石蜡切片技术实验(内附组织染色后的照片)
石蜡切片技术实验
实验目的
掌握动植物材料石蜡切片的方法及要求。
实验材料
小白鼠各种器官组织
实验方法
? 石蜡切片技术（一）取材与固定
? 石蜡切片技术（二）渗透与包埋
? 石蜡切片技术（三）切片
? 石蜡切片技术（四）染色
? 石蜡切片技术（五）观察总结
一、取材与固定
1 准备工作：工具、药品、计划等
2 动物的麻醉：氯仿麻醉
3 解剖取材
4 材料分割：保持样品的完整性与代表性，考虑切片方向，实心组织大小5*5*2mm,空心细长组织10mm长。
5 固定：布温氏固定液固定24h。
6 漂洗：70%乙醇换洗3次，每次20~60min。
7 保存：70%乙醇0~4 ℃。
二、脱水、渗透与包埋
1 脱水：85%乙醇→95%乙醇→100%乙醇→100%乙醇，每步30min~60min
2透明：1/2乙醇＋1/2二甲苯→二甲苯→二甲苯，每步30min~60min
3 渗透： 1/2二甲苯＋ ?石蜡→石蜡→石蜡，每步20min~60min，温度62℃
4 包埋：将材料放入盛有石蜡的纸盒中，摆好位置（要考虑下一步的修快与切片方向），在水中冷却5～10min.
三、切片
1 修块用单面刀片在玻璃板上修快使达到以下要求：
（1）一个蜡块含一个材料，蜡块呈正方形或长方形，材料位于蜡块正中央。
（2）材料边缘与蜡块边缘平行，各面要平直，材料边缘与蜡块边缘的距离约3mm。
2 固着将修好块的蜡块用烧热的解剖刀固着在样品台上。
3 切片按以下顺序进行
（1）将样品台固定在切片机样品臂上，使切面竖直；
（2）调切片厚度5～10um；
（3）将切片刀用纱布蘸少许二甲苯擦净后装到切片机上，调刀角15～20，将刀固定好；（4）调刀距使样品与刀口尽可能靠近；
（5）切片顺时针摇动切片机速度40-60r/min；
（6）将切好的蜡带光面向下用毛笔放到台纸上
4 贴片
(1)清洗载波片；
(2)加粘片剂，要求薄、匀；
(3)放切片，光面向下；
(4)加水于切片下面；
(5)展片将载波片放于50℃的温台上至切片完全展平；
(6)烤干吸掉多余水，继续放于温台上至水完全干燥；
5 贴标签临时标签，用铅笔写明组号、姓名。
四、染色
1 脱蜡二甲苯(2)→二甲苯(1)，每步510min；
2 复水 1/2乙醇+1/2二甲苯→100%乙醇(2)→ 100%乙醇(1)→ 85%乙醇→ 70%乙醇→ 50%乙醇→ 30%乙醇→
蒸馏水,每步2min；
3 初染代氏苏木精染色15min；
4 分化 0.1%HCl脱色至变红→0.1%NaOH至变蓝；
5 脱水蒸馏水（3－5s）→ 30%乙醇→ 50%乙醇→70%乙醇→ 85%乙醇,每步2min；
6 复染 0.5%伊红（溶于95%乙醇）染色10~15min；
7 脱水透明95%乙醇(1020s)→100%乙醇(1) →100%乙醇(2)→ 1/2乙醇+1/2二甲苯→二甲苯(1) →二甲苯(2)(≥3min),每步2~3min；
8 封片将材料周围擦干净（注意在擦的过程中材料上的二甲苯必须保证不能干，可随时补加），加1～2滴中性树胶，加盖玻片（需提前洗净擦干备用）；
9 贴标签注明样品名称、染色方法、组号、姓名和日期；
10 镜检检查样品取材、切片及染色情况，熟悉样品为下次样品观察做好准备；
11 干燥平放于展片盘中，于37℃温箱中或自然干燥；
12 预习下次实验：样品的观察，需提前做好预习，并准备纸、铅笔。
五、观察
1 样品观察
? 小白鼠脑；
? 小白鼠心肌；
? 小白鼠肝脏；
? 小白鼠肾脏；
? 小白鼠肺；
? 小白鼠小肠；
? 小白鼠肌肉；
? 小白鼠精巢；
? 小白鼠卵巢等。
2 绘图
? 任选一种样品将结构完整地绘于实验报告上。
3 样品结构显微照片如下：
石蜡切片免疫组化染色步骤
石蜡切片免疫组化染色步骤 1、载玻片的处理： 抗原修复过程中，由于高温、高压、辐射等诸多因素的影响，极易造成脱片。为保证试验的正常进行，可选用我公司提供的ZLI-9001 APES、ZLI-9003 Histogrip TM或ZLI-9005 Poly-L-Lysine等几种试剂，对已清洗的载玻片进行处理。具体方法如下： 1.1 APES：现用现配。将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的APES中，停留20~30秒钟，取出稍停片刻，再入纯丙酮溶液或蒸馏水中涮去未结合的APES，置通风橱中晾干即可。用此载玻片捞片时应注意组织要一步到位，并尽量减少气泡的存在，以免影响染色结果。 1.2 Histogrip TM：将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的Histogrip液中，停留1~2分钟，然后用双蒸水快速清洗三次，室温干燥或60o C烤箱烘烤一小时，装盒备用。 1.3 Poly-L-Lysine：将洗净、干燥的载玻片放入以1:10比例去离子水稀释的多聚赖氨酸溶液中，浸泡5分钟，60o C烤箱烘烤一小时或室温过夜干燥。装盒备用。试验中使用的器具均为非玻璃制品。 2、常用酶消化： 2.1 胰蛋白酶：一般使用浓度为0.05%~0.1%，消化时间为37℃、10~40分钟，主要用于细胞内抗原的显示。 2.2 胃蛋白酶：一般使用浓度为0.4%，消化时间为37℃、30~180分钟，主要用于细胞间质抗原的显示，如：Laminin（层粘蛋白），Collagen IV（IV型胶原）等。 2.3 皂素（Saponin）：一般使用浓度为2~的saponin溶液，消化时间为室温孵育30分钟。 3、抗原热修复： 可根据实验室的具体条件，选用微波炉抗原修复、高压锅抗原修复或水浴高温抗原修复。抗原热修复可选用各种缓冲液，如TBS、PBS、重金属盐溶液等，但实验证明，以0.01M枸橼酸盐缓冲液（pH6.0）效果最好。请选用我公司提供的ZLI-9064 枸橼酸盐缓冲液（粉剂）配制，取该粉剂一包溶于1000ml 的蒸馏水中，混匀，其pH值在6.0 0.1，如因蒸馏水本身造成的pH值偏差，请自行调整。 3.1 石蜡切片微波炉抗原修复操作方法：切片脱蜡至水后，3％H2O2处理10分钟，蒸馏水洗2分钟×3。将切片放入盛有枸橼酸盐缓冲液（工作液）的容器中，置微波炉内加热使容器内液体温度保持在92℃~98℃之间并持续10~15分钟（注意：无论是使用医用或家用微波炉，请根据具体机型酌情设置条件，务必满足以上步骤中对温度和时间的要求）。取出容器，室温冷却10~20分钟（注意：不可将切片从缓冲液中取出冷却，以便使蛋白能够恢复原有的空间构型）。PBS洗，下接免疫组化染色步骤。 3.2 石蜡切片高压抗原修复操作方法：切片脱蜡至水。将1500ml~3000ml的枸橼酸盐缓冲液（工作液）注入不锈钢压力锅中加热至沸腾。切片置于金属架上，放入锅内，使切片位于液面以下，盖锅压阀。当压力锅开始慢慢喷气时（约加热5~6分钟后），计时1~2分钟，然后将压力锅端离热源，冷水冲至室温后，取下气阀，打开锅盖，取出切片，蒸馏水洗后，PBS洗2分钟×3，下接免疫组化染色步骤。 3.3 石蜡切片电炉煮沸抗原修复操作方法：切片脱蜡至水后，放入盛有枸橼酸盐缓冲液（工作液）的容器中，并将此容器置于盛有一定数量自来水的大器皿中，电炉上加热煮沸，从小容器的温度到达92℃~98℃起开始计时15~20分钟，然后端离电炉，室温冷却20~30分钟，蒸馏水冲洗，PBS洗，下接免疫组化染色步骤。 4、免疫组化染色步骤： （以美国ZYMED公司SP试剂盒为例） 4.1石蜡切片脱蜡至水。 4.2 3%H2O2室温孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。 4.3蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，(如需采用抗原修复，可在此步后进行)。
石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法
石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法 1、组织得采集、固定与保存: 采取组织后, 方法一:4％多聚甲醛(4％ＰＦＡ)4?Ｃ固定1小时(根据组织大小与致密程度调整固定时间)或过夜 方法二:采用boｕｉn’s固定ＲT 2h(6—8dｔeｓis)or RＴ过夜(成年tesiｓ) PBS缓冲液洗三次,每次5ｍin,4?C保存于7０%乙醇中。 ２、组织得包埋、切片、展片及保存:: 固定后得样品经梯度乙醇脱水、二甲苯透明,５2－54?C石蜡包埋,常规切片,切片厚4—１０μm,贴于处理过得干净载玻片上,37?C烤片过夜,之后收集于载片盒中,RT密封保存。 石蜡包埋: 保存于４?Ｃ70％乙醇中得组织样品 ↓ 80％乙醇1５ｍin ↓ 95%乙醇15 miｎ ↓ 1０0%乙醇15mｉｎ? 2 ↓ 1/2乙醇１／２二甲苯15 ｍin ↓ 二甲苯透明5-１0 min ↓ 1／２二甲苯１/2石蜡３0 min
↓ 石蜡(1) 1。5hｒ ↓ 石蜡(2) 1.5－２.5hr ↓ 石蜡(3) 包埋 ↓ RT保存 3、石蜡组织切片得免疫组化方法: 密封保存于RT得组织切片 ↓ 二甲苯(1) 20 min ↓ 二甲苯(2)20ｍin ↓ 100％乙醇20ｍin ↓ 95％乙醇10 min ↓ 8０％乙醇10miｎ ↓ 通风橱晾干,阻水笔在组织周围画圈 ↓ 切片在ＰBS中浸泡 5 ｍin＊2 ↓ 0.4%Tritonx RＴ10 mｉn ↓ 切片在PＢS中浸泡 5 min＊3 ３％H２O2 RT １０ｍin
切片在PBS中浸泡５ｍｉn*3 0、25％胰酶RT １0min 切片在PBS中浸泡 5 min*３ Blocking bｕｆfｅr(3%BSA+5%NGS＋０、2%Ｔritｏnx—１０0 in PBS) ＲT 60mｉn 倾去blｏｃking buffｅｒ,勿洗 一抗4 C overnighｔｉn blｏckinｇbuffeｒ 取出切片复温1h,切片在PBＳ中浸泡 5 mｉn*３ 二抗iｎblocking ｂufｆer GＡR1:２00 (GＡM1:100),R Ｔ 1h 切片在PBS中浸泡５min*3 DAB显色５—１0min(５0微升A＋５0微升B＋９0０微升ＰBS+5微升3％H2Ｏ2) 如果就是增强型DＡB只要1ｍｉn即可。 切片浸入PBS终止显色,ＨE衬染1s, 玻片架放入泡沫盒,流水冲洗15mｉn,肉眼瞧到淡淡得紫色即可停止。 若颜色太深,可用0、１-０、5％盐酸乙醇分色1～2秒钟(或更久)
HE石蜡切片步骤,免疫组化步骤
HE染色 1．取材 切取的组织块不宜太大，以利于固定剂穿透，通常以6mm×6mm×5mm为宜。 注意事项： （1）取材动作要迅速，不宜作太久的拖延以免组织细胞的成分、结构等发生变化。 （2）切片材料应根据需要观察的部位进行选，尽可能不要损伤所需要的部分。 2．固定 将切好的组织用生理盐水组织洗3次，立即投入10%中性福尔马林固定液或4%多聚甲醛中固定，固定36小时。 注意事项： （1）一般固定液，都以新配为好，配好后应贮存在阴凉处，不宜放在日光下，以免引起化学变化，失去固定作用。 （2）有些混合固定液的成份之间会发生氧化还原作用，一定要在使用前才混合，如果混合太早，固定时就没有作用了。 （3）固定材料时，固定液必须充足，一般为材料块的20~30倍，有些水分多的材料，中间应更换1-2次新液。 （4）材料固定完毕后，保存于严密紧塞或加盖的容器里，同时在容器外上标签，并随同材料在溶液中投入相应的标签，以免相互混淆。标签上注明固定液、材料来源、日期等。标签上的文字，应用黑色铅笔或绘图黑墨水书写。 脱钙72小时中间不换液是样本30倍中杉金桥（进口脱钙液） 镊子触质粒由硬变韧性为准。 （美）：固定3-5天根据组织大小确定天数，越大固定时间越长。 3. 洗涤 材料经固定后,PBS或双蒸水冲洗约3小时。（20，30，30，60） （美）：流水冲洗约4小时 4. 脱水 材料依次经80%、90%、100%、100%各级乙醇溶液脱水，各30min 注意事项： （1）脱水必须在有盖的玻璃品中进行，防止吸收空气中的水分。 （2）在更换高一级的脱水剂时，最好不要移动材料以免损坏，可用吸管吸出器皿中的脱水剂，再用吸水吸尽器皿内剩余液，然后于皿中加入高一级脱水剂。 （3）在低浓度酒精中，每级停留不宜太长，否则易使组织变软，助长材料的解体。 （4）在高浓度或纯酒精中，每级停留的时间也不宜太长，否则会使组织变脆，影响切片。（5）如需过夜，应停留在80%酒精中。 （6）脱水必须彻底，否则不易透明，甚至使透明剂内出现白色混浊现象 （美）：80％的酒精×2小时 95％的酒精×2小时 100％的酒精×2小时×2 100％的酒精×1小时或者更长时间 5．透明（环保透明脱蜡液）中杉金桥 纯酒精、二甲苯等量混合液15min，二甲苯Ⅰ60min、Ⅱ30min（至透明为止）。 由于乙醇与石蜡不相溶，而二甲苯既能溶于乙醇又能溶于石蜡，所以脱水后还要经过二甲苯以过渡。当组织中全部被二甲苯占有时，光线可以透过，组织呈现出不同程度的透明状态。
石蜡切片的基本操作流程
石蜡切片的基本操作流程 一、取材选取目的组织块，修剪到合适的大小； 二、固定 将组织块放入福尔马林固定液（10%甲醛溶液），固定时间由组织块大小而定，一般不少于24h；体积1cm3的组织块，一般为3-7天； 三、冲水自来水洗几下，泡1小时； 四、系列酒精脱水 50%酒精，1h； 70%酒精，1h； 80%酒精，1h； 90%酒精，1h； 100%酒精（I），1h； 100%酒精（II），1h； 五、透明 酒精：二甲苯=1：1溶液，过夜； 二甲苯，1h； 六、包埋 二甲苯：石蜡=1：1，65-70 ℃，2h； 新鲜石蜡（I），65-70 ℃，1h； 新鲜石蜡（II），65-70 ℃，4h； 新鲜石蜡包埋； 七、切片切片厚度为5-7um； 八、展片温水（40-42 ℃）展片； 九、捞片将展好的片子贴于载玻片上； 十、烘片42 ℃将片子上的水烘干； 十一、烤片60 ℃烤片12-24h； 十二、脱腊 二甲苯（I）：2min； 酒精：二甲苯=1：1溶液：2min； 十三、水化 100%酒精（I）：1min； 100%酒精（II）：1min； 95%酒精：1.5min； 80%酒精：1.5min； 70%酒精：1.5min； 50%酒精：1.5min； 自来水洗：2min 十四、H&E染色 Hematoxylin染色3-5min(2.5min时取出观察染色效果)，自来水洗3次，盐酸分化（2/3杯玻璃缸+3滴1N盐酸），10s；自来水洗蓝化，镜下观察染色效果；（伊红）Eosin染色30-50s，直接脱水（90%酒精-----100%酒精I，100%酒精II各1分------酒精：二甲苯=1：1溶液：1-1.5min）；十五、脱水 90%酒精-100%酒精-100%酒精，各1min； 十六、透明 二甲苯：酒精：1-1.5min；二甲苯：2min；
病理切片的特殊染色方法
1. Van Gieson苦味酸和酸性品红法 【染色方法】 (1)中性甲醛固定组织，石蜡切片； (2)组织切片脱蜡至水； (3)用Van Gieson液染1?5分钟； (4 )倾去染液，直接用95 %乙醇分化和脱水； (5) 无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。 【结果】胶原纤维呈红色，肌纤维、胞质及红细胞呈黄色。2. Masson氏结缔组织三合染色法 【染色方法】 (1)石蜡切片厚6ym,脱蜡至水； (2)0.2 %冰醋酸水溶液浸泡片刻； (3)Masson氏染色液中5分钟或更长时间； (4)0.2 %冰醋酸水溶液浸泡片刻； (5) 5 %磷钨酸水溶液2?3分钟，再入0.2 %冰醋酸水溶液浸洗 (6 )投入淡绿、冰醋酸水溶液浸染5分钟或更长时间； (7)再入0.2 %冰醋酸水溶液浸洗片刻； (8)脱水、透明和封固。 【结果】胞浆和神经胶质纤维染红色，胶原纤维染绿色。 【染色方法】 (1 )石蜡切片、脱蜡至水； (2)0.25 %高锰酸钾液3分钟； (3 )蒸馏水洗2次； (4) 1 %草酸漂白即可； (5 )蒸馏水洗2次； (6) 2.5 %铁明矶水溶液媒染5?10分钟，蒸馏水洗多次; (7)二氨氢氧化银浸染1分钟，蒸馏水洗3次； (8)10 %甲醛液还原2分钟，蒸馏水洗3次； (9)0.2 %氯化金液调色1?2分钟，蒸馏水洗3次； (10)5%硫代硫酸钠固定5分钟； (11 )蒸馏水洗，需要时复染； (12)水洗、脱水、透明和封固。
【结果】网状维呈黑色，其他组织呈复染的颜色。 显示弹性、胶原纤维的双重组合染色法 【染色方法】 (1)中性甲醛液固定组织，石蜡切片，常规脱蜡至水； (2)切片入70%乙醇中洗2分钟； (3)将切片浸入盛有维多利亚蓝液中染0.5?2小时； (4)直接入95%乙醇中分色数秒钟； (5)浸入蒸馏水洗2分钟； (6)用丽春红S液滴染切片5分钟； (7)直接用无水乙醇冲洗多余染色液2次； (8 )将切片在空气中或冷风干燥； (9)二甲苯透明，中性树胶封固。 【结果】弹性纤维呈蓝绿色，胶原纤维呈红色，背景呈淡黄色 【染色方法】 (1)冰冻切片厚度8?15ym; (2)Harris苏木素，染约1分钟； (3)自来水洗后，用0.5%盐酸乙醇分化，再水洗直至胞核返蓝为止； (4)蒸馏水洗后移入70%乙醇内浸洗一下； (5)浸入苏丹III染液中约30分钟或更长时间(如果置于56 °C温箱中可适当缩短时间)； (6)在70 %乙醇分化数秒钟； (7)待切片在空气中稍凉干或用冷风机吹干； (8 )及时用明胶甘油封片。 【结果】脂肪呈橘红色，脂肪酸不着色，胞核淡蓝色。 高碘酸一Schiff ( Periodic acid Schiff ，PAS)染色法 【染色方法】 (1) 切片脱蜡至蒸馏水； (2) 浸入高碘酸氧化液中10?20分钟； (3 )蒸馏水洗2次； (4) Schiff液染色10?30分钟；
组织切片石蜡切片过程
石蜡切片过程 一、石蜡包埋: 1.脱水：组织水洗后便可酒精脱水，70% →80% →90% →95%→ 100%酒精（无水乙醇）→100%酒精，各级酒精脱水时间30-45 min。（注意：80%酒精内组织可留之较久，当天如果来不及做完就可以暂时保存一晚上，次日再继续做下去。70%的酒精可作为更久的保存剂。） 2.透蜡：脱水后组织：50%酒精+50%二甲苯30 - 45min. 二甲苯（组织透明即可停止) 15min. 50%二甲苯+50%石蜡20-30min. 纯石蜡1 45min. 纯石蜡2 45min.（透腊之前做好准备工作：准备腊杯，烘箱温度保持55—60℃左右，使石腊熔化，温度不宜过高，以免使组织发脆。） 3.包埋： a.折好纸盒，准备小镊子、酒精灯、解剖针、冷水等。 b.用温热吸管吸取石蜡注入纸盒。等待底稍微凝固，温镊子夹住样品放入盒子中央，面朝底(可以将蜡一次倒入纸盒，然后待蜡表面起膜后，用温镊子夹住样品放入蜡中，待冷却即可，整个操作过程中，切勿让蜡中起气泡)。 c.两手拿着两端，入冷水一半，吹气，使表面石蜡形成移较厚腊层，然后急速全部进入冷水中3分钟。 d.修正蜡块（上下两个面一定要平行并且光滑） e.固着蜡块
二、切片 1.切片（切片时，可以在刀片以及刀片周围涂上一点甘油） 2.贴片烤片（甘油蛋白=1/2甘油+1/2鸡蛋清）（在贴片时，用细吸管取一点点甘油蛋白（越少越好）于载玻片上，然后用手抹匀，手一定要干净。将切片放在载玻片（光亮面朝向下），然后滴几滴冷水使切片悬于水上。接着将载玻片放在37℃上烘烤。 常见问题分析： 1.切片分离不能形成蜡带：?室温过低，蜡过硬。 2.蜡带弯曲：?蜡块口下面不平行，或蜡块不与刀刃平行所致。 3.切片厚薄不一:?切片刀或蜡块未固定紧。 4.切成片后，组织与蜡块脱离：?脱水不干净等。 5.蜡片易粘在切片上或蜡片萎缩：?室温太高或蜡太软或刀的角度 太小。 6.切片破裂：?浸蜡不足或浸蜡温度过高，或在脱水剂、透明剂中 时间过长，引起组织发脆或有杂质，材料脱钙不完全，此种无法补救。 7.蜡片上卷，切过刀口即破裂：?刀口太钝或沾有石蜡或刀的角 度过大或蜡太硬。 *：包埋时，时间长会使标本变质，过短则石蜡不能透进标本。石蜡包埋过程中，注意控制温度保持在58-60℃，石蜡不能融化。
免疫荧光非特异性染色的消除方法
免疫荧光非特异性染色的消除方法 一、非特异性染色的主要因素 组织的非特异性染色的机理很复杂，其产生的原因主要可分为以下几点： （1）一部分荧光素未与蛋白质结合，形成了聚合物和衍化物，而不能被透析除去。 （2）抗体以外的血清蛋白与荧光素结合形成荧光素脲蛋白，可与组织成分结合。 （3）除去检查的抗原以外，组织中还可能存在类属抗原（如Forssman氏抗原），可与组织中特异性抗原以外之之相应抗体结合。 （4）从组织中难于提纯抗原性物质，所以制备的免疫血清中往往混杂一些抗其他组织成分的抗体，以致容易混淆。 （5）抗体分子上标记的荧光素分子太多，这种过量标记的抗体分子带过多的阴离子，可吸附于正常组织上而呈现非特异性染色。 （6）荧光素不纯，标本固定不当等。 二、消除非特异性染色的方法 消除荧光抗体非特异性染色的方法应根据产生的原因采取适当的方法，常用的方法有以下几种： （一）动物脏器粉末吸收法 常用肝粉（猪、大白鼠或小白鼠），其次是骨髓粉、鼠脑粉和鸡胚粉等。每毫升荧光抗体中加入肝粉50～100mg,在离心管中充分混匀，在室温中振动2h，4℃中过夜，再搅拌10min，高速离心（3000～15000r/min）30min，1～2次后，即可使用其上清液。吸收一般应在临用前进行，吸收后之荧光抗体保存冰箱中勿超过2周。染色应作吸收前后之比较，吸收时可先用缓冲盐水将组织干粉浸湿，离心（3000～15000r/min）30min，除去上清液，再加入荧光抗体进行吸收，以免消耗过多的抗体。 肝粉或新鲜细胞吸收是一种非特异性的消除方法，对荧光抗体的荧光色素和蛋白都有吸附作用。如检查组织中的病毒抗原时，也可用相同的组织干粉或匀浆沉淀物吸收之。 用脏器肝粉吸收对荧光抗体损失较多，如果根据Hiramotos氏等的方法将组织的20%生理盐水匀浆液，用生理盐水洗2～3次，12000r/min 10min离心沉淀，用其沉淀物吸收其荧
石蜡切片详细步骤
石蜡切片 1.仪器 石蜡切片机、烘箱、显微镜、染色缸、小培养皿、镊子、毛笔、吸水纸、纱布、载玻片、盖玻片等。 2. 试剂 FAA固定液(70%酒精90ml、冰醋酸5ml、福尔马林5ml)、10%番红水溶液、0.5%固绿（用95%的酒精配制）、酒精（100%、95%、80%、70%、50%）、二甲苯、蒸馏水、甘油、中性树胶等。 3.取材 幼嫩的油菜植株叶片和茎 4.方法与步骤(参照) 1．固定： FAA固定液固定48小时以上。 2．脱水： 50%酒精→70%酒精→83%酒精→95%酒精→100%酒精→100%酒精。每级2h。100%酒精中1.5h。其中70%酒精处可长期保存。 3．透明： 1/2二甲苯+1/2无水乙醇 (2h) →纯二甲苯(1.5h) →纯二甲苯(1.5h) 4．浸蜡： 将处理的材料置于1/2石蜡(固体粉末状)+1/2二甲苯中，40℃烘箱敞口过夜。 5．包埋： 先提升恒温箱的温度至60℃，换纯蜡3次，每次1-2h，用硬的电光纸、牛皮纸叠纸盒，置于45-60℃的烫板上，倒入材料，摆放好材料，把标签（正面向外置于底部），补足石蜡，倒好后轻轻的置于冷水盆中，注意底面要接触盆中凉水，待石蜡全部凝固后可取出晾干，也可在凉水盆中放置过夜。 6．切片 对包埋的材料进行修块、粘块、整修后，保证材料四周都有石蜡包围。但不可太多。切面的上、下边平行。用加热的解剖刀蘸取少许石蜡碎屑，并迅速将石蜡块四周的碎屑烫平，使石蜡块牢固地粘在台木上。检查切片机，安装切片刀、调整好刀的角度，调整石蜡块与刀口之间的角度与位置后开始切片。
7．粘片 将粘贴剂置簿玻片上，再取切片浮置粘片剂上，然后置烘片台上，使切片展开烫平，材料不现皱纹为度。最后将切片依次排好，用滤纸吸去多余水分，同时以记号笔在玻片上编号，放入温箱中烘干，温度30～40℃中过夜。 8．脱蜡 脱蜡用二甲苯，把烤好的载玻片放于盛二甲苯的染缸中：纯二甲苯(10-20min)→纯二甲苯(5-10min) 9．染色 将纯二甲苯脱蜡完全的材料，1/2 二甲苯十1/2纯酒精→100%酒精→95％酒精→85％酒精→70％酒精→50％酒精→1%番红染色(4h以上) →50％酒精→70％酒精→85％酒精→95％酒精→0.5%固绿(1min)→95％酒精→100%酒精→100％酒精(未注明时间各级均为3min) 10．胶封 滴加加拿大树胶封藏。 11.镜检，拍照
组织切片制备及染色技术
组织切片制备及染色技术 （一）常规石蜡切片的制备： （1）取材与固定：切取组织时应使用锋利的刀、剪，切取组织块时，从刀的根部开始向后拉动切开组织。组织块的厚度约为0.2~0.3cm，大小为1.5cm x 1.5cm x 0.3cm为宜。取好的组织块用10%福尔马林溶液固定24~48h。 （2）包埋：先经梯度乙醇脱水后用二甲苯透明，然后入溶融的石蜡中浸透每次30min，共3次；再包埋。 （3）切片：包埋好的石蜡块即可进行切片；切片的厚度为5μm左右。 （二）苏木精－伊红（hematoxylin and eosin,HE）染色方法： （1）脱蜡：主要用二甲苯脱蜡。 （2）梯度乙醇水化。 （3）自来水冲洗。 （4）苏木精染色：水化后的切片放入苏木精染液中浸5~20min，染细胞核。自来水冲洗3~5min。 （5）1％盐酸乙醇分化5~30s。自来水冲洗1~3min。 （6）弱碱性水溶液返蓝30s~1min。自来水充分冲洗5~10分钟。 （7）伊红染色：充分水化后的切片直接入伊红染色液中，染细胞质5~15min左右。（8）梯度乙醇脱水。 （9）二甲苯透明。 （10）中性树胶封片。 二、组织化学及免疫组织化学技术 （一）组织化学（histochemistry）：一般称为特殊染色，基本原理是通过应用某些能与组织细胞化学成分特异性结合的显色试剂，定位地显示组织细胞的特殊化学成分并保持原有的形态学改变，对一些代谢性疾病的诊断具有一定的参考价值。通过光镜或电镜观察，可以检测组织切片内的蛋白质、糖类、脂类、酶类、核酸与某些金属元素等。 1.过碘酸雪夫氏染色（periodic acid-schiff stain，PAS染色）：过碘酸是一种氧化剂，它能氧化糖类及有关物质中的1.2乙二醇基使之变为二醛，醛与Schiff氏试剂结合，形成红色的取代色素而得到定位。PAS染色可显示糖原、中性黏液物质、基底膜、软骨、垂体、霉菌及寄生虫等物质。是广泛应用的染色方法。在肾小球肾炎时PAS染色可显示基底膜和系膜区的改变。 染色方法： （1）切片按常规脱蜡水洗，再用蒸馏水洗涤。 （2）0.5%~1％过碘酸水溶液氧化5~10min。 （3）蒸馏水充分洗涤，至少3次。 （4）Schiff氏试剂染10~30min。 （5）倾去染液后，直接用亚硫酸冲洗液处理切片3次，每次2 min，以达到分化。 （6）自来水冲洗5~10 min，使之显现出红色。然后蒸馏水洗1次。 （7）明矾苏木精染核，自来水充分洗涤。 （8）95%乙醇及无水乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封固。 结果判定：PAS阳性物质呈鲜紫红色，其它组织淡粉红色，细胞核呈浅蓝色。 2.结缔组织的染色方法 一般所说的结缔组织是指纤维性结缔组织而言，其结构特点是细胞间质内基质外含有较多的纤维成分，主要是胶原纤维、弹性纤维和网状纤维，我们仅简述这三种纤维的常见染色方法。
冰冻切片免疫荧光染色流程
冰冻切片免疫荧光染色流程(表面分子，以CD4为例) （1）冰冻切片室温晾干15分钟； （2）用组化油笔将待染组织圈好，置PBS中浸泡10分钟，以去除OCT；（3）用含10％正常山羊血清的PBS室温封闭切片1 小时（此步可以不洗涤，把封闭液吸干即可）； （4）加入CD4单抗(1:100; SeroTec, Inc, Raleigh, NC, USA)，4℃孵育过夜；（5） PBS洗3次，每次10分钟； （6）加入罗丹明标记的羊抗小鼠的IgG二抗(1:50; Sigma 公司)，37℃孵育1小时； （7） PBS洗3次，每次15分钟； （8）封片后，荧光显微镜观察结果并拍照； （9）在每切片中随机选择5个视野计数阳性细胞数。 注意事项：（1）整个实验过程中勿使表面干燥 （2）稀释、加二抗（荧光抗体）及此后的洗涤过程中注意避光 附注1：如目的分子为胞内分子，各种液体中需要加透膜剂0.3%TrixtonX100。附注2：所用液体（表面分子染色不用0.3%TrixtonX100）： （1）pH7.4 0.01MPBS： 配方为：0.1MPBS 100ml+ddH2O 900ml+NaCl 7.65g 0.1MPBS 配方为：Na2HPO4 23g+NaH2PO4﹒2H2O 5.9g+NaCl 17g 定容至2000ml, 高压， pH7.2-7.4 （2）洗涤液：0.3%TrixtonX100－pH7.4 0.01MPBS，分装15ml/支－20℃保存 （3）封闭液：10％NGS－0.3% TrixtonX100－pH7.4 0.01MPBS，分装1.2ml/支－20℃保存 （4）抗体稀释液：1％BSA－0.3% TrixtonX100－pH7.4 0.01MPBS，分装1ml/支－20℃保存
石蜡切片步骤
石蜡切片制作 大致步骤：取材、固定、洗涤和脱水、透明、浸蜡、包埋、切片和粘片、脱蜡、染色、脱水、透明、封片等步骤。 1、取材 植物材料选择时必须尽可能不损伤植物体或所需要的部分。 取材必须新鲜，尽可能割取所需要的组织块，并随即投入固定液。 取材时刀要锐利，避免因挤压细胞使其受到损伤。 切取的材料应该小而薄，便于固定剂迅速渗入内部。一般厚度不超过2mm，大小不超过5*5mm2。 2、固定 用适当的化学药液—固定液浸渍切成小块的新鲜材料，迅速凝固或沉淀细胞和组织中的物质成分、终止细胞的一切代谢过程、防止细胞自溶或组织变化，尽可能保持其活体时的结构。 固定液的选用：FAA固定液 FAA固定液配制：福尔马林（38%甲醛）5 ml 冰醋酸 5 ml 70%酒精 90 ml 5 ml甘油（丙三醇） 固定时间根据材料块的大小及松密程度而定。 3、洗涤与脱水 固定后的组织材料需要除去留在组织内的固定液及其结晶沉淀，否则会影响以后的染色效果。多数用流水冲洗：使用含有苦味酸的固定液固定的则需要用酒精多次浸洗；如果组织经酒精或酒精混合液固定，则不必洗涤，可直接进行脱水。 酒精为常用的脱水剂，为了减少组织材料的急剧收缩，应使用从低浓度到高浓度递增的顺序进行，通常从30%或50%酒精开始，经70%、85%、95%直至纯酒精（无水乙醇），每次时间为1-数小时，如不能及时进行脱水，材料可以放在70%酒精中保存，因高浓度酒精易使组织收缩硬化。 4、透明 选用二甲苯为酒精和石蜡的浸媒液，替换出组织内的酒精。通常组织先经过纯酒精和透明剂各半的混合液浸渍1-2小时，再转入纯透明剂中浸渍。时间根据材料块大小而定。 5、浸蜡与包埋 用石蜡取代透明剂，使石蜡浸入组织而起支持作用。通常把组织材料块放在熔化的石蜡和二甲苯的等量混合液浸渍1-2小时，再先后移入2个熔化的石蜡液中浸渍3小时左右，浸蜡应在高于石蜡熔点3℃左右的温箱中进行，以利于石蜡浸入组织内。浸蜡后的组织材料块放在装有蜡液的容器中（摆好在蜡中的位置），待蜡液表层凝固即迅速放入冷水中冷却，即做成含有组织块的蜡块。容器可用光亮且厚的纸折叠成纸盒或金属包埋框盒。如果包埋的组织块数量多，应进行编号，以免差错。石蜡熔化后应在蜡箱内过滤后使用，以免因含有杂质而影响切片质量，且可能损伤切片刀。 6、切片 包埋好的蜡块用刀片修成规整的四棱台，以少许热蜡液将其底部迅速贴附于小木块上，夹在轮转式切片机的蜡块钳内，使蜡块切面与切片刀刃平行，旋紧。切片刀的锐利与否、蜡块硬度适当都直接影响切片质量，可用热水或冷水等方法适当改变蜡块硬度。通常切片厚度为 4-7微米，切出一片接一片的蜡带，用毛笔轻托轻放在纸上。 7、贴片与烤片
全自动免疫组化染色机报告
全自动免疫组化染色机可代替手工操作，使染色结果更稳定，更标准，消除了多步骤人为因素的影响，可显着缩短出结果时间，可使我院的病理诊断真正做到规范化、标准化、精准化。可以对患者的早诊断、早治疗。使用免疫组化染色机可以开展更多的病理实验项目。病理科在使用全自动免疫组化染色机可在协助诊断、鉴别诊断、指导放化疗尤其在恶性肿瘤的个体化治疗——选择放化疗方案和选择靶向药物方面意义重大。根据卫生部三级综合医院评审指南，三级甲等医院必须装备全自动免疫组化染色机，如具有该设备，设备要求项可达到“A”。如我院装备全自动免疫组化染色机，将大大提升我院的免疫组化实验水平和病理诊断水平。 全自动免疫组化染色机的基本要求： 易于掌握及操作的英文或中文实验程序界面，为免疫组化标准提供了科学，可靠的平台。 主要性能 ●开放式系统，适合不同厂家抗体。从烤片、脱蜡、抗原修复、封闭、标记一抗、标记二抗、显色直到苏木素复染全程自动化。 ●适合多种标本：石蜡、冰冻、穿刺、细胞涂片、骨髓片。玻片盘对于上载的玻片无特殊的选择要求。 ●精密微量加样，滴液量可调，最少可达100ul，节约昂贵的试剂。 ●不同切片可设定不同的抗体滴液量。 ●大瓶溶液包括脱蜡液、修复液1、修复液2、酒精及清洗缓冲液。当大瓶试剂报警存量不足时，主动提示需给大瓶容器添加新试剂。每次添加新试剂前剩余的部分旧试剂也一并投入新的运行中，为了避免检测过程中出现因大瓶溶液存量不足而影响染色运行的状况，每日运行仪器前设备自动检查各溶液的仓位，确认液量足够本批次染色运行。 ●专业切片分区定位，保证最小的试剂用量发挥最大的效果，一次同时染色三十张切片。 ●用户可根据实际工作流程选择整批上载或小批次连续上载，最大限度减少等待时间，提高实验室效率。
常规组织切片染色制作中常见问题及其解决方法
常规组织切片染色制作中常见问题及其解决方法 吕俊耀1, 于晓军1, 刘卯阳2 ( 1.汕头大学医学院法医学教研室, 广东汕头515031; 2.北华大学医学院法医学教研室, 吉林吉林132003) 常规组织切片的制作过程较繁琐, 按具体制作效能分为固定、取材、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、染色、封片等九大步骤。其中脱水有12 个步骤、透明有2 个步骤、浸蜡有3 个步骤、染色有23 个步骤, 一般要经过总计40～45 个步骤, 各个实验室根据自身的实际情况及工作习惯各有不同。事实上, 从尸体储藏到切片染色的整个过程中, 任何步骤出现问题均可影响切片的质量, 因此, 要提供高质量的石蜡切片, 必须对各种潜在的影响因素严加注意, 同时, 观察组织切片时, 还应对可能出现的切片染色质量问题给予充分考虑, 以避免制片过程中的人为假象干扰而作出错误诊断。现综合有关文献及笔者的经验, 讨论常规组织切片染色制作中常见问题及其解决方法( 表1) 。 1 固定和取材 组织切片的固定剂主要为甲醛和酒精, 固定剂可与蛋白质交联结合、使之变性, 组织硬化、结构固定,此外其本身的变性物质可与染料结合, 增强着色能力。同时, 固定交联和沉淀蛋白质、脂肪、糖、酶等细胞内物质成分, 产生不同的折光率, 使得光学显微镜下易于更清晰地观察组织细胞的微细结构。 常见的与固定过程相关的组织切片染色问题及解决方法见表1。在诸多影响切片质量的因素中, 尤以固定较为重要。 1.1 减少或去除组织切片中甲醛颗粒 甲醛饱和液偏酸, 影响细胞核的染色, 特别是放置较久后, 易析出沉积在组织切片中, 呈细小的黑褐色或黄黑色颗粒物, 影响观察。以甲醛饱和液和pH7.2 的PBS 缓冲液配制的10%中性甲醛固定液( 体积比为1∶9) 应用最普遍, 效果也相对较好, 可以减少和消除甲醛颗粒。如果现场无法配制PBS 缓冲液, 可在固定溶液中加入一些普通白粉笔, 使溶液呈中性或弱碱性。甲醛颗粒易于出现在血液和血浆分布区, 以及自然腐败较重的组织, 可作为组织出血和血浆渗出指示剂。 1.2 防止组织固定不良
石蜡切片的制作过程(精)
石蜡切片的制作 目的要求:了解生物制片的基本原理和方法;了解石蜡切片制作的基本过程;学会制作石蜡切片。 一、生物制片的基本原理 (一生物制片的目的与发展概况 生物制片是研究生物有机体微观结构的基础方法,其目的是提供在显微镜下以适度的样品,有效地对其进行形态和功能观察研究。 (二生物制片的方法 当我们研究生物体的组织或细胞时,除了某些生物体可用相差显微镜或偏光显微镜等方法达到观察目的外,其余大部分生物体,因为组织较厚,光线不易透过内部等关系而达不到观察的要求,为了达到此目的,就必须将生物体的组织切成薄切片或不切片,经过一系列处理,使光线易于透过,即可进行观察。因此,根据标本的制作方法分为切片法和非切片法两种。这些方法,各有优缺点,应该适当的配合使用,才能获得比较理想的结果。 1.切片法 (1切片法的种类 切片法就是利用锐利的刀具,将器官组织或幼小个体分割成许多极薄的薄片,而制成切片标本的一种方法。切片法在切成薄片以前必须设法使组织内渗透某种支持物质。使组织保持一定的硬度,然后利用切片机进行切片。根据所用支持物质的不同切片法又可分为石蜡切片法、火棉胶切片法、冰冻切片法、炭蜡切片法等类型。现分述如下: ⅰ.石蜡切片法
石蜡切片法即用石蜡作为支持剂进行切片的方法。石蜡切片法是一般组织学、病理学等常规制片方法,因此用得最多,它有很多优点:比较省时间,容易操作,可切成极薄的切片(4um 以下,能制作连续切片,组织块可包埋在石蜡中永久保存。缺点是只能用于较小的组织块,较大的组织块不易切好,容易破碎,组织在脱水透明过程中产生收缩并易变脆。制片时间太长。 ⅱ.火棉胶切片法 火棉胶切片法是以火棉胶为支持剂进行切片的方法。此法的优点是包埋过程中不用二甲苯及石蜡,不经高温,可避免组织收缩及变脆,适于精细材料(如脑的切片,也引火棉胶有韧性切片不知有折卷或破裂,适宜于大块组织及多空洞的组织(脑、眼球,硬度较高的组织(骨、肌腱。缺点:手续麻烦、费时间,切片不能切薄,起码在10um以上,不能作连续切片,因此,在生物制片技术上已经不经常采用。 ⅲ.冰冻切片法 冰冻切片法是利用液体二氧化碳或其它药剂(如氯乙烷在变成气体时吸收大量的热使组织迅速结成冰块而后再进行切片的方法。目前国内外用半导体致冷调节器来代替二氧化碳的冰冻,冷冻速度更快更为方便。 冰冻切片法的优点是较前两种方法简便,组织不经脱水、透明、包埋等手续即可切片,因而可节省很多时间,十分钟左右即能制成切片。常用于临床病理手术诊断,银材料不经溶媒处理就可直接进行切片,材料不受试剂的激烈刺激及温度影响,所以组织没有显著的收缩,细胞形态不致有大的改变,也引冰冻切片不需有机溶剂处理,所以能保存脂肪、类脂等成分,所以冰冻切片法常用于组织化学,尤其是神经组织,临床病理学等方面的研究。 新鲜的组织或已经固定的组织,经短时间处理后即可进行切片。用任何固定及处理的材料均适合冰冻切片,但一般的经验用福尔马林固定的材料最适合冰冻切片,而用酒精、甘油保存的材料必须充分水洗后才易于冰冻,否则不易切成完整的切片
组织切片免疫荧光染色的具体步骤
组织切片免疫荧光染色的具体步骤 1 直接免疫荧光法的操作步骤 标本的处理： 石蜡切片经脱蜡、梯度酒精脱水后，进行抗原修复，然后用0.01M PBST漂洗5min × 3/次； ? 2%BSA或10%BSA 37 C湿盒内封闭30min ?抗体染色： C孵育30min；?–在标本片上滴加适当稀释的荧光标记抗体(1:8或1:16稀释)，放在湿盒中，37 ? 0.0lmol/L PBS(pH 7.4) 漂洗5min × 3/次，不时震荡(洗去多余游离的荧光素标记的抗体)。 ?缓冲甘油封片 –分析纯无荧光的甘油9份+ pH 9.2，0.2M碳酸盐缓冲液1份配制。 ?镜检：在荧光显微镜下观察。 ?优点：方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少。 ?缺点：敏感性偏低；而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。若检测多种抗原需制备多种相应的荧光标记抗体。 直接免疫荧光法的注意事项μ ?对荧光标记的抗体的稀释：要保证抗体的蛋白有一定的浓度； ?一般稀释度不应超过1:20，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。 ?染色温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化； –染色时间：从10 min到数小时，一般30 min； C的低温，延长染色时间。?C可加强染色效果，但对不耐热的抗原(如流行性乙型脑炎病毒)可采用0-2?C)，高于37?–染色温度：多采用室温(25 C 30 min效果好的多。?–低温染色过夜较37 ?试验时需设置下列对照： –自发荧光对照(空白对照)：标本加0.01mol/L，pH7.4的PBS代替一抗。 –阳性对照：用已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。 –特异性对照(抑制试验)：标本加未标记的特异性抗体，再加荧光标记的特异性抗体。 ?若标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光，阳性对照和待检标本呈强荧光，则为特异性阳性染色。 ?一般标本在高压汞灯下照射超过3min，就有荧光减弱现象； ?经荧光染色的标本最好在当天观察，随着时间的延长，荧光强度会逐渐下降。 2 间接法又称为荧光抗-抗体法 需要两种抗体参与，即一抗和二抗(荧光素标记)。一抗对标本中的抗原来说起抗体的作用，但对荧光标记的二抗来说又起着抗原作用。? –可用来检测标本中未知抗原，也可检测血清中未知抗体。 间接免疫荧光法操作步骤κ ?标本的处理及非特异染色的封闭同直接法； ?一抗染色： C过夜。?C作用30min或4?–加未标记的特异性抗体(通常1:100稀释，用0.01MpH7.4的PBS稀释)，37 ? 0.01M PBST漂洗5min×3次(震荡漂洗)； C湿盒避光作用30min。??加荧光标记的二抗抗体，37 ? 0.01M PBST避光漂洗5min×3次(例如包上锡纸，在摇床上漂洗)； ?甘油缓冲液封片 ?镜检
冰冻切片的免疫荧光
免疫荧光通用操作规程 冰冻切片的免疫荧光 1，动物组织直接OCT包埋，或灌流后的组织30%蔗糖溶液4℃过夜后，OCT包埋。-20℃保存3月，-80℃长期保存。请勿保存于液氮。 2，冰冻切片机切片至少10um，空气干燥2分钟后，-20℃储存 3，切片从-20取出后，在通风橱放10-30分钟以去除水汽，4%PFA固定15分钟，或-20℃丙酮固定15分钟置通风橱2小时 4, 1XPBS清洗玻片，3X5min 从此请保持玻片湿润 5，有时，抗原修复3小时会得到更好的结果。为此请：选用稳定的抗原修复方式（真空负压.微波修复.高压修复.隔水加热.电炉加热）…关注修复的温度，时间（抗原修复时在有效的温度范围内所持续的时间），抗原修复液必须遵循自然降温规律，使用足量的抗原修复液…选择不同PH值的修复液（A液枸盐酸缓冲液PH6.0，B液EDTA-Na缓冲液PH8.0，C液枸盐酸缓冲液PH4.5）
6，室温封闭1小时 封闭液：5%BSA+10%二抗种属来源的正常血清in 1xPBS 条件封闭液：1%BSA+3%二抗种属来源的正常血清in 1xPBS（细胞因子，无需封闭的蛋白 7，一抗4℃过夜 请用封闭液稀释一抗 8, 第二天Wash,1XPBS, 2x1min 9,二抗，1:1000 （alexa系列）1:300（dyelight )in封闭液，避光室温1小时 10, Wash,1XPBS, 3x5min 11, DAPI 染核5min， 12，DDW Rinse 13，抗淬灭剂封片，（避免气泡）避光置于通风橱过夜 14，干片后4℃保存 石蜡切片的免疫荧光 1，动物组织取出后经固定-脱水-包埋（见随后操作步骤)，制成石蜡包块 2，组织学染色切片厚度2um，免疫荧光染色切片厚度至少6um，切片复水：58℃20min-
石蜡切片技术实验报告
题目：石蜡切片技术实验报告 学院：农学院，专业：植物学，姓名：张永丰，学号：2011202010目的 掌握石蜡切片技术，为以后的科研中切出合格的实验装片做准备。并观察植物叶的横切面内部结构。 材料：已经固定好的女贞叶 方法与操作步骤 一、脱水：依次使用下列浓度的乙醇脱水 50%乙醇一70%乙醇一85%乙醇一95%乙醇一100%乙醇一100%乙醇每步两个小时。 二、透明：依次通过下列试剂进行透明 1、1/2无水乙醇1/2二甲苯（加少许番红粉末，对材料进行附染）两个小时 2、二甲苯两个小时 3、二甲苯一个小时 三、浸蜡：浸蜡步骤如下 1、将材料瓶中的二甲苯取出1/2,加入剩余二甲苯的体积3/2倍的石蜡液于36C 温 箱中处理35小时 2、换用纯石蜡液于60 T温箱中处理2小时，再换一次纯石蜡液处理2小时 四、包埋与切片 1、在提前准备好的纸盒中放入少量蜡液。 2、片刻后放入材料，避免形成断层还要注意材料摆放的位置和方向。 3、及时将蜡块冷却，防治形成结晶。 4、修块与粘连：将多余的石蜡切除，使蜡块成为梯形；将蜡块一正确的方向粘连 在枕木上。 5、切片：利用切片机将蜡块切成薄片。切片厚度为8?10卩m,以每分钟40? 50转为宜。 6、粘片与展片：在载玻片上滴一滴黏贴剂和一滴蒸馏水用牙签涂匀，将蜡带光面 朝下固定于载玻片上，放到展片台上经加温使其充分展开。 7、干燥：将展好的片放于36 E温箱中干燥16小时 五、脱蜡：切片分别经过下列步骤进行脱蜡 二甲苯30min 1/2二甲苯1/2无水乙醇5min无水乙醇5min 95%乙醇5min 85%乙醇5min 70%乙醇5min 六、染色：染色分为番红染色和固绿染色两步 1、番红染色：将载玻片放入盛有番红染液（1%番红，70%乙醇）的染缸中染色 22小时 2、固绿复染：载玻片依次经过一下处理 70% 1min 85% 1min 95% 1min 固绿染液（0.1%固绿，95%L醇）20 秒 3、脱水：95% 1min 100% 1min 100%1min 4、透明：1/2二甲苯1/2无水乙醇1min二甲苯1min二甲苯 七、封片 中性树胶封片，干燥 八、镜检
石蜡切片步骤
石蜡切片基本步骤 （一）取材和固定 根据实验目的选择材料。将整个虫体或虫体的内部器官（如肠道、马氏管、唾液腺等）取出后，立即投入固定液。 取材大小：0.5cm×0.5 cm×0.2或者1.0 cm×1.0 cm×0.2，厚度不宜超过3mm。 固定液：2.5%的戊二醛固定液，Bouin氏液，10%甲醛等。 固定时间：4oC固定24小时。 注意事项： 取材：1．勿使组织块受挤压切取组织块所用刀、剪要锋利，切割时不可来回切割。夹取组织时，镊子要轻，切勿挤压，以免损伤组织。取材时，组织块可稍大一点，以便在固定后，将组织块的不平整部分修去。 2.选好组织块的切面应熟悉器官组织的组成，并根据观察目的来确定纵切或横切。 3．保持材料的清洁组织块上如有血液、污物、粘液、食物等，先用生理盐水冲洗干净，再入固定液。 4．切除（清除）不需要的部分特别是组织周围的脂肪等，应尽可能清除掉，以免影响以后的程序和观察。 固定：1．材料新鲜取出组织后须立即固定。否则时间相隔过久，体积就要收缩变形或发生自溶现象。 2．抽气生物组织常有气体的存在，使材料不能沉入固定液中，抽气使得固定液有效渗入。真空泵抽气或者用空针管抽气。昆虫整体固定，固定前用解剖针刺数个小孔，以利用固定液渗透。 3．固定剂用量一般为组织体积的10~20倍。勿使组织贴于瓶底或瓶壁，以免影响固定剂的渗入。 4．避免阳光尽可能避免接触阳光以免失去固定作用。 5．加速固定轻轻摇动盛器使组织移动有利于固定液渗入，对长期固定的标本可经常更换固定液。
（二）洗涤 2.5%戊二醛固定液固定的组织：0.2M, pH7.2磷酸缓冲液漂洗三次，每次10min Bouin氏固定液固定的组织：直接入70%酒精更换数次即可脱水，注意苦味酸。 甲醛固定的组织：直接投入50%或70%酒精脱水，不经水洗。但如果在甲醛中时间过长，则仍应当用流水冲洗。 陈旧性标本和混合性固定液应及时洗涤，有利于脱水、切片和染色。否则会影响以后的染色效果。 （三）脱水与透明 漂洗后即入酒精脱水，经50%，70%，80%，90%，95%，100%酒精脱水，其中95%，100%酒精需重复两次。每级10min。 脱水后，入1/3二甲苯+2/3乙醇混合液→1/2二甲苯+1/2乙醇混合液→2/3二甲苯+1/3乙醇混合液→二甲苯→二甲苯，每次约10min，至组织透明为止。 注意： 1. 一般经水洗的材料脱水可从35%开始，柔弱的材料从15%开始，若用酒精洗涤，则可直接移入50%或70%酒精中继续脱水。 2. 每级脱水时间，依照材料的大小、性质以及留在固定液中的时间长短和固定液的溶解性而定。动物组织每级10~30min。 3. 脱水应彻底，否则与二甲苯混合后混浊，必须倒回重脱水且效果不好；如需过夜，则停留在70%酒精中。 （四）透蜡 透明后，先把组织材料块放在熔化的石蜡和二甲苯的等量混合液浸渍3小时，再先后移入2个熔化的石蜡液中浸渍6小时左右，直至用石蜡完全置换了组织块中的二甲苯，浸蜡应在高于石蜡熔点3℃左右（60°C）的温箱中进行，以利石蜡浸入组织内。便于今后的包理与切片。