毛霉的产蛋白酶发酵条件优化

实验十一产蛋白酶菌株的筛选-2013

实验十一产蛋白酶菌株的筛选-2013 实验十一产蛋白酶菌株的筛选碱性蛋白酶是一类最适宜作用pH为碱性的蛋白酶，在轻工、食品、医药工业中用途非常广泛。微生物来源的碱性蛋白酶都是胞外酶，具有产酶量高，适合大规模工业生产等优点，被认为是最重要的一类营业性酶类。从自然界筛选获取有用的微生物资源一直是微生物学的一项重要工作，也是学习微生物学的学生应该掌握的基本技能。一、基本原理 , 自能够产生胞外蛋白酶的菌株在牛奶平板上生长后，其菌落周围可形成明显的蛋白水解圈。 , 水解圈与菌落直径的比值常被作为判断该菌株蛋白酶产生能力的初筛依据。不同类型的蛋白酶都能在牛奶平板上形成蛋白水解圈，细菌在平板上的生长条件和液体环境中生长的情况相差很大，因此在平板上产圈能力强的菌株不一定就是碱性蛋白酶的高产菌株。 , 碱性蛋白酶活力测定按中华人民共和国颁布标准QB747-80进行。 , 原理:Folin试剂与酚类化合物(Tyr,Trp,Phe)在碱性条件下发生反应形成蓝色化合物，用蛋白酶分解酪蛋白生成含酚基的氨基酸与Folin试剂呈蓝色反应，通过分光光度计测定可知酶活大小。二、实验目的 , 学习用选择平板从自然界中分离胞外蛋白酶产生菌的方法 , 学习并掌握细菌菌株的摇瓶液体发酵技术

, 掌握蛋白酶活力测定的原理与基本方法三、实验器材 1(菌株从自然界筛选获得的蛋白酶产生菌株 2(溶液和试剂蛋白胨，酵母粉，脱脂奶粉，琼脂，干酪素，三氯醋酸，NaOH，NaCO，Folin 试剂，硼砂，23 酪氨酸，水等 3(仪器和用品三角烧瓶，培养皿，吸管，试管，涂布棒，玻璃搅拌棒，水浴锅，分光光度计，培养摇床，高压灭菌锅，尺，玻璃小漏斗和滤纸四、操作步骤 1. 培养基和试剂的配制 (1)牛奶平板:在普通肉汤蛋白胨固体培养基中添加终质量浓度为1.5%的牛奶 (2)发酵培养基:玉米粉4%，黄豆饼粉3%，NaHPO 0.4%，KHPO 0.03%，3 mol/l NaOH 调节2424 pH到9.0，0.1MPa 灭菌20min，250ml三角烧瓶的装瓶量为50ml。 (3)pH11硼砂- NaOH缓冲液:硼砂19.08克溶于1000ml水中;NaOH 4g，溶于1000 ml水中，二液等量混合。 (4)2%酪蛋白:称取2g干酪素，用少量0.5mol/l NaOH润湿后适量加入pH11的硼砂- NaOH缓冲液，加热溶解，定容至100ml，4?冰箱中保存，使用期不超过一周。 2. 酶活标准曲线的制作

酶的特性综述

酶的特性综述酶通常是指由活细胞产生的、具有催化活性的生物大分子，大多数酶是蛋白质，少数是RNA，另有一些需要辅助因子的辅助。酶的特性主要体现在这几个方面：一、高效性 1、酶的高效性是和非酶的催化剂比较而言。主要是指催化能力，蛋白质（环境适宜）的催化能力是普通化学催化物质的10^5—10^8倍。生物分子之间的反应首先要进行分子碰撞接触，如果在没有酶作用的情况下，分子主要靠自然的热运动来随机进行接触，这样的几率比较小，而在酶的作用下，由于酶和作用底物有特异性结合位点，相当于把反应需要的分子给拉到一起去了，所以这样的效率要高很多。 2、酶的高效性实验探究材料：新鲜猪肝研磨液（含有H2O2酶)、3%的FeCl3溶液（催化过氧化氢分解的化学催化剂）、清水、试管5支、试管架、酒精炉、线香、打火机、量筒步骤： 1、在5支试管中分别加入5mLH2O2溶液，依次编号置于试管架上。 2、在1号试管中加入一定量的清水；2号试管中加入与清水等量的新鲜猪肝研磨液；3号试管中加入等量的3%的FeCl3溶液；4号试管中加入经过高温煮过的等量的新鲜猪肝研磨液；5号试管中加入高温煮过的FeCl3溶液。 3、用点燃但无火焰的线香插入试管检验。现象：氧气量效果 1号：—无催化作用 2号：﹢﹢高效催化 3号：﹢低效催化 4号：—无催化作用 5号：﹢低效催化结论：过氧化氢酶比FeCl3催化剂高效。酶具有高效性。

二、专一性酶对所作用的底物有严格的选择性。一种酶仅能作用于一种物质，或一类分子结构相似的物质，促其进行一定的化学反应，产生一定的反应产物，这种选择性作用称为酶的专一性。酶的专一性是指酶对底物及其催化反应的严格选择性。通常酶只能催化一种化学反应或一类相似的反应，不同的酶具有不同程度的专一性，酶的专一性可分为三种类型：绝对专一性、相对专一性、立体专一性；也可分为：结构专一性和立体异构专一性。如过氧化碳氢酶只能催化过氧化氢分解，不能催化其他化学反应。细胞代谢能够有条不乱的进行，与酶的专一性是分不开的。探究酶的专一性的实验序号项目试管 1 2 1 注入可溶性淀粉2mL / 2 注入蔗糖溶液/ 2mL 3 注入新鲜淀粉酶溶液2mL 振荡 4 60℃温水保温 5 min 5 加斐林试剂1mL 振荡 6 将试管下部放入60℃热水中 2 min 7 观察实验结果有砖红色沉淀无砖红色沉淀结论淀粉酶只能催化淀粉水解，不能催化蔗糖水解三、多样性酶的种类很多，大约有5000多种，其中可以通过食用补充的酵素达2000多种；形态上主要有三种：专业级酵素为酵素胶囊，其次为酵素粉，而液体酵素含量低、效价低、易腐败而安全性较差一些，食用风险较高。四、温和性

微生物发酵培养基的优化方法

工业发酵进展

微生物发酵培养基的优化方法对于微生物的生长及发酵，其培养基成份非常复杂，特别是有关微生物发酵的培养基，各营养物质和生长因子之间的配比，以及它们之间的相互作用是非常微妙的。面对特定的微生物，人们希望找到一种最适合其生长及发酵的培养基，在原来的基础上提高发酵产物的产量，以期达到生产最大发酵产物的目的。发酵培养基的优化在微生物产业化生产中举足轻重，是从实验室到工业生产的必要环节。能否设计出一个好的发酵培养基，是一个发酵产品工业化成功中非常重要的一步。以工业微生物为例，选育或构建一株优良菌株仅仅是一个开始，要使优良菌株的潜力充分发挥出来，还必须优化其发酵过程，以获得较高的产物浓度（便于下游处理），较高的底物转化率（降低原料成本）和较高的生产强度（缩短发酵周期）。设计发酵培养基时还应时刻把工实验室最常用的优化方法是单次单因子法，这种方法是在假设因素间不存在交互作用的前提下，通过一次改变一个因素的水平而其他因素保持恒定水平，然后逐个因素进行考察的优化方法。但是由于考察的因素间经常存在交互作用，使得该方法并非总能获得最佳的优化条件。另外，当考察的因素较多时，需要太多的实验次数和较长的实验周期[3]。所以现在的培养基优化实验中一般不采用或不单独采用这种方法，而采用多因子试验。 2.多因子试验多因子试验需要解决的两个问题: (1)哪些因子对响应具有最大(或最小)的效应，哪些因子间具有交互作用。 (2)感兴趣区域的因子组合情况，并对独立变量进行优化。

3.正交实验设计正交实验设计是安排多因子的一种常用方法，通过合理的实验设计，可用少量的具有代表性的试验来代替全面试验，较快地取得实验结果。正交实验的实质就是选择适当的正交表，合理安排实验的分析实验结果的一种实验方法。具体可以分为下面四步：（1）根据问题的要求和客观的条件确定因子和水平，列出因子水平表；（2）根据因子和水平数选用合适的正交表，设计正交表头，并安排实验；（3）根据正交表给出的实验方案，进行实验；（4）对实验结果进行分析，选出较优的“试验”条件以及对结果有显著影响的因子。正交试验设计注重如何科学合理地安排试验，可同时考虑几种因素，寻找最佳因次报道。CastroPML报道用此法设计20种培养基，做24次试验，把gamma干扰素的产量提高了45%。 6.部分因子设计法部分因子设计法与P1ackett-Burman设计法一样是一种两水平的实验优化方法，能够用比全因子实验次数少得多的实验，从大量影响因子中筛选出重要的因子。根据实验数据拟合出一次多项式，并以此利用最陡爬坡法确定最大响应区域，以便利用响应面法进一步优化。部分因子设计法与Plaekett-Burman设计法相比实验次数稍多，如6因子的26-2部分因子设法需要进行20次实验，而Plackett-Burman设计法只需要7次实验。 7.响应面分析法

脂肪酶产生菌发酵条件的优化

绵阳师范学院本科生毕业论文（设计）题目脂肪酶产生菌M-6-2发酵条件的优化专业生物技术院部生命科学与技术学院学号0811420218 姓名杜长蔓指导教师李俊刚答辩时间2012年5月论文工作时间：2011 年7 月至2012 年5 月

脂肪酶产生菌M-6-2发酵条件的优化学生：杜长蔓指导老师：李俊刚摘要：本文对绵阳师范学院微生物实验室筛选和鉴定的产脂肪酶细菌 M-6-2的生长动力学和产酶动力学进行了研究；通过单因素实验和正交试验，对脂肪酶产生菌M-6-2 摇床发酵产脂肪酶的培养基组成和培养条件进行优化，得出较佳的产酶培养基组成配方为：1.5%淀粉+0.5%酵母膏为碳源、4.5%豆饼粉 +1.5%硝酸铵为最佳的氮源、0.05%磷酸氢二钠和0.15%硫酸镁；最优的发酵条件为：初始pH7.5，接种量1.5 %，装液量20ml/250ml，发酵温度35℃，在转速180r/min 下，培养16h，经过优化后发酵液脂肪酶酶活力最高可达到15.60 U/ml,较优化前提高了49.57%。脂肪酶产生菌M-6-2与国内文献报道的产脂肪酶细菌相比产酶活力高。对该菌株发酵条件进行优化后，为生产性试验打下了基础。关键词：脂肪酶产生菌M-6-2；脂肪酶；发酵条件；优化；正交试验；

Lipase to produce bacteria M-6-2 Optimization of fermentation conditions Undergraduate: Du Changman Supervisor: Li Jun Gang Abstract: In this paper, Laboratory screening and identification of lipase production by bacteria in the M-6-2 growth kinetics and enzyme production kinetics were studied; through single factor experiments and orthogonal test, the lipase to produce bacteria M-6-2 shaker fermentation lipase medium composition and culture conditions were optimized to come to a better enzyme production medium composition formula: 1.5% starch and 0.5% yeast extract as carbon source, 4.5% of the soybean powder and 1.5% ammonium nitrate for the best source of nitrogen, 0.05% disodium hydrogen phosphate and 0.15% magnesium sulfate. Optimal fermentation conditions were: initial pH 7.5, 1.5% of the inoculum size, liquid volume 20ml/250ml, fermentation temperature 35 ° C, in the speed 180r/min next, cultured 16h After optimization of the fermentation broth lipase activity can reach 49.57% to 15.60 U / ml, compared to before optimization. Lipase to produce bacteria M-6-2 and reported in China in the production of lipase bacteria compared to the high activity of enzyme production. Of the strain fermentation conditions optimized, laid the foundation for the production of test. Key words: Lipase producing strain M-6-2；lipase ；fermentation conditions； optimization ；orthogonal test

蛋白酶

8.蛋白酶（酸性、中性、碱性）的特征与相应的发酵微生物菌。答：中性蛋白酶生产菌枯草杆菌1.398,S114,172,放线菌166，栖土曲霉3.942；碱性蛋白酶生产菌地衣芽孢杆菌2709，短小芽孢杆菌289，209；酸性蛋白酶生产菌黑曲霉3.350，宇佐美曲霉537，肉桂色曲霉No.81，浆油工业用的米曲霉3042。按酶的最适pH分类： ①酸性蛋白酶，最适pH2.0-5.0。 ②中性蛋白酶，pH7-8。 ③碱性蛋白酶，pH9.5-10.5。为方便起见，微生物蛋白酶常用此分类法。酸性蛋白酶主要来源于哺乳动物的消化道, 如胃蛋白酶; 部分微生物是酸性蛋白酶的主要来源, 如:目前的商品酸性蛋白酶制剂主要是由黑曲霉发酵生产分子特性: 酸性蛋白酶的最适pH在2-5范围, 酶蛋白的等电点在pI3-5, 分子量MW30,000-35,000。 ②催化特性: 酸性蛋白酶的最适温度因来源不同而有差异, 一般霉菌的蛋白酶的最适温度较高, 大部分在50-60℃范围, 而来源于动物胃粘膜的蛋白酶的最适温度较低, 一般在40℃左右, 但酸性蛋白酶的热稳定性都较差, 一般在50℃都很快失活, 此外, 酶的热稳定性还受到基质的pH的影响; 有些酸性蛋白酶不耐低温, 在低温条件下,很快失活。许多酸性蛋白酶分子中含5-10%多糖，对酶的稳定有益。中性蛋白酶是最早用于酶制剂工业化生产的蛋白酶, 目前的微生物生产的商品酶制剂的菌种主要有: 枯草杆菌、耐热解蛋白芽孢杆菌、灰色链霉菌、寄生曲霉、米曲霉、栖土曲霉。除上述微生物生产中性蛋白酶外, 来源于植物的木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶、菠萝蛋白酶等都属于中性蛋白酶。 ①分子特性: 大部分微生物产生的中性蛋白酶属于金属蛋白酶, 一分子酶蛋白含有一个锌原子, 酶蛋白的分子量在35,000-40,000范围, 等电点pI 8-9, 微生物蛋白酶中, 中性蛋白酶的稳定性最差, 分子之间最容易发生自溶, 即使在低温条件下, 也会发生明显的自溶, 造成分子量明显降低。 ②催化特性: 中性蛋白酶的热稳定性较差, 如枯草杆菌的中性蛋白酶在pH7, 60℃处理15min, 失活90%; 栖土曲霉的中性蛋白酶在pH7, 55℃处理10min, 失活80%以上; 以酪蛋白为底物时, 枯草杆菌蛋白酶的最适pH7-8、热解蛋白芽孢杆菌的中性蛋白酶的最适pH7-9、栖土曲霉的中性蛋白酶pH6.5-7.5; 最适温度受测定时的反应时间有直接关系, 因为酶蛋白的稳定性较差, 所以反应时间的长短影响着反应结果, 一般在10-30min 最适温度为45-50℃。钙离子可以增加酶蛋白的稳定性,并减少自溶。碱性蛋白酶主要是由微生物产生, 微生物中主要是细菌的部分菌种产生碱性蛋白酶, 目前碱性蛋白酶主要是用于洗涤剂、皮革工业、丝绸脱胶。几乎所有的细菌碱性蛋白酶都是胞外蛋白酶, 主要包括两类: 其一是在中性条件下生产的碱性蛋白酶, 如枯草杆菌、地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌等; 其二是嗜碱微生物, 其必须在碱性条件下[pH8-10]才能生产的碱性蛋白酶。 ①酶蛋白特性: 碱性蛋白酶的分子量比中性蛋白酶的分子量小, 一般在20,000-34,000Da, 而且等电点较高, 一般在pH8-9。 ②催化特性: 大部分碱性蛋白酶的最适pH在7-11范围, 当以酪蛋白为底物时, 最适pH为9.5-10.5, 碱性蛋白酶除能够水解肽键外, 还具有水解酯键的能力和转肽能力, 最适温度因菌种不同而有差异, 一般在50 ℃左右, 酶蛋白的热稳定性不高, 50-60℃处理15分钟, 几乎有50%的酶活力丧失, 我国目前生产的几种碱性蛋白酶的热稳定性一般都在60℃以下。中性蛋白酶——枯草芽胞杆菌、栖土曲霉、灰色链霉菌、放线菌等碱性蛋白酶——地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌等酸性蛋白酶——大都采用曲霉中性蛋白酶作为一种内切蛋白酶，具有纯天然、安全无毒、水解能力强、作用范围广等。2、中性蛋白酶应用于焙烤，可降低面团湿筋度、改良面团可塑性及理化性质，同时使蛋白质大分子水解成短肽和氨基酸，从而有利于糖类和氨基

实验二霉菌产蛋白酶发酵培养基条件的确定

实验二雅致放射毛霉产蛋白酶培养基本的确定 1、种子培养基（实验老师准备4个100ml种子）培养基组成： 100ml：豆粕粉3g，饴糖0.5g，酵母膏0.1g，MgSO40.2g，KH2PO40.2g。高压灭菌锅，121℃，20min灭菌。灭菌操作完毕，将上述物品并洗耳球转入超净台，接种前20min进行紫外空气灭菌。接种前4小时从冰箱取出1支菌种，在25℃条件下活化。在超净台内，以无菌生理盐水洗涤菌种斜面。孢子悬浮液以每瓶10ml的接种量，接入种子培养基。从超净台取出接好的种子三角瓶，转入摇床，在28℃、250rpm的条件下培养14～16小时，至种子瓶内呈粘稠浆糊状为止。 2、产酶培养基确定（学生确定，每组做三瓶，250ml三角瓶中装100ml培养基） 2.1培养基的配制，每班分六组，各组分别选择以下六种培养基配方：（1）基础培养基：（100ml）豆粕粉3g，蔗糖0.8g，酵母膏0.1g，MgSO4 0.36g，KH2PO4 0.12g，CaCl2 0.1g。（第一组）（2）第二组，将基础培养基中蔗糖按成等例葡萄糖；（3）第三组，将基础培养基中蔗糖按成等例马铃薯淀粉；（4）第四组，将基础培养基中去掉酵母膏；（5）第五组，将基础培养基中去掉豆粕粉，并将酵母膏添加量增至0.5％。（6）第六组，将基础培养基中去掉MgSO4和CaCl2。 2.2培养基灭菌高压灭菌锅，121℃，20min灭菌。冷却至室温，将上述物品并洗耳球转入超净台，接种前20min进行紫外空气灭菌。 2.3接种冷却到室温开始接种，接种量10％，然后在在28℃、250rpm的条件下培养18小时，至发酵液颜色变深、澄清为止。 2.4蛋白酶活力测定根据各组测定酶活结果，比较确定最适培养基组成。（1）定义：1 g固体酶粉，在一定温度和pH值条件下，1 min水解酪素产生1 ug酪氨酸为一个酶活单位，以u/g表示。（2）原理：蛋白酶在一定温度与pH条件下，水解酪素底物，然后加入三氯乙酸终止酶反应，并使未水解的酪素沉淀除去，滤液对紫外光有吸收，可用紫外分光光度法测定。根据吸光度计算其酶活力。（3）试剂和溶液 ①三氯乙酸c（CCl3.COOH）=0.4 mol/L：称取三氯乙酸32.7 g，用水溶解并定容至500 mL ②磷酸缓冲溶液（pH=7.5）适用于中性蛋白酶：称取磷酸氢二纳（Na2HPO4·12H2O）3.01 g 和磷酸二氢纳（NaH2PO4·2H2O）0.25 g，加水溶解并定容至500 mL。 ③ 100 ug/mL L—酪氨酸标准溶液：

年产1000吨酸性蛋白酶的生产工艺设计

1. 前言酸性蛋白酶是一类最适pH值为的天冬氨酸蛋白酶，相对分子质量为30000 40000。酸性蛋白酶主要来源于动物的脏器和微生物分泌物,包括胃蛋白酶、凝乳酶和一些微生物蛋白酶。根据其产生菌的不同，微生物酸性蛋白酶可分为霉菌酸性蛋白酶、酵母菌酸性蛋白酶和担子菌酸性蛋白酶.根据作用方式可分为两类：一类是与胃蛋白酶相似，主要产酶微生物是曲霉、青霉和根霉等；另一类是与凝乳酶相似，主要产酶微生物是毛霉和栗疫霉等。细菌中尚未发现产酸性蛋白酶的菌株.由于酸性蛋白酶具有较好的耐酸性，因此被广泛地应用于食品、医药、轻工、皮革工艺以及饲料加工工业中。国外关于酸性蛋白酶的生产研究从20世纪初就开始了。1908年，德国科学家从动物的胰脏中提取出胰蛋白酶，并将其用于皮革的鞣质。1911年美国科学家从木瓜中提取木瓜蛋白酶（在酸性，碱性和中性的条件下都能分解蛋白质的酶）并将木瓜蛋白酶用于除去啤酒中的蛋白质浑浊物。自1954年吉田首次发现黑曲霉可产生酸性蛋白酶以来，国内外对微生物发酵生产酸性蛋白酶进行了广泛的研究。1964年外国科学家首次发现大孢子黑曲霉突变体能产生两种不同的酸性蛋白酶，即酸性蛋白酶和酸性蛋白酶。1965年又从血红色陀螺孔菌，中分离出了一种酸性蛋白酶，并对该酶进行了纯化和结晶。1968年从微小毛霉中筛选出了一种酸性蛋白酶，并对其进行了纯化和酶学性质分析。1995年外国科学家对烟曲霉酸性蛋白酶的基因进行了克隆和测序。2001年又从假丝酵母中筛选出了一种酸性蛋白酶菌株，并对该酶进行了核苷酸序列分析和功能分析。国外学者对曲霉酸性蛋白酶的结构和功能等己经研究的较为透彻。与国外相比，我国对酸性蛋白酶的研究相对较晚些。1970年上海工业微生物研究所首先从黑曲霉中筛选出一株产酸性蛋白酶菌株，并和上海酒精厂协作进行中试生产，填补了我国酸性蛋白酶制剂的空白.近年来国内在酸性蛋白酶上的研究大都致力于选育产酶活力高、抗逆性好的菌种，并获得了一些很有应用前途的产酶菌株。目前用于酸性蛋白酶生产的高产菌株主要有黑曲霉、宇佐美曲霉和青霉及它们的突变株。李永泉等，对宇佐美曲霉所产的酸性蛋白酶进行了发酵过程动力学研究.戚淑威等对青霉产酸性蛋白酶的适宜条件和酶学性质进行了分析。谢必峰等，采用硫酸铵盐析法和离子交换层析法分离纯化了黑曲霉产酸性蛋

产蛋白酶菌的筛选及产酶条件优化

陇东大学学士学位毕业论文（设计）蛋白酶产生菌的筛选及产酶条件优化生命科学与技术学院 08生物技术班作者：指导教师：蛋白酶产生菌的筛选及产酶条件优化何泰杜旭谢丽娟，刘丽萍

(陇东学院生命科学与技术学院，甘肃庆阳745000) 摘要：采用陇东学院污水处理厂附近土壤、农田土壤及养殖场附近土壤作为样品，利用牛奶水解圈筛选模型从中分离筛选得到产蛋白酶能力较高的菌株whr1，初步鉴定该菌株属于芽孢杆菌。并对其产酶条件进行优化，结果显示该菌最适培养时间为24h，最佳碳源为质量浓度1% 蔗糖，最佳氮源为质量浓度1.5%酵母膏，最适初始pH值为6.0，最适发酵温度为35℃。关键词：菌种筛选，鉴定，蛋白酶，条件优化 Protease produced the screening of the bacteria and the optimization of the enzyme production conditions （College of life science and technology, Longdong University, Qingyang 74500, Gansu, China） Abstract：The sewage treatment plant soil near east institute, soil and soil samples near farms .Using milk hydrolysis circle screening model separating screening in high ability get protease whr1 strains. Preliminary appraisal of the fungus belong to bacillus. After the optimization of the condition, the capability of whr1 was improved, the optimal condition is: The time is 24h; carbon source is sucrose 1%; nitrogen source is Y east extract 1.5 %, the pH is 6.0; fermentation temperature is 30℃. Keyword: Screening，Identified，Protease, Conditions optimization 0引言蛋白酶是水解蛋白质肽键的一类酶的总称，是一类广泛应用于皮革、毛皮、丝绸、医药、食品、酿造等方面的重要工业用酶[1]，也是目前世界上产销量最大的商业酶，其市场占有率约占整个商品酶销售量的60％，微生物蛋白酶从微生物中提取，不受资源、环境和空间的限制，具有动物蛋白酶和植物蛋白酶所不可比拟的优越性[2,3]。目前，蛋白酶的研究仍注重于新品种的发掘，并通过分离筛选、发酵条件优化和诱变育种或构建基因工程菌等综合手段获得高产蛋白酶的优良菌株[4,10]。我国的蛋白酶研究还存在如微生物资源开发不足，蛋白酶种类较少，酶制剂品种单一等问题。本论文从以下几方面对蛋白酶产生菌株进行较为系统的研究：从土壤中筛选出产蛋白酶能力较高菌株。对筛选出的菌株进行形态学的鉴定，将菌株初步确定到属。研究产蛋白酶菌株发酵产酶条件，对培养基成分和发酵条件进行优化，确定最佳培养基配方和发酵条件，进一步提高菌株的产酶活力。

发酵工艺优化

发酵工艺优化从摇瓶试验到中试发酵罐试验的不同之处 1、消毒方式不同，摇瓶是外流蒸汽静态加热（大部分是这样的），发酵罐是直接蒸汽动态加热，部分的是直接和蒸汽混合，会因此影响发酵培养基的质量，体积，PH，透光率等指标。扩大时摇考虑 2、接种方式不同，摇瓶是吸管加入，发酵罐是火焰直接接种（当然有其他的接种方式），要考虑接种时的菌株损失和菌种的适应性等。 3、空气的通气方式不同，摇瓶是表面直接接触。发酵罐是和空气混合接触，考虑二氧化碳的浓度和氧气的融解情况。 4、蒸发量不同，摇瓶的蒸发量不好控制，湿度控制好的话，蒸发量会少。发酵罐蒸发量大，但是可以通过补料解决的。 5、搅拌方式不同，摇瓶是摇转方式进行混合搅拌，对菌株的剪切力较小。发酵罐是直接机械搅拌，注意剪切力的影响和无菌的影响。 6、PH的控制，摇瓶一般通过碳酸钙和间断补料控制PH，发酵可以直接流加控制PH，比较方便。 7、温度控制，摇瓶是空气直接接触或者传热控制温度，但是发酵罐是蛇罐或者夹套水降温控制，注意降温和加热的影响。 8、注意染菌的控制方法不一样，发酵罐根据染菌的周期和染菌的类型等可以采取一些必要的措施减少损失。 9、发酵罐可以取样或者仪表时时检测，但是摇瓶因为量小不能方便的进行控制和检测。 10、原材料不一样，发酵所用原材料比较廉价而且粗旷，工艺控制和摇瓶区别很大等等发酵工艺中补料的作用补料分批培养(fed—batch culture简称FBC)是指在分批培养过程中、间歇或连续地补加一种或多种成分的新鲜培养基的培养方法、与传统的分批集中补料培养相比、它有以下优点： (1)可以避免在分批发酵中因—次投料过多造成发酵液环境突变，造成菌丝大量生长等问题，改善发酵液流变等性质，使得发酵过程泡沫得以控制，节省消泡剂，并提高了装罐系数。 (2)可以控制细胞质量，以提高芽抱的比例，并使pH得以稳定。 (3)可以解除底物抑制，产物反馈抑制和分解阻遏。 (4)可以使“放料和补料”方法得以实施。该方法在发酵后期、产生了一定数量代谢产物后，在发酵液体积测量监控下，放出一部分发酵液，同时连续补充——部分新鲜营养液，实现连续带放、既有利于提高产物产量．又可降低成本，使得发酵指数得以大幅度提高。 (5)利用FBC技术、可以使菌种保持最大的生产力状态．随着传感技术以及对发酵过程动力学理沦深入研究、用模拟复杂的数学模型使在线方式实最优控制成为可能。连续补料控制目前采用有反馈控制和无反馈控制两种方式。有反馈控制：选择与过程直接关系的可检测参数作为控制指标，例如可以测量、控制发酵液PH、采用定量控制葡萄糖流加。稳定PH在次级代谢最旺盛水平。而无反馈控制FBC是指无固定的反馈参数，以经验和数学模型相结合的办法来操作最优化控制、从而使抗生素发酵产量得以大幅度提高。例如发酵过程中前体的补加。由此可见，要实现对发酵过程的有效控制，就先要解决补科的连续控制问题。目前国外发酵生产过程连续补料采用：流量计(电磁流量计、液体质量流量计)、小型电动、气动隔膜调节阀和控制器来实现连续补料控制。菜发酵工厂在中试试验中还成功地运用了电子称加三阀控制的自动补科系统至于装液量的问题，应该从以下几个方面考虑： 1、保持在你所需要的转速培养情况下（尤其是在后期，菌丝很多时，转速很高时），不能让发酵液把你的塞子湿掉，容易造成染菌。 2、装液量的体积在消毒过程中，不能因为沸腾把塞子湿掉，或者跑出三角瓶，装液量太多会出现这样的情况。很容易染菌。 3、根据你的菌种的情况和发酵液的粘度，需要的混匀程度等等方面也要考虑。 4、建议你做一个梯度试验（40－50－60－70－80等）就可以找到你所需要的装液量。关于剩余空气的排除在灭菌完毕后（100度左右），立刻用盖子或者其他的用品把你的培养摇瓶盖好，有时候这么点空气根本对兼性厌氧发酵没有什么影响，如果你的菌种要求很严的话，最好用干冰加入已经灭菌的空摇瓶后，立刻用其他的样品培养基分装即可。当然也可以用氮气。最好是二氧化碳。你可以再查查看是否有其他的方法，我说的也不完全。！！

年产000吨饲用酸蛋白酶的生产工艺设计课程设计

年产1000吨饲用酸性蛋白酶的生产工艺设计 1. 前言酸性蛋白酶是一类最适pH值为2.5?5.0的天冬氨酸蛋白酶，相对分子质量为30000 ?40000。酸性蛋白酶主要来源于动物的脏器和微生物分泌物,包括胃蛋白酶、凝乳酶和一些微生物蛋白酶。根据其产生菌的不同，微生物酸性蛋白酶可分为霉菌酸性蛋白酶、酵母菌酸性蛋白酶和担子菌酸性蛋白酶.根据作用方式可分为两类：一类是与胃蛋白酶相似，主要产酶微生物是曲霉、青霉和根霉等；另一类是与凝乳酶相似，主要产酶微生物是毛霉和栗疫霉等。细菌中尚未发现产酸性蛋白酶的菌株.由于酸性蛋白酶具有较好的耐酸性，因此被广泛地应用于食品、医药、轻工、皮革工艺以及饲料加工工业中。国外关于酸性蛋白酶的生产研究从20世纪初就开始了。1908年，德国科学家从动物的胰脏中提取出胰蛋白酶，并将其用于皮革的鞣质。1911年美国科学家从木瓜中提取木瓜蛋白酶（在酸性，碱性和中性的条件下都能分解蛋白质的酶）并将木瓜蛋白酶用于除去啤酒中的蛋白质浑浊物。自1954年吉田首次发现黑曲霉可产生酸性蛋白酶以来，国内外对微生物发酵生产酸性蛋白酶进行了广泛的研究。1964年外国科学家首次发现大孢子黑曲霉突变体能产生两种不同的酸性蛋白酶，即酸性蛋白酶和酸性蛋白酶。1965年又从血红色陀螺孔菌，中分离出了一种酸性蛋白酶，并对该酶进行了纯化和结晶。1968年从微小毛霉中筛选出了一种酸性蛋白酶，并对其进行了纯化和酶学性质分析。1995年外国科学家对烟曲霉酸性蛋白酶的基因进行了克隆和测序。2001年又从假丝酵母中筛选出了一种酸性蛋白酶菌株，并对该酶进行了核苷酸序列分析和功能分析。国外学者对曲霉酸性蛋白酶的结构和功能等己经研究的较为透彻。与国外相比，我国对酸性蛋白酶的研究相对较晚些。1970年上海工业微生物研究所首先从黑曲霉中筛选出一株产酸性蛋白酶菌株，并和上海酒精厂协作进行中试生产，填补了我国酸性蛋白酶制剂的空白.近年来国内在酸性蛋白酶上的研究大都致力于选育产酶活力高、抗逆性好的菌种，并获得了一些很有应用前途的产酶菌株。目前用于酸性蛋白酶生产的高产菌株主要有黑曲霉、宇佐美曲霉和青霉及它们的突变株。李永泉等，对宇佐美曲霉所产的酸性蛋白酶进行了发酵过程动力学研究.戚淑威等对青霉产酸性蛋白酶的适宜条件和酶学性质

产蛋白酶芽孢杆菌

北方民族大学学生实验论文论文题目:产蛋白酶芽孢杆菌的分离、纯化与选育院(部)名称:生物科学与工程学院学生姓名:杨嘉怡专业:生物工程学号:20103371班级:102班指导教师姓名:刘雅琴实验小组成员:高瞻，邢艳东，刘帅，阳波组别:第五组实验成绩: 北方民族大学教务处制

产蛋白酶芽孢杆菌的分离、纯化与选育摘要酶（英语：Enzyme，又称酵素），指具有生物催化功能的高分子物质。几乎所有的细胞活动进程都需要酶的参与，以提高效率。酶作为催化剂，本身在反应过程中不被消耗，也不影响反应的化学平衡。酶具有高度的专一性，只催化特定的反应或产生特定的构型。酶是生物体内进行生物化学反应的催化剂，在生物体中已发现的酶有2500多种。目前已知的可以被酶催化的反应有约4000种。在生物体内，酶发挥着非常广泛的功能。由于酶促反应的特异性强，反应条件温和，安全无毒，环境污染少，在洗涤剂、皮革、纺织、造纸、诊断、制药等领域具有广泛的应用价值。目前，能由工业生产的50多种酶制剂包括蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、果胶酶、纤维素酶、葡萄糖氧化酶，葡萄糖异构酶等，这些酶大部分是由霉菌、细菌、链霉菌和酵母菌产生的。通过本实验项目，使学生学会从自然界中分离产酶微生物的方法，菌种的纯化技术及其高产菌的选育技术。许多细菌和霉菌产生蛋白酶，细菌中的芽孢杆菌是常见的蛋白酶产生菌。本实验将土壤样品（或其他样品）悬液加热处理，杀死非芽孢细菌及其他微生物后进行划线分离得到芽孢杆菌，将其接种到酪蛋白平板进行培养，根据酪蛋白平板的水解圈作初筛。也可直接将细菌或霉菌接种到酪蛋白平板进行培养，分离筛选其他蛋白酶产生菌。生物的遗传信息的改变是通过基因突变、基因重组和基因转移来进行的。基因突变，又称点突变（point mutation），包括自发突变和诱发突变，前者是未经人为施加诱变剂处理而发生的突变，后者是经人为施加诱变剂处理而获得的突变。两种突变都是由于一个或几个碱基的增加、缺失或置换而引起的，因此本质相同，不同的只是诱发突变的频率比自发突变的频率要高得多。这一部分的实验是以紫外线和亚硝基胍为例介绍了物理因素和化学因素对微生物的诱变作用。本实验中，将筛选出的蛋白酶的产生菌株作为出发菌株通过紫外线对微生物诱变作用，对菌株进行选育工作。关键字：芽孢杆菌，分离，突变，筛选

毛霉蛋白酶的催化特性及动力学研究

毛霉是腐乳发酵生产的主要菌种，在腐乳生产工艺中其主要作用是分泌蛋白酶水解豆腐胚内的大豆蛋白。腐乳成品中的蛋白质主要是以多肽的形式存在的，具有相当高的水解程度，并且已经从中分离出多种具有生理活性的多肽[1-2]。而对众多腐乳产品的感官分析也表明，腐乳产品通常不具有一般蛋白水解物所特有的苦味。综合以上结果来看，毛霉蛋白酶在解决大豆蛋白水解率低、水解物的苦味等难题方面具有很大的潜力。毛霉虽然在发酵工业中的应用有着悠久的历史，但是对这类菌种胞外蛋白酶系的研究却并未完全开展。仅有极少数学者对该菌种的发酵产酶特性及粗酶的催化、水解特性进行过探讨[3-5]。然而，毛霉由于长期受到高蛋白环境条件的驯化， Catalytic and kinetic properties of one protease from Mucor PAN Jin-quan (Life Science and Technology School,Zhanjiang Normal University,Zhanjiang 524048)Abstract:One protease was purified from extracellular of Actinomucor elegans AS3.2778and its catalytic and kinetic properties were also investigated.The results show that the purified protease was one alkaline serine protease,which has relatively higher activity at pH8.5～9.5and 60℃,and is stable at pH6.0~9.0at ＜45℃.At 40℃,the kinetics of casein hydrolysis by the protease fit the Mchaelis-Mentonequation:V=22.8S S+8.857,and the energy of activation (Ea)of this hydrolysis reaction below 45℃is 44.09kJ.The protease was unstable at 50℃,and the kinetics of deactivation fit the model:a=exp(－0.218t). Key words:Actinomucor elegans;protease;catalytic properties;kinetics 潘进权 (湛江师范学院生命科学与技术学院，湛江524048) 摘要：从雅致放射毛霉胞外分离纯化出一蛋白酶组分，以酪蛋白为底物对其催化特性及动力学进行了分析。结果表明：该蛋白酶组分是一种碱性丝氨酸蛋白酶；在pH8.5～9.5、60℃具有最大催化活性，在pH6～9和低于45℃具有很好的稳定性；在40℃该蛋白酶水解酪蛋白的反应符合米氏方程：V=22.8S S+8.857；在4～45℃的范围内，该蛋白酶水解酪蛋白反应的活化能Ea 为44.09 kJ ；该蛋白酶在50℃不稳定，其热失活规律符合一级指数衰减动力学模型：a=exp(－0.218t)。关键词：雅致放射毛霉；蛋白酶；催化特性；动力学中图分类号：TS 201.2 文献标志码：A 文章编号：1005-9989(2010)11-0036-05 毛霉蛋白酶的催化特性及动力学研究收稿日期：2010-03-13 基金项目：广东省自然科学基金项目(9452404801001943)。作者简介：潘进权(1978—)，男，博士，讲师，主要从事酶与发酵工程相关领域的研究工作。 ·36 ·

蛋白酶的工厂设计

年产1500m3蛋白酶的工厂设计摘要蛋白酶是催化肽键水解的一类酶，它可迅速水解蛋白质为胨、肽类，广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实和微生物中。同时大多数微生物蛋白酶都是胞外酶。微生物蛋白酶按其作用的最适pH可分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶三类。酸性蛋白酶是一种羧基蛋白酶，它的分子质量为30-40kD，等电点（pH3.0-5.0）酸性蛋白酶现已广泛应用于食品、饲料、酿造、毛皮与皮革、医药、胶原纤维等各个行业之中。本设计采用豆饼粉、玉米粉、淀粉为主要的培养基原料，并选用黑曲霉（Aspergillus niger ）3.350菌种发酵。其中豆饼粉3.75%，玉米粉0.625%，鱼粉0.625%，氯化铵1%，氯化钙0.5%，磷酸氢二钠0.2%。本设计利用通风搅拌式发酵罐进行发酵，同时利用离子交换树脂对母液进行提取，提高了酸性蛋白酶的生产效率，减少了生产成本。设计还包括发酵罐，全厂平面图，车间平面布置图，工艺流程图。关键词：酸性蛋白酶发酵工厂设计

The Process Design of the Protease used for Section with the Capacity of 1500m3 Annually Abstract protease is a kind of Peptone and peptide. It has been discover across in animal giblets ,the stem of plant,fruit , microbial and so on.Most of the Microbial protease are ectoenzyme .According to its best Optimum pH function ,Microbial protease Can be divided into Acid protease ,Neutral protease and alkaline protease .Acid protease is a kind of Carboxyl protease , Its molecular weight is 30-40 kd, lower isoelectric point (pH3.0-5.0) Acid protease in food, medicine, textile, leather, feed, cosmetics, washing industries have applications, natural health, avirulent and harmless, quite safe. So in this paper the basic content of more acid protease, production process and application development were introduced. This design USES the bean cake powder, corn flour, starch as the main medium of raw materials, and selects the Aspergillus Niger, Aspergillus Niger) 3.350 bacterial fermentation. With bean cake powder 3.75%, corn flour 3.75%, 0.625% fish meal, 1% ammonium chloride, calcium chloride 0.5%, disodium hydrogen phosphate 0.2%. This design using the ventilation agitator in fermentor, using ion exchange resin in mother liquid was extracted at the same time, improve the efficiency of the acid protease production, reduce the production cost. The design also includes Fermentor, The factory plan, Shop floor plan, Flow Chart. Key Words: Acid protease ; fermentation; plant-design;

蛋白酶产生菌的筛选

蛋白酶产生菌的筛选组别：第*组班级：生工**班组员：*** 指导老师：*** 一、实验目的学习从自然界中分离蛋白酶产生菌

二、实验内容蛋白酶产生菌的分离三、实验原理许多细菌和霉菌产生蛋白酶，细菌中的芽孢杆菌是最常见的蛋白酶产生菌。本实验将土壤样品悬液加热处理，杀死非芽孢细菌及其他微生物后进行划线分离得到芽孢杆菌，将其接种到奶粉培养平板并进行培养，根据奶粉平板的水解圈做初筛。将初筛的蛋白酶产生菌接入产酶培养基振荡培养，测定蛋白酶的活力，最终得到产蛋白酶的芽孢杆菌。也可直接将细菌接种到奶粉培养平板进行培养，分离筛选其他蛋白酶产生菌。四、实验材料和用具 1.材料：土壤样品 2.试剂：牛肉膏蛋白胨培养及平板、奶粉培养基平板、45mL 无菌水（带玻璃珠）、芽孢染色液、 3.仪器及用具：紫外分光光度计、显微镜、恒温水浴锅、摇床、酒精灯、接种针、游标卡尺、无菌移液管、无菌试管、量筒、容量瓶、漏斗、试剂瓶、漏斗、载玻片、滤纸、擦镜纸。五、操作步骤

（一）配制所需培养基按照以下配方配制所需的培养基牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏 0.5g，蛋白胨 1g，NaCl 0.5g，琼脂 1.5～2.0g，水 100ml，pH 7.2 配制200mL 奶粉培养基：牛肉膏 0.5g，蛋白胨 1g，NaCl 0.5g，琼脂 2.0g，水 100ml，pH 7.0～7.2 脱脂奶粉 3g，配制200mL （二）分离 1.采集土壤样品，用无菌水植被1:10土壤悬液。 2.取1:10土壤悬液5 mL，注入已灭过菌的试管中，将此试管放入75～80℃水浴中热处理10min以杀死非芽孢细菌。 3.取加热处理过的土壤悬液100～200μL，涂布接种到牛肉膏蛋白胨培养平板，后将平板倒置，于30～32℃下培养24～48h. 4.对长出的单菌落进行编号，选择表面干燥、粗糙、不透明的菌落，挑取少许菌苔涂片，做芽孢染色，判断是否为芽孢杆菌。（三）筛选 1、从判定为芽孢杆菌的菌落处，分别挑取少许菌苔，先接种奶粉斜面培养基，再转接奶粉培养基平板上，30～32℃下培养24～48h。