是决定PCR 反应结果的关键；引物的设计原则是最大限度的扩增和最小的非特异性

PCR 体系的主要成分：引物、TaqDNA 聚合酶、dNTP 、模板核酸、缓冲液。

PCR 技术：

多重PCR ：在同一反应体系中加入多对引物，同时扩张一份DNA 样品中同一靶DNA 或不同靶DNA 的多个同序列片段。要保持各队引物效率基本一致。临床上常用于分型和鉴定。

逆转录PCR （RT-PCR ）：是以细胞内总RNA 或mRNA 为材料进行的核酸技术，临床上用于RNA 病毒的检测，基因表达分析等。

巢式PCR（嵌套式）：是对靶DNA的二次扩增，可提高反应的灵敏度和特异性，缺点：复杂，容易污染造成假阳性。

实时荧光定量PCR：是指在PCR反应中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR 反应进程，最后通过相关数据分析方法对目的基因进行定量分析的技术。

循环数（Ct值）即PCR扩增过程中扩增产物的荧光信号达到设定的荧光阈值所经过的循环次数（交界点），Ct值与模板的起始拷贝数成反比，通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析。

PCR产物分析：最根本的方法是进行序列测定。如果只是检测是否存在点突变，采用PCR-RFLP、PCR-ASO、PCR-SSCP 、变性梯度凝胶电泳（DGGE）和熔点曲线分析（根据野生序列和突变序列的Tm不同）

参照物：内参基因，在机体的各组织和细胞中，一些基因表达相对恒定，在检测其他基因的表达水平时常用它来作内部参照物，简称内参基因。

实验室：污染来源：主要为扩增产物的污染，应有试剂标本准备区、标本制备区、扩增区和扩增产物分析区四个区。

核酸序列分析

第一代DNA测序技术：双脱氧终止法。

新一代测序技术（第二代测序）应用：①从头测序和重测序。②个体基因组测序和SNP研究。

③转录组及表达谱分析。④小分子RNA研究。⑤无损坏产前诊断。

病毒病的分子生物学检验：

病毒病的一般检出性策略：是针对病毒的特异性核酸序列通过分子生物学技术检测病毒的DNA或RNA，仅提供某种病毒是否存在的证据。

病毒性的完整性检出策略：对病毒的存在与否作出明确判断的基础上，进一步检测病毒载量、进行病毒基因分型、亚型鉴定以及病毒耐药基因分析。

HBV

S基因区：编码病毒颗粒的外模蛋白。C基因区：编码乙型肝炎病毒核心抗原。P基因区：是HBV DNA中最大的一个开放读码框架，编码乙型肝炎病毒DNA聚合酶（HBV DNAP）。X基因区：是HBV DNA中最小的一个开放读码框架，编码乙型肝炎病毒X抗原，与病毒基因的表达调控及HBV DNA整合有关。

HBV DNA定性或定量检测：常用方法有聚合酶链式反应（PCR）法、核酸分子杂交法和实时荧光定量PCR法（重新性好，灵敏度高，判断复制程度、传染性大小），此外还有杂交捕获法（HC-Ⅱ）、基因芯片法、基因序列测定法（SBT）。

HBV DNA分型的方法：基因型特异引物PCR法（PCR-SSP）、PCR-RFLP法、线性探针反向杂交法（LiPA）、SBT法、基因芯片法和PCR微量板核酸杂交酶联免疫反应法。

分子生物学检验的临床意义：HBV早期诊断；病毒载量监测；基因分型；耐药突变检测

HPV

L基因：有L1（疫苗针对位点）和L2主要开放阅读框。

HPV DNA基因分析技术：核酸分子杂交技术、PCR技术、基因芯片技术、飞行时间质谱技术。

细菌感染性疾病的分子生物学检验

细菌性感染的一般检出性策略：通过检验直接判断有无细菌感染和是何细菌感染。目标

分子一般是病原菌的核酸，包括DNA和RNA。

细菌感染的完整性检出策略：不仅要对病原菌的存在是否以及病原菌的种类作出明确判断，而且还要能够诊断出带菌者和潜在性感染，并能对病原菌进行分类分型和耐药性鉴定。

16SrRNA基因序列分析：优点：①多拷贝；②多信息；③长度适中。原核生物rRNA：5S、16S、23S。真核生物rRNA：5S、28S、5.8S、18S。

结核分枝杆菌（TB）：由于细菌mRNA半衰期很短，因此TBmRNA被认为是活菌检测的理想分子标志物。

淋病奈瑟菌（NG）：几乎所有NG都含有一至数个质粒，其中2.6MDa质粒未鉴定出任何功能，属于隐蔽性质粒。96％NG都含有隐蔽性质粒。

单基因遗传病分子生物学检验技术

单基因遗传病：发病主要涉及一对等位基因，其传递呈典型的孟德尔式遗传。分子检验标志物主要为核酸，特别是DNA。

检验常用技术：等位基因特异性PCR（AS--PCR）、限制性酶谱分析、PCR-反向斑点杂交（PCR--RDB）、突变寡核酸延伸扩增（MOEA）、裂口PVR（gap-PCR）

直接诊断策略：静态突变（点突变和片段突变）和动态突变。

间接诊断策略（预判，风险评估）：不确定性影响因素：基因重组、基因新突变、遗传标记的限制性、家系成员资料不够完整以及所带信息量有限等。

血红蛋白病：镰状细胞贫血：第一个被揭示的“分子病”，β珠蛋白基因中第6位密码子存在单个碱基突变（A→T），谷氨酸突变为缬氨酸，改变后的异常蛋白称为镰状血红蛋白（HbS），限制酶谱分析中较正常少了0.2kb。

血友病：血友病A（HA）或称凝血因子Ⅷ（FⅧ）缺乏症（50％是由FⅧ基因倒位导致），血友病B（HB）或称Ⅸ缺乏症（FⅨ）。

脆性X综合征（FraX）是人类最常见的遗传性智力缺陷疾病之一，呈X连锁显性遗传。

CGG三核苷酸重复序列（n FMR-1基因位于Xq27.3其5'非翻译区发现了一段数目可变的()n

正常为6--50，前突变为50--200，全突变为>200），其上游250bp处有一个CpG岛，重复序列的不稳定性扩增及CpG岛的异常甲基化是导致FraX的主要机制。

家族性高胆固醇血症（FH）:又称家族性高β脂蛋白血症。血脂分为胆固醇和甘油三酯（多基因）

线粒体病的分子学生物检验技术

同质性变异：是指细胞内所有的mtDNA（线粒体DNA）发生同样的突变，即野生型mtDNA 均突变成突变型mtDNA。

异质性突变：是指一个细胞内野生型mtDNA与突变型mtDNA同时存在的现象。

药物性耳聋：mtDNA突变是导致耳聋的重要原因之一。线粒体12SrRNA基因的A155G和C1494T突变是导致氨基糖苷类抗生素耳毒性的主要分子致病机制。常用的检测方法：

PCR-RFLP、DHPLC技术、DNA测序技术、基因芯片技术。

肿瘤的分子学检验技术

原癌基因：普遍存在于人类或其他动物细胞基因组中的一类基因，起在生物进化过程中高度稳定，对细胞无害，而且在控制细胞生长和分化中起重要作用。例如：myc、ras、src 等。

原癌基因激活机制：①获得启动子和增强子。②获得基因重排或易位。③原癌基因扩增。

④点突变。

抑癌基因：为一类可编码对肿瘤形成起阻抑作用蛋白质的基因，正常情况下抑制细胞增殖、促进细胞分化。有Rb，p53、WT1等。

肿瘤诊断生物标志物：肿瘤相关的miRNA

基因诊断的基本技术：核酸分子杂交和PCR扩增

基因诊断：利用分子生物学技术，从DNA/RNA水平检测基因的存在，分析基因的结构变异和表达状态，从而对疾病作出诊断。