微生物原生质体融合技术研究进展_王春平

动物医学进展,2008,29(5):64267

Progress in Veterinary Medicine

微生物原生质体融合技术研究进展3

王春平1,2,韦　强1,鲍国连13,刘　燕1,邵泽香1,2,季权安1

(1.浙江省农业科学院畜牧兽医研究所,浙江杭州310021;2.山东农业大学动物科技学院,山东泰安271018)

摘　要:原生质体融合技术在遗传学、动植物远缘杂交育种、生物学、免疫学、兽医学以及医药、食品、农业等方面都有广泛的应用价值,文章就原生质体制备、再生及其融合过程中的影响因素做了综述,另外还对原生质体融合方法和融合子的筛选方法进行了比较,为选择适宜有效的诱导融合方法和筛选方法提供依据。 关键词:原生质体融合;影响因素;融合方法;筛选方法

中图分类号:Q813.2文献标识码:A文章编号:100725038(2008)0520064204

原生质体融合也称细胞杂交、细胞融合或体细胞杂交,是指细胞通过介导和培养,在离体条件下用人工方法将不同种的细胞通过无性方式融合成一个核或多核的杂合细胞的过程[1]。原生质体融合技术起源于20世纪60年代。1960年法国的Karski研究小组在两种不同类型的动物细胞混合培养中发现了自发融合现象。1974年匈牙利的Ferenczy L 等[2]采用离心力诱导的方法,报道了白地霉营养缺陷型突变株的原生质体融合,从而使原生质体融合技术成为微生物育种的一项新技术,并从微生物种内融合扩展到界间的融合。路玲玲等[3]采用融合技术成功构建耐高温高产酒精酵母,至此,原生质体融合技术成为工业菌株改良的重要手段之一。原生质体融合技术已在农业、医药、环保等领域取得了开创性的研究成果,而且应用领域不断扩大[4]。

1　原生质体融合技术

微生物原生质体融合技术的整个过程包括:原生质体的制备,原生质体融合,原生质体再生[5]。1.1　原生质体制备与再生过程中的影响因素

制备原生质体的最大障碍就是细胞壁,现在去除细胞壁的主要方法是使用酶法,使用的酶主要为蜗牛酶或溶菌酶,具体根据所用微生物的种类而定。影响原生质体制备的因素很多,不同的微生物有其较为适当的形成条件。在菌龄选择上,多采用对数生长中后期的细菌,这主要是由于对数生长期细菌的细胞壁中肽聚糖含量最低,细胞壁对酶的作用最敏感。王燕[6]对双亲灭活米曲霉进行原生质体制备的过程中,用纤维素酶、溶壁酶、蜗牛酶混合浓度比为5∶3∶1的酶液混合使用能提高去壁效果。使用微生物产生的酶复合物或商品酶的混合液比单独使用一种酶的效果好,在一定范围内,酶作用的时间和酶作用的浓度都与原生质体的形成率成正相关,而与再生率成反相关。另外,ED TA作为螯合剂,可以避免金属离子对酶的抑制作用而提高酶脱壁效果,从而提高原生质体的形成率。据报道,对大肠埃希菌来说,用ED TA洗涤后,可以除去对酶解不利的金属离子[7]。另一方面,在原生质体制备前,用适量的青霉素对菌体进行预处理,可以抑制肽聚糖合成过程中的转肽作用,有利于原生质体的形成。根据酶反应动力学原理,酶解温度直接影响酶促反应的速度,如放线菌的最适酶解温度为28℃～37℃,真菌的最适酶解温度为30℃～35℃[8]。在高渗Tris 溶液中添加15mL/L聚乙烯吡咯烷酮(PV P)等原生质体扩张剂,有利于溶液中细菌的分散,有助于制备原生质体,添加0.02mol/L镁离子,有利于原生质体的稳定。关于原生质体的再生,吴孔兴等[9]报道在原生质体高渗再生培养基中加入0.3mol/L的蔗糖和0.2mol/L的丁二酸钠是合适的,王玉华等[10]报道在高渗再生培养基中加入0.5mol/L的蔗糖是适宜的,这可能要根据不同的微生物种类而定。

1.2　原生质体融合过程中的影响因素

1974年,匈牙利的Ferenczy报道了离心力诱导法对白地霉营养缺陷型突变株的原生质体融合。随后人们相继用NaCl、KCl和Ca(NO3)2等作为诱变剂进行融合,但融合频率都很低。聚乙二醇在适量

3收稿日期:2008202203

基金项目:浙江省重点科技攻关项目(2005C12021,2005E60014)

作者简介:王春平(1982-),男,山东淄博人,硕士研究生,主要从事动物传染病研究。3通讯作者

Ca2+存在下能有效地诱导植物原生质体融合,Ca2+主要是通过维持膜结构的完整性来实现原生质体的稳定性与活性。原生质体膜外在蛋白上二价阳离子的存在使膜脂流动性减慢、稳定性增强,这种维持稳定性的效果大小与膜表面分子数量的多少呈正比例关系,PEG种类对原生质体融合的影响不大。此外,其融合率还受其他诸因素的影响。影响原生质体融合的因素很多,特别是环境中的阳离子存在,融合时的p H也对原生质体融合有较明显的影响。一般来讲Ca2+、Mg2+有助于融合。如有0.01mol/L Ca2+存在时,可得到较高的融合率,但在缺乏钙离子时,若p H较低,融合频率也较高。这是因为钙离子和带负电荷的PEG与细胞膜表面分子相互作用,使原生质体带电,彼此易于附着发生凝集所致[11]。

2　原生质体融合的方法

2.1　PEG结合高Ca2+诱导法

聚乙二醇(PEG)是一种多聚化合物,不同种类微生物对PEG分子质量的要求不尽相同。放线菌适用分子质量常为1ku～1.5ku,也有使用

0.4ku～6ku,真菌一般采用4ku～6ku,细菌用

1.5ku～6ku。亲本原生质体制备好后,即可进行融合。关于促融机制,一般认为PEG本身是一种特殊的脱水剂,它以分子桥形式在相邻原生质体膜间起中介作用,进而改变质膜的流动性能,降低原生质膜表面势能,使膜中的相嵌蛋白质颗粒凝聚,形成一层易于融合的无蛋白质颗粒的磷脂双分子层区。在Ca2+存在下,引起细胞膜表面的电子分布的改变,从而使接触处的质膜形成局部融合,出现凹陷,构成原生质桥,成为细胞间通道并逐渐扩大,直到两个原生质体全部融合。

2.2　电融合

原生质体电融合起始于20世纪80年代的细胞改良新技术。陈合等[12]报道了电融合的方法,将白芝和赤芝两种大型真菌原生质体成功进行了融合,这一技术将电学与生物化学恰当结合,产生了缓和而高频率的原生质体融合效果。其原理是在短时间强电场的作用下,细胞膜发生可逆性电击穿,瞬时失去其高电阻和低通透性,然后在数分钟内恢复原状,当可逆电击穿发生在两个相邻细胞的接触区时,即可诱导它们的膜相互融合,从而导致细胞融合。近年来,该技术在微生物中的应用日渐增多。

2.3　激光诱导融合

1987年始,激光诱导融合技术迅速发展起来,并很快被应用在动物细胞及植物原生质体的融合中。激光融合是让细胞或原生质体先紧密贴在一起,再用高峰值功率密度激光对接触处进行照射,使质膜被击穿或产生微米级的微孔。由于质膜上产生微孔是可逆过程,质膜在恢复过程中细胞连接小孔的表面曲率很高,处于高张力状态,细胞逐渐由哑铃形变为圆球状时,说明细胞已融合了。该技术最突出的优点在于它的高度选择性,利用激光微束技术可诱导许多细胞中所需的两个相邻细胞融合。但由于其所需设备昂贵复杂,操作技术难度大,很难推广应用。此后,虽有研究者试图以类似原理及较简便的步骤,在微生物原生质体融合中应用激光微束技术[13],但融合效率较低,且丧失了高度选择性的优点。激光诱导融合技术仍处在发展初期,还有待进一步完善。

2.4　基于微流控芯片的细胞融合技术

随着微机电系统(M EMS)技术和微加工技术的发展,微电极阵列的设计加工制作也日趋成熟,加之微通道网络可以整合到生物芯片之上,这将使得微流控系统成为细胞融合的理想平台,利用微流控系统可以按照预定的要求大量融合异种细胞。Strum2 berg A等[14]已经在微流控系统中实现了单个成对细胞的融合。证明了利用微流控技术使细胞之间可以实现可控融合,利用基于芯片技术的微流控系统不仅可以实现对细胞甚至单个细胞的操控,也可以同时输送、合并、分离和分选大量细胞,细胞融合在芯片上可以通过并行或快速排队的方式实现。此外,由于在微通道内的腔体容积很小,所以会大幅减少细胞融合中所需的细胞数量,同时细胞融合率和杂合细胞的成活率会大大提高。

2.5　高通量细胞融合芯片

高通量细胞融合芯片利用微电极阵列在细胞融合芯片的微米范围内(10μm～40μm)产生的高强度高梯度辐射电场,使得细胞融合芯片中的细胞在此特殊辐射电场的作用下产生介电质电泳力,精确处理和刺激预定的细胞目标,从而使目标细胞按照预先设计的方向以预定的速度移动,从而可以按照设计要求准确地大批量地得到目标细胞配型,集成微电极阵列的微流控系统,可以方便灵活地实现对细胞的操作、隔离和转移。该方法的优点是可以与化学诱导融合、电诱导融合等方法相互结合,比如在细胞融合缓冲液中加入少量的PEG可大大提高细胞的融合率[15]。此外,二价阳离子(如Ca2+)以及蛋白酶对细胞的预处理,融合率也可大幅提高。然而,截至目前各国与此相关的细胞融合实验工作只有几篇论文报道。

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王春平等:微生物原生质体融合技术研究进展

3　原生质体融合所得融合子的筛选方法

3.1　利用营养缺陷型标记筛选融合子

这种方法的原则是将亲本菌株诱变处理后,产生对某些营养物质合成途径受阻的突变株,在分离培养基上只有融合子生长而不能让突变的双亲本原生质体形成菌落。融合的双亲带有不同营养缺陷型标记,原生质体融合处理后的混合物直接分离到基本培养基上就可检出融合子。其原理是因为缺陷型的双亲由于丧失了合成某种营养物质的能力,它们在基本培养基上不能生长、繁殖,同一亲本原生质体融合也不能在基本培养基上形成菌落,只有不同亲本原生质体融合后,缺陷的营养物质得到互补才能恢复为野生型在基本培养基上萌发生长形成菌落。高玉荣等[16]报道,通过发酵性能好的长城葡萄酒酵母单倍体L13(L ys-,赖氨酸缺陷型)的原生质体与灭活的降酸能力强的粟酒裂殖酵母1685(Ino-,肌醇缺陷型)的原生质体进行融合,其试验方法就是依据这种原理来进行筛选的。

3.2　利用抗药性标记筛选融合子

Bradshaw等1984年首先用这种方法检出了融合子。微生物的抗药性是菌种的重要特性,是由遗传物质决定的,不同种的微生物对某一种药物的抗性存在差异,利用这种差异即可对融合子进行选择。分别选择耐药菌株各1株,其应符合1株对A药敏感、B药抗性;另1株对B药敏感、A药抗性的条件。试验菌株选择好后进一步强化诱导,稳定其抗药性。在含有A、B两种药物的高渗再生平板上就可以把所需要的融合子检出。李晓霞等[17]利用两种兔源肠致病性菌原生质体融合的耐药性遗传标记选择,刘玲等[18]对康宁木霉和白腐真菌原生质体融合都是利用抗药性来筛选融合子的。

3.3　利用荧光染色法筛选融合子

荧光染色法是在酶解制备原生质体时事先向酶解液中加入荧光色素(如DA PI,F T TC)标记,使双亲原生质体分别带上不同的荧光色素。带上荧光色素的原生质体仍能发生融合并具有再生能力,然后在显微操作器和荧光显微镜下,挑取同时带有双亲原生质体荧光标记的融合子,直接分离到高渗再生培养基上再生,最后得到融合子。原生质体融合处理后,在荧光显微镜下观察并通过显微操作,直接挑选出带有两种荧光的原生质体。成亚利等[19]以金针菇为材料,经异硫氰酸荧光素标记的金针菇单核W19菌株的原生质体与未经标记的单核Y7菌株的原生质体在聚乙二醇的诱导下进行融合,得到融合菌株。3.4　利用灭活原生质体标记筛选融合子

这项技术的原理是在原生质体融合之前,对单亲或双亲原生质体进行灭活,使其丧失再生的能力,当与另一亲株融合后,代谢上得到互补,能够存活。在这个系统中,被灭活的原生质体实际上起了遗传物质的载体作用。由于灭活原生质体融合减少了寻找稳定遗传标记的繁琐工作及由此可能带来的亲株优良性状的丢失,因此是获得遗传重组的一条有利途径,而且在不利用选择培养基的情况下即可减少亲株的生长,从而提高了筛选效率。周东坡等[20]通过紫外线照射灭活原生质体融合选育了啤酒酵母新菌株。用1g/L碘乙酸,30℃处理产朊假丝酵母原生质体40min后,与啤酒酵母的原生质体融合,利用形态差异选择融合子。

3.5　利用双亲对碳源利用不同而检出融合子

利用亲株对各种碳源利用差异,结合其他特性分离筛选融合子。如酿酒酵母8921为呼吸完整,不能利用木糖,对放线菌酮敏感。另一亲株能利用木糖,经诱变剂处理,挑选失去线粒体的呼吸缺陷型菌株,抗20μg/mL放线菌酮。双亲的原生质体融合后,在含有木糖和20μg/mL放线菌酮的选择培养基上生长。因为双亲原生质体都不能生长,只有双亲遗传物质重组后才能在选择培养基上萌发生长,从而被选择出来。此法适应的种类范围相对较小。

3.6　利用某些特殊生理特征作为标记选择融合子

如圆褐固氮菌可以在无氮培养基上生长,可以与另外一种菌的抗药性标记联合使用在无氮培养基上来筛选他们的融合子。光合细菌可以在无碳源的培养基上生长,可以与另外的标记联合使用在无碳培养基上来筛选其融合子。

3.7　利用生化测定指标选择融合子

通常测定的生化项目有DNA含量、氨基酸含量、酸性磷酸酶、同工酶和电泳等。DNA含量的测定有两种方法:一是提取DNA后,以紫外分光光度计测定其含量;二是直接以显微分光光度计测定孢子或菌丝的DNA含量,一般来说,融合子的DNA 含量高于任何一个亲本的博莱霉素(I J K)含量,但却少于双亲DNA含量之和。一般情况下,比较融合子与双亲氨基酸含量百分比,电泳测定亲本和融合子酸性磷酸酶同工酶和酯酶同工酶酶谱,两者的酶谱存在着一定的差异。常被用作非人工标记鉴别融合子的辅助性方法。

4　前景及展望

原生质体融合技术在生产实践中的应用产生的效益,已是举世瞩目,它已成为高新技术开发的重要

66动物医学进展　2008年　第29卷　第5期(总第177期)

领域。该技术不仅为核质相互关系、基因调控、遗传互补、肿瘤发生、基因定位、衰老控制理念等领域的研究提供了有力的手段,而且在遗传学、动植物远缘杂交育种、发生生物学、免疫医学以及医药、食品、农业等方面都有广泛的应用价值。通过原生质体融合进行细胞杂交已成为细胞工程研究的重要内容之一。在兽医预防科学领域也已有原生质体融合的研究,主要目的是为了把不同免疫原性的菌株集中于同一菌株上,对血清型多而又无交叉免疫保护的病原菌研制多价疫苗时,有利于提高疫苗中单因子的单位抗原含量,达到提高免疫效果的目的。如于凤刚等研究禽巴氏杆菌双型融合株、禽巴氏杆菌与大肠埃希菌的双型融合株、禽大肠埃希菌双型融合株等。目前所进行的关于原生质体融合的研究仅局限于两个菌株之间的融合,没有扩展到3个以上菌株之间的融合,如果我们能够开展多个菌株之间的融合,则有可能获得同时具有多个优良性状的菌株,进一步拓宽这一技术的应用领域。参考文献:

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Progress on Microbial Protoplast Fusion T echnology

WAN G Chun 2ping 1,2,WEI Qiang 1,BAO Guo 2lian 1,L IU Yan 1,SHAO Ze 2xiang 1,2,J I Quan 2an 1

(1.A ni mal H usband ry and V eterinary I nstit ute ,Zhej iang A cadem y of A gricult ural Sciences ,Hangz hou ,Zhej i ang ,310021,Chi na;

2.College of A ni mal S cience and V eterinary Medicine ,S handong A gricult ural Universit y ,T ai ’an ,S handong ,271018,China )

Abstract :Protoplast f usion technology was applied widely in genetics ,animal breeding and plant s distant hybridizatio n ,biology ,immunology and medicine ,foodst uff ,agricult ure ,and ot her aspect s.This artical summarized t he impact factors on process of p rotoplast p reparation ,regeneration and f usion ,compared t he p rotoplast f usion met hods ,t he f usion of screening met hods for t he selection of approp riate and effective met hods and induced f usion screening met hods.

K ey w ords :p rotoplast f usion ;impacting factors ;f usion met hods ;screening met hods

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6王春平等:微生物原生质体融合技术研究进展