阐述基因工程克隆及表达的基本流程
定义：
按照预先设计好的蓝图，利用现代分子生物学技术，特别是酶学技术，对遗传物质DNA 直接进行体外重组操作与改造，将一种生物（供体）的基因转移到另外一种生物（受体）中去，从而实现受体生物的定向改造与改良。
基本步骤：(分、切、接、转、增、检）
施工材料的准备：目的基因、载体、工具酶和受体细胞（宿主）的准备。用限制性内切酶分别将外源DNA和载体分子切开。
目的基因与载体DNA的体外重组，形成重组DNA分子。
基因工程基本过程
基因工程基本过程 基因工程（genetic engineering），也叫基因操作、遗传工程，或重组体DNA 技术。它是一项将生物的某个基因通过基因载体运送到另一种生物的活性细胞中，并使之无性繁殖（称之为"克隆"）和行使正常功能（称之为"表达"），从而创造生物新品种或新物种的遗传学技术。一般说来，基因工程是专指用生物化学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工合成的DNA片段）与载体系统（病毒、细菌质粒或噬菌体）的DNA 结合成一个复制子。这样形成的杂合分子可以在复制子所在的宿主生物或细胞中复制，继而通过转化或转染宿主细胞、生长和筛选转化子，无性繁殖使之成为克隆。然后直接利用转化子，或者将克隆的分子自转化子分离后再导入适当的表达体系，使重组基因在细胞内表达，产生特定的基因产物。 常用的工具酶 限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割 DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化 核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接 核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成 核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割 核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰 其它酶类--用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。 主要过程有为四步： 一．获得目的基因 有多种方法可获得目得基因 1.构建cDNA文库分离目的基因 过程： （1）从真核细胞中提取mRNA，以其为模板，在反转录酶的作用下合成cDNA的第一条链。 （2）以第一条链为模板，以反转录酶或DNA聚合酶Ｉ作用下合成cDNA的第二条链。 （3）在甲基化酶作用下使cDNA甲基化。
（4）接头或衔接子连接。 （5）凝胶过滤分离cDNA。 （6）通过核酸探针法或免疫反应法从cDNA文库中分离特异cDNA克隆。 2.人工化学合成法 适于已知的核苷酸序列且校小的ＤＮＡ片断合成，常用方法有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法、固相合成法、自动化合成法等。 过程：先用以上方法合成基因DNA不同部位的两条链的寡核苷短片段，再退火成为两端形成粘性末端的DNA双链片段。然后将这些DNA片段按正确的次序进行退火连接起来形较长的ＤＮＡ片段，再用连接酶连接成完整的基因。 3.利用PCR技术直接扩增目的基因 PCR（Polymerase Chain Reaction）法，又称为聚合酶链反应或PCR扩增技术，已知待扩增目的基因或DNA片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必需的双引物，类似于DNA的天然复制过程，用ＰＣＲ法进行扩增，特异地合成目的cDNA链，用于重组、克隆。 二．载体的选择与制备 1.载体的选择（以质粒为例） ⑴载体必须是复制子。 ⑵具有合适的筛选标记，便于重组子的筛选。 ⑶具备多克隆位点（MCS），便于外源基因插入。 ⑷自身分子量较小，拷贝数高。 ⑸在宿主细胞内稳定性高。 (6)应具有很强的启动子，能为大肠杆菌的RNA聚合酶所识别 (7)应具有阻遏子，使启动子受到控制，只有当诱导时才能进行转录。 (8)应具有很强的终止子，以便使RNA聚合酶集中力量转录克隆的外源基因，而不转录其他无关的基因，且所产生的mRNA较为稳定。 (9)所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号。 2.制备有多种分离质粒的方法，如碱裂解法、煮沸裂解法、层析柱过滤法等。 目前一般使用碱变性法制备质粒DNA。这个方法主要包括培养收集细菌菌体，裂解细胞，将质粒DNA与染色体DNA分开及除去蛋白质和RNA。
2020高考生物二轮复习基因工程与克隆技术学前诊断
【2019最新】精选高考生物二轮复习基因工程与克隆技术学前诊断 分子β肽链第6位氨基酸谷氨酸被缬氨酸代替，导致功能异常。回答下列问题： (1)异常血红蛋白的氨基酸序列改变的根本原因是编码血红蛋白基因的__________序列发生改变。 (2)将正常的血红蛋白基因导入患者的骨髓造血干细胞中，可以合成正常的血红蛋白达到治疗的目的。此操作________(填“属于”或“不属于”)蛋白质工程，理由是该操作________________________。 (3)用基因工程方法制备血红蛋白时，可先提取早期红细胞中的____________，以其作为模板，在______________酶的作用下反转录合成cDNA。cDNA与载体需在____________________酶的作用下，拼接构建基因表达载体，导入受体菌后进行表达。 (4)检测受体菌是否已合成血红蛋白，可从受体菌中提取________，用相应的抗体进行__________杂交，若出现杂交带，则表明该受体菌已合成血红蛋白。 解析：(1)基因是具有遗传效应的DNA片段，遗传信息储存在基因碱基对的排列顺序中。(2)蛋白质工程是指通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求，故题中所述不属于蛋白质工程。(3)利用逆转录法获取目的基因时，需先提取mRNA，在逆转录酶的作用下逆转录合成cDNA。cDNA与载体需要在限制酶和DNA连接酶的作用下拼接构建成基因表达载体，才可导入受体菌。(4)检测目的基因是否翻译成蛋白质，需要从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交。 答案：(1)碱基对(2)不属于没有对现有的蛋白质进行改造(3)mRNA 逆转录限制酶和DNA连接(4)蛋白质抗原—抗体 2．下图是科学家利用大肠杆菌生产人胰岛素的部分过程。请结合相关知识回答
基因克隆及转基因方法
基因克隆及转基因 一、基因克隆及转基因过程 1、设计引物 软件是https://www.360docs.net/doc/0f2735668.html,sergene.v7.1，用到里面的PrimerSelect和EditSeq。 一般原则：1、长度：18-25； 2、GC含量：40-60％，正反向引物相差不要大于5%； 3、Tm值：55以上（到65），实在不行50以上也可以，正反向引物相差不要大 于5； 4、3’端结尾最好是GC，其次是T，不要A； 5、正反向引物连续配对数小于4； 6、在NCBI上的Primer Blast上看引物特异性如何； （如果克隆的话不能满足条件也没办法。） 不是必须条件，但可以考虑：多个基因设计引物时，可尽量使Tm值相似，方便PCR。 步骤： 一、打开PrimerSelect和EditSeq。 二、在EditSeq中输入你的序列。 引物有一对F和R 1、对于F是从5’到3’，在序列的前部分选择长度为18-25bp的碱基，如果你是要验证就随便选，如果你是要克隆就在最开始选，不符合原则就只能在你选的后边增或减碱基。 2、将选择的F引物输入到PrimerSelect中，在File中选择Enter New Primer，复制，OK，然后可以看到引物的情况，看看长度、Tm、GC含量是不是符合标准，不符合就继续选。 3、对于R是从3’到5’，选中序列，在EditSeq的Goodies中选择第一个“反向互补”，此时序列已反向互补，按照前面F的方法搜索R的引物。、 4、注意你想要的目的带的大小，比如序列是1000bp，你想PCR出来800大小的目的带，那就要看看F和R之间的长度在你想要的范围内。可以将R反向互补，在正向的序列中搜索R在的位置，就是在EditSeq中选择Search，点击第一个Find，开始搜寻。 5、搜索完引物在PrimerSelec中的Report中选择前两个查看二聚体情况。 6、在NCBI上的Primer Blast上看引物特异性如何。 7、因为是克隆，所以引物要有酶切位点，酶切位点的加入主要考虑所用到的表达载体，在NEBcutter网站中输入总序列查看可用的酶切位点。在引物上游加入酶切位点，注意加入时载体的表达的方向，前面的酶切位点在引物F上，后面的酶切位点在引物R上。一般在引物上游还要加上两个保护碱基。 2、提取醋栗DNA 3、PCR扩增与目的基因回收 PCR先找合适的退火温度，找到后回收时就可以多PCR几管，一般我们用20ul的体系，PCR5管就可以回收，就是琼脂糖凝胶回收，将目的基因用刀片切下来，用试剂盒回收。回收完可以再跑电泳检测一遍。 PCR： 20ul体系：灭菌水13.8ul，若模板为质粒灭菌水14.3ul； 2.5mMdNTP2.0ul；
(完整版)高中生物选修3第一章基因工程习题及答案
高中生物选修3第一章基因工程习题 1. SARS 病毒能引起非典型肺炎，医生在治疗实践中发现，非典病人治愈后，其血清可用于 治疗其他非典病人。有三位科学家分别从三个不同的方面进行了研究，其研究的方向如下图 所示。请根据下图回答： SARS 病毒 [丙的研究] 抽取血清 蛋白质X [乙的研究] 注射 注射 灭活或 培养 非典病人B 治愈的病人B 非典病人D 减毒处理 动物实验 健康人C 健康人C 健康人C 治愈的病人D （1）从免疫学的角度看，SARS 病毒对于人来讲属于 ，治愈的病人A 的血清中因 为含有 ，所以可用来治疗“非典”病人B 。 （2）甲的研究中，所合成或生产的蛋白质X 是 ，它可以通过化学的方法合成，也 可以通过生物学方法—— 技术生产。 （3）乙的研究目的主要是制造出 以保护易感人群。图中使健康人C 获 得抵抗“非典”病毒能力的过程，属于免疫学应用中的 免疫。 （4）图中丙主要研究不同国家和地区SARS 病毒的异同，再按照免疫学原理，为研究一种 或多种 提供科学依据。 2. 聚合酶链式反应(PCR 技术)是在实验室中以少量样品DNA 制备大量DNA 的生化技术， 反应系统中包括微量样品DNA 、DNA 聚合酶、引物、足量的4种脱氧核苷酸及ATP 等。 反应中新合成的DNA 又可以作为下一轮反应的模板，故DNA 数以指数方式扩增，其简要 过程如右图所示。 （1）某个DNA 样品有1000个脱氧核苷酸，已知它的一条单链上碱基A:G:T:C=1:2:3:4，则 经过PCR 仪五次循环后，将产生 个DNA 分子，其中需要提供胸腺嘧啶脱氧核苷酸的 数量至少是 个。 （2）分别以不同生物的DNA 样品为模板合成的各个新DNA 之间存在差异，这些差异是 。 （3）请指出PCR 技术与转录过程的三个不同之处： ① 。 ② 。 ③ 。 3. 逆转录病毒的遗传物质RNA 能逆转录生成DNA ，并进一步整合到宿主细胞的某条染色 体中。用逆转录病毒作为运载体可用于基因治疗和培育转基因动物等。 （1）病毒在无生命培养基上不能生长，必须依靠活细胞提供 循环重复 [甲的研究] 用激素等治疗 非典病人A 治愈的病人A 健康人合成或生产 其他辅助治疗 接种 提纯、
基因工程主要内容及流程
基因工程制药 姓名：惠霞 学号：2011506024 班级：2011级生技1 班
基因工程制药 一．基因工程制药常用的工具酶： 基因工程的重要特点之—是在体外实行DNA分子的切割和重新连接。例如要取得所需药物之目的基因并要将此特定目的基因与载体DNA连接在—起，在很大程度上要依赖于某些工具酶。 (一) 限制酶(Restriction enzymes) 限制酶即限制性核酸切酶的简称，是一类专一性很强的核酸切酶。与一般的DNA水解酶不同之处在于它们对碱基作用的专一性上及对磷酸二酯键的断裂方式上具有一些特殊的性质。限制酶的种类 Ⅰ型酶：早期提取的酶类，是一类复杂的多功能酶，在基因工程上的应用价值不大。 Ⅱ型酶：相对分子质量较小，为20000～100000，是简单的单功能酶，作用时无需辅助因子或只需Mg2＋。能识别双链DNA上特异的核苷酸序列，底物作用的专一性强，而且其识别序列与切断序列相一致。这类酶对基因工程中的生化操作特别重要。 (二) DNA聚合酶(DNA polymerase) DNA聚合酶是能够催化DNA复制和修复DNA分子损伤的一类酶，这类酶作用时大多数需要DNA模板并且优先作用于DNA模板，也可作用于RNA模板，但效率较低。 1．大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ 2. 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ大片断Klenow 片断 3. T4噬菌体DNA聚合酶 4. 经修饰的T7噬菌体DNA聚合酶（测序酶） 5. T aqDNA聚合酶及AmpiTaqTMDNA聚合酶 6. 反转录酶
（三）DNA连接酶（DNA ligase）：能将两段DNA拼接起来的酶。 1. T4噬菌体DNA连接酶：催化DNA的5'羟基之间形成磷酸二酯键。 2. 大肠杆菌DNA连接酶：用途较窄，不常用。 （四）基因工程中常用的其他酶 1. 末端脱氧核苷酸转移酶（末端转移酶或TDT酶） 2. T4噬菌体多核苷酸酶 3. 核酸酶（Nuclease） 4. 碱性磷酸酯酶（Alkaline phosphodiesterase）：能催化去除单链或双链DNA和RNA 分子中的5' 磷酸基（脱磷酸作用）。分为细菌碱性磷酸酯酶（BAP），牛小肠碱性磷酸酯酶（CIP）。 二．基因工程制药中常用的克隆载体 载体：能在细胞进行自我复制的DNA分子就是外源DNA片段（基因）的运载体（Vector）,又可称为分子载体或无性繁殖载体。基因工程制药中常用的目的基因克隆载体主要有：质粒、λ噬菌体、M13噬菌体和粘粒。 （一）质粒 1.质粒（Plasmid）是一些存在于微生物细胞染色体外的闭合环状双链的小型DNA分子，是能进行独立复制并保持恒定遗传的辅助性遗传单位。 2 常用的几种质粒载体 （1）pBR322及其衍生载体 pBR322 最早构建成功的较理想载体，分子质量2.6×106u，4.36kb，属松弛型复制，含有两个抗性基因（Tetr和Ampr），已确定32个限制酶切割位点的相对位置。BamH I
基因克隆载体上的各种常用蛋白标签
基因克隆载体上的各种常用蛋白标签 蛋白标签(proteintag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化等。随着技术的不断发展，研究人员相继开发出了具有各种不同功能的蛋白标签。目前，这些蛋白标签已在基础研究和商业化产品生产等方面得到了广泛的应用。 美国GeneCopoeia(复能基因)为客户提供50多种蛋白标签，可以满足客户的不同需求，包括各种最新型的标签，如：SNAP-Tag?、Halo Tag?、AviTag?、Sumo等;也提供齐全的各种常用标签，如eGFP、His、Flag等等标签。 以下是部分蛋白标签的特性介绍，更加详细的介绍可在查询产品的结果列表里面看到各种推荐的蛋白标签和载体。 TrxHIS His6是指六个组氨酸残基组成的融合标签，可插入在目的蛋白的C末端或N末端。当某一个标签的使用，一是能构成表位利于纯化和检测;二是构成独特的结构特征(结合配体)利于纯化。组氨酸残基侧链与固态的镍有强烈的吸引力，可用于固定化金属螯合层析(IMAC)，对重组蛋白进行分离纯化。使用His-tag有下面优点： 标签的量小，只有~0.84KD，而GST和蛋白A分别为~26KD和~30KD，一般不影响目标蛋白的功能; His标签融合蛋白可以在非离子型表面活性剂存在的条件下或变性条件下纯化，前者在纯化疏水性强的蛋白得到应用，后者在纯化包涵体蛋白时特别有用，用高浓度的变性剂溶解后通过金属螯和去除杂蛋白，使复性不受其它蛋白的干扰，或进行金属螯和亲和层析复性; His标签融合蛋白也被用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA相互作用研究; His标签免疫原性相对较低，可将纯化的蛋白直接注射动物进行免疫并制备抗体。 可应用于多种表达系统，纯化的条件温和; 可以和其它的亲和标签一起构建双亲和标签。 Flag标签蛋白 Flag标签蛋白为编码8个氨基酸的亲水性多肽(DYKDDDDK)，同时载体中构建的Kozak序列使得带有FLAG的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。FLAG作为标签蛋白，其融合表达目的蛋白后具有以下优点： FLAG作为融合表达标签，其通常不会与目的蛋白相互作用并且通常不会影响目的蛋白的功能、性质，这样就有利用研究人员对融合蛋白进行下游研究。 融合FLAG的目的蛋白，可以直接通过FLAG进行亲和层析，此层析为非变性纯化，可以纯化有活性的融合蛋白，并且纯化效率高。 FLAG作为标签蛋白，其可以被抗FLAG的抗体识别，这样就方便通过Western Blot、ELISA等方法对含有FLAG的融合蛋白进行检测、鉴定。
高中生物选修3第一章基因工程习题及答案word版本
第Ⅱ卷非选择题 三．非选择题： 29．（7分）SARS 病毒能引起非典型肺炎，医生在治疗实践中发现，非典病人治愈后，其血清可用于治疗其他非典病人。有三位科学家分别从三个不同的方面进行了研究，其研究的方向如下图所示。请根据下图回答： SARS 病毒 [丙的研究] 抽取血清 蛋白质X [乙的研究] 注射 注射 灭活或 培养 非典病人B 治愈的病人B 非典病人D 减毒处理 动物实验 健康人C 健康人C 健康人C 治愈的病人D （1）从免疫学的角度看，SARS 病毒对于人来讲属于 ，治愈的病人A 的血清中因为含有 ，所以可用来治疗“非典”病人B 。 （2）甲的研究中，所合成或生产的蛋白质X 是 ，它可以通过化学的方法合成，也可以通过生物学方法—— 技术生产。 （3）乙的研究目的主要是制造出 以保护易感人群。图中使健康人C 获得抵抗“非典”病毒能力的过程，属于免疫学应用中的 免疫。 （4）图中丙主要研究不同国家和地区SARS 病毒的异同，再按照免疫学原理，为研究一种或多种 提供科学依据。 30．（8分）聚合酶链式反应(PCR 技术)是在实验室中以少量样品DNA 制备大量DNA 的生化技术，反应系统中包括微量样品DNA 、DNA 聚合酶、引物、足量的4种脱氧核苷酸及ATP 等。反应中新合成的DNA 又可以作为下一轮反应的模板，故DNA 数以指数方式扩增，其简要过程如右图所示。 （1）某个DNA 样品有1000个脱氧核苷酸，已知它的一条单链上碱基A:G:T:C=1:2:3:4，则经过PCR 仪五次循环后，将产生 个DNA 分子，其中需要提供胸腺嘧啶脱氧核苷酸的数量至少是 个。 （2）分别以不同生物的DNA 样品为模板合成的各个新DNA 之间存在差异，这些差异是 。 （3）请指出PCR 技术与转录过程的三个不同之处： ① 。 ② 。 循环重复 [甲的研究] 用激素等治疗 非典病人A 治愈的病人A 健康人合成或生产 其他辅助治疗 接种 提纯、
2017届高考生物二轮复习基因工程与克隆技术学前诊断
“基因工程与克隆技术”学前诊断 考点一基因工程与蛋白质工程 β肽链第6位氨基酸谷氨酸被缬氨酸代替，导致功能异常。回答下列问题： (1)异常血红蛋白的氨基酸序列改变的根本原因是编码血红蛋白基因的__________序列发生改变。 (2)将正常的血红蛋白基因导入患者的骨髓造血干细胞中，可以合成正常的血红蛋白达到治疗的目的。此操作________(填“属于”或“不属于”)蛋白质工程，理由是该操作________________________。 (3)用基因工程方法制备血红蛋白时，可先提取早期红细胞中的____________，以其作为模板，在______________酶的作用下反转录合成cDNA。cDNA与载体需在____________________酶的作用下，拼接构建基因表达载体，导入受体菌后进行表达。 (4)检测受体菌是否已合成血红蛋白，可从受体菌中提取________，用相应的抗体进行__________杂交，若出现杂交带，则表明该受体菌已合成血红蛋白。 解析：(1)基因是具有遗传效应的DNA片段，遗传信息储存在基因碱基对的排列顺序中。 (2)蛋白质工程是指通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求，故题中所述不属于蛋白质工程。(3)利用逆转录法获取目的基因时，需先提取mRNA，在逆转录酶的作用下逆转录合成cDNA。cDNA与载体需要在限制酶和DNA连接酶的作用下拼接构建成基因表达载体，才可导入受体菌。(4)检测目的基因是否翻译成蛋白质，需要从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交。 答案：(1)碱基对(2)不属于没有对现有的蛋白质进行改造(3)mRNA 逆转录限制酶和DNA连接(4)蛋白质抗原—抗体 2．下图是科学家利用大肠杆菌生产人胰岛素的部分过程。请结合相关知识回答问题： (1)除图示方法获得目的基因(人胰岛素基因)外，还可通过__________的方法获得目的基因。 (2)图示所获得的人胰岛素基因在大肠杆菌中不能表达，需要质粒为其提供________________等调控因子；质粒含有一个或多个__________切割位点，供目的基因插入
基因工程知识点全
第一章基因工程概述 1?什么是基因工程，基因工程的基本流程？ 基因工程（Genetic engineering ）原称遗传工程。从狭义上讲，基因工程是指将一种或多 种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿遗传并表达出新的性状。因此，供体、受体和载体称为基因工程的三大 要素。 1. 分离目的基因 2?限制酶切目的基因与载体 3. 目的基因和载体DNA在体外连接 4?将重组DNA分子转入合适的宿主细胞，进行扩增培养 5. 选择、筛选含目的基因的克隆 6. 培养、观察目的基因的表达 第二章基因工程的载体和工具酶 1. 基因工程载体必须满足哪些基本条件？ 具有对受体细胞的可转移性或亲和性。 具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点。 具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点。 具有合适的筛选标记。 分子量小，拷贝数多。具有安全性。 2. 质粒载体有什么特征，有哪些主要类型？ 1、自主复制性 2、可扩增性 3、可转移性 4、不相容性 主要类型有1.克隆质粒2.测序质粒3.整合质粒4.穿梭质粒5.探针质粒6.表达质粒 3. 质粒的构建 （1）删除不必要的DNA区域，尽量缩小质粒的分子量，以提高外源DNA片段的装载量。一般来说，大于20Kb的质粒很难导入受体细胞，而且极不稳定。 （2）灭活某些质粒的编码基因，如促进质粒在细菌种间转移的mob基因，杜绝重组质粒扩 散污染环境，保证DNA重组实验的安全，同时灭活那些对质粒复制产生负调控效应的基因，提高质粒的拷贝数 （3 ）加入易于识别的选择标记基因，最好是双重或多重标记，便于检测含有重组质粒的受体细胞。（4）在选择性标记基因内引入具有多种限制性内切酶识别及切割位点的DNA序列，即多 克隆接头（Polylinker ），便于多种外源基因的重组，同时删除重复的酶切位点，使其单一化，以便环状质粒分子经酶处理后，只在一处断裂，保证外源基因的准确插入。 （5 ）根据外源基因克隆的不同要求，分别加装特殊的基因表达调控元件。 4. 什么是人工染色体载体？ 将细菌接合因子、酵母或人类染色体上的复制区、分配区、稳定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体 5. 什么是穿梭载体？ 人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存活和 复制的载体。 6. 入-噬菌体载体及构建 hDNA为线状双链DNA分子，长度为48.5kb，在分子两端各有12个碱基的单链互补粘性末端。 1缩短长度提高外源DNA片段的有效装载量删除重复的酶切位点 引入单一的多酶切位点接头序列，增加外源DNA片段克隆的可操作性 灭活某些与裂解周期有关基因。 使入-DNA载体只能在特殊的实验条件下感染裂解宿主细菌，以避免可能出现的污染现 象的发生。加装选择标记，便于重组体的检测 7. M13单链噬菌体DNA载体
基因工程的基本内容
基因工程的基本内容 基因工程的基本内容一.本周教学内容：基因工程的基本内容二.学习内容：本周学习基因工程的操作过程，指导进行基因工程操作时需要的基本工具：限制酶、连接酶、运载体，了解他们的特点，及其在基因工程中的应用。理解基因工程操作的基本步骤，理解如何提取目的基因，怎样将目的基因导入受体细胞，怎样鉴定试验的成果等等。基因工程的基本内容 一. 本周教学内容： 基因工程的基本内容 二.学习内容： 本周学习基因工程的操作过程，指导进行基因工程操作时需要的基本工具：限制酶、连接酶、运载体，了解他们的特点，及其在基因工程中的应用。理解基因工程操作的基本步骤，理解如何提取目的基因，怎样将目的基因导入受体细胞，怎样鉴定试验的成果等等。了解基因工程对现代社会的贡献及基因工程应用的发展。 三. 学习重点： 1. 基因工程的概念 2. 基因工程的操作工具 3. 运载体的基本条件 4. 基因工程的基本操作步骤
5. 基因工程的应用和发展 四. 学习难点： 1. 基因工程工具：限制酶、运载体 2. 运载体的基本要求 3. 基因工程的操作步骤 4. 如何检测基因操作 5. 基因工程应用的两面性 五. 学习过程： （一）概念：基因工程——又叫基因拼接技术或DNA重组技术。 是指在生物体外，通过对DNA分子进行人工“剪切”和“拼接”，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞内进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内表达，产生出人类所需要的基因产物。 概念要点： 1. 在DNA分子水平上进行设计操作的 2. 在生物体外实现的基因改造 3. 对受体细胞进行无性繁殖 4. 重组基因最终表达获得性状 （二）基因操作的工具 1. 抗虫棉的培育：将抗虫的基因从某种生物（如苏云金芽孢杆菌）中提取出来，“插入”到棉花的细胞中，及棉细胞
基因工程与克隆技术
基因工程与克隆技术 考点1 基因工程 1.(2015·浙江10月选考,节选)从扩大培养的大肠杆菌中提取含有目的基因的DNA,用 分别切割含目的 基因的DNA 和农杆菌的Ti 质粒,然后用DNA 连接酶连接,形成重组DNA 并导入农杆菌。 2.(2016·浙江4月选考,节选)兔肝细胞中的基因E 编码代谢甲醛的酶,拟利用基因工程技术将基因E 转入矮牵牛中,以提高矮牵牛对甲醛的代谢能力。请回答: (1)从兔肝细胞中提取mRNA,在 酶的作用下形成互补DNA,然后以此DNA 为模板扩增得到基因E 。在相关酶的作用下,将基因E 与Ti 质粒连接在一起,形成 ,再导入用氯化钙处理的 ,侵染矮牵牛叶片,将被侵染的叶片除菌后进行培养,最终得到转基因矮牵牛。其中培养过程正确的是 (A.叶片在含合适浓度生长素的培养基上分化形成愈伤组织 B.愈伤组织在含细胞分裂素和生长素配比较高的培养基上形成芽 C.再生的芽在细胞分裂素含量高的培养基 上生根 D.愈伤组织在含合适浓度植物生长调节剂的培养基上脱分化形成再生植株)。 (2)取转基因矮牵牛叶片,放入含MS 液体培养基和适量浓度甲醛且密封的试管中。将试管置于 上,进行液体悬浮培 养。一段时间后测定培养基中甲醛的含量,以判断基因E 是否在转基因矮牵牛中正常表达。培养过程中液体培养基的作用: 一是提供营养;二是 ,从而使叶片保持正常的形态。 3.(2018·浙江4月选考,节选)回答与基因工程和植物克隆有关的问题: (1)将含某抗虫基因的载体和含卡那霉素抗性基因的载体pBI121均用限制性核酸内切酶EcoR Ⅰ酶切,在切口处形成 。选取含抗虫基因的DNA 片段与切割后的pBI121用DNA 连接酶连接,在两个片段相邻处形成 ,获得重组质粒。 (2)已知用CaCl 2处理细菌,会改变其某些生理状态。取CaCl 2处理过的农杆菌与重组质粒在离心管内进行混合等操作,使重组质粒进入农杆菌,完成 实验。在离心管中加入液体培养基,置于摇床慢速培养一段时间,其目的是 , 从而表达卡那霉素抗性基因,并大量增殖。 【考点梳理】 1.基因工程的工具 2.基因工程的原理与操作步骤 (1)基因工程的原理 ①基本原理:让人们感兴趣的基因(即目的基因)在宿主细胞中稳 定和高效地表达。 ②基本要素:多种工具酶、目的基因、载体和宿主细胞等。 (2)基因工程的基本操作步骤 3.形成重组DNA 分子 (1)单酶切法（如右图）：将同一种限制性核酸内切酶切割的质粒与目的基因片 段混合,加入DNA 连接酶,两两连接的产物(重组DNA 分子)有以下3种:目的基因与目的基因的连接物;质粒与质粒的连接物;目的基因与质粒的连接物。其中,只有目的基因与质粒的连接物才是真正需要的。 (2)双酶切法
DNA结构与复制中的相关计算的三种常用方法
DNA结构与复制中的相关计算的三种常用方法 一、特值法： 先按照碱基比例假设DNA片段中碱基总数为100或200等整百数，再根据碱基互补配对原则（A－T，C－G）图解分析求解。 例：一个DNA分子中，G和C之和占全部碱基数的46％，又知在该DNA分子的一条链中，A和C分别占碱基数的28％和22％，则该DNA分子的另一条链中A和C分别占碱基数的（）。 A．28％、22％B．22％、28％C．23％、27％D．26％、24％ 【解析】假设DNA每条链的碱基数为100，依题意得：（图略） ∵甲链: A=28, C=22,G+C=46, ∴甲中G=24, T=100-28-46=26。则乙中A=26，C=24。故选D。 练习：分析某生物的双链DNA，发现腺嘌呤与胸腺嘧啶之和占全部碱基的64％，其中一条链上的腺嘌呤占该链全部碱基的30％，则对应链中腺嘌呤占整个DNA分子碱基的比例是（） A．17％B．32％C．34％D．50％
二、首尾法： 根据DNA复制的过程与特点可以知道：一DNA分子复制n次后，将得到2n个DNA分子，其中保留原来母链的DNA 数目为2个。在处理与此相关的计算题过程中，我们只需要考虑开始和结尾的差异就可以顺利求解，笔者习惯于称之为首尾法。 例：假如一个DNA分子含有1000个碱基对（P元素只是32P）,将这个DNA分子放在只含31P的脱氧核苷酸的培养液中让其复制两次,则子代DNA分子的相对分子量平均比原来( )。 A.减少1500 B.增加1500 C. 增加1000 D.减少1000 【解析】每个碱基对应一个脱氧核苷酸，含1个磷酸基，即1个磷原子。复制两次后形成4个DNA分子，8条单链。其中两条含32P，6条含31P，因而相对分子量减少6000，4 个DNA平均减少1500。故选A。 练习：已知14N-DNA和15N-DNA的相对分子量分别为a和b。现让一杂合DNA分子在含14N的培养基上连续繁殖两代，则其子代DNA的平均相对分子量为（） A.(3a+b)/4 B.(a+3b)/4 C.(7a+b)/8 D.(a+7b)/8 三、公式法： 基于DNA的半保留复制，我们可以归纳出公式：X=m(2n-1)。
基因工程的基本过程
基因工程的基本过程 基因工程主要包括几个过程： 1、目的基因的制备； 2、选择合适的载体，将目的基因与载体相连接生成重组DNA分子； 3、将重组DNA片段导入受体； 4、选择目的基因； 5、目的基因的表达。 对于整个基因过程来讲，目的基因的获取是关键，它直接涉及到产物，而且还影响到产物的量。很多在基因操作过程中，目的基因是很难获得的，所以通常采取先生成基因文库的方法，然后从基因文库中筛选。如果目的基因的序列以及它的调控等信息很清楚，可以直接通过PCR或cDNA获取，这样就大大减少了选择目的基因的盲目性，可以将整个过程简化为以下步骤： 图10-3-8 基因工程过程
(1)目的基因的分离和制备 目的基因是指准备导入受体细胞内的，以研究或应用为目的所需要的外源基因称目的基因。获得目的基因的方法很多，但也是十分困难的一步。目前获得目的基因有4条途径： 1.从生物基因组群体中分离目的基因 原核生物基因组较小，基因容易定位，用限制性内切酶将基因组切成若干段后，用带有标记的核酸探针，从中选出目的基因。真核生物一般通过基因组文库的方法获得目的基因。 图10-3-1 限制性内切酶
限制性内切酶(restrictive enzyme)是20世纪60年代末在细菌中发现的，能水解DNA分子骨架的磷酸二酯键，使一个完整的DNA分子切成若干段，每一种限制酶，都有自己特定的作用位点，而且切口或切下来的序列，往往是回文结构（palindromes）。例如Eco RI把GAATTC在GA之间切开，形成粘性末端。也有一些限制酶作用的结果产生不含粘性末端的平整末端，如HapI。多在原核生物中存在，能识别4～6个特苷酸特定的碱基序列。限制酶对细菌有保护作用，某些入侵的噬菌体可因DNA链被限制性酶切断而不能在细菌中繁殖，“限制”因此而得名。限制酶不能切开细菌本身的DNA，这是因为细菌DNA的腺嘌呤和胞嘧啶甲基化（-CH3）而受到保护之故。 这样就可以用限制性内切酶把一个基因组DNA分成很多片段，对于原核生物比较小的基因组来说，可以直接用标记地探针来获取在通过特定的方法，对于比较大的基因组，可以先制作基因文库，然后钓取所需要的带有目的基因的片段。 2.人工合成目的基因DNA片段 人工合成目的基因DNA片段有化学合成和酶促合成法两条途径。一般是采用DNA合成仪来合成长度不是很大的DNA片段。 3.PCR反应合成DNA 聚合酶链式反应（PCR)是以DNA变性、复制的某些特性为原理设计的。通过PCR技术获取所需要的特异DNA片段在实际应用用得非常多，但是前提条件是必须对目的基因有一定的了解，需要设计引物。PCR技术的原理如下：
基因克隆的几种常见方法
基因克隆得几种常见方法 基因（gｅｎe)就是遗传物质得最基本单位,也就是所有生命活动得基础。不论要揭示某个基因得功能,还就是要改变某个基因得功能,都必须首先将所要研究得基因克隆出来。特定基因得克隆就是整个基因工程或分子生物学得起点。本文就基因克隆得几种常用方法介绍如下。 1 根据已知序列克隆基因 对已知序列得基因克隆就是基因克隆方法中最为简便得一种。获取基因序列多从文献中查取，即将别人报道得基因序列直接作为自己克隆得依据。现在国际上公开发行得杂志一般都不登载整个基因序列,而要求作者在投稿之前将文章中所涉及得基因序列在基因库中注册，拟发表得文章中仅提供该基因在基因库中得注册号(acｃｅssion numｂer）,以便别人参考与查询。目前，世界上主要得基因库有１）EMBL,为设在欧洲分子生物学实验室得基因库，其网上地址为; （2)Genbank，为设在美国国家卫生研究院(ＮIＨ）得基因库，其网上地址为;（3)Swｉssport与TＲEMBＬ,Swissport就是一蛋白质序列库,其所含序列得准确度比较高,而TREMBＬ只含有从EＭBＬ库中翻译过来得序列。目前,以Geｎbａnk得应用最频繁。这些基因库就是相互联系得,在Genbank注册得基因序列,也可能在Swisspoｒt注册。要克隆某个基因可首先通过Inｔeｒnet查询一下该基因或相关基因就是否已经在基因库中注存。查询所有基因文库都就是免费得,因而极易将所感兴趣得基因从库中拿出来,根据整个基因序列设计特异得引物，通过PＣＲ从基因组中克隆该基因,也可以通过RＴ-PCＲ克隆cＤNA。值得注意得就是,由于物种与分离株之间得差异,为了保证PＣR扩增得准确性,有必要采用两步扩增法,即neｓted PCR。 根据蛋白质序列也可以将编码该蛋白质得基因扩增出来。在基因文库中注册得蛋白质序列都可以找到相应得ＤNA或cDNＡ序列。如蛋白质序列就是自己测定得，那么需要设计至少１对简并引物(dｅgｅneｒated ｐrimeｒ),从cDNA文库中克隆该基因。以这种方法克隆得基因必须做序列测定才能鉴别所扩增产物得特异性。 另外,在基因克隆之后，如还要进一步做表达研究，所使用得PCR酶最好不用Taq DNA聚合酶，而采用其她有自我检测（reading proｏf)功能得酶,如pfｕ。这样可以避免由于扩增过程中出现得点突变或终止密码子而导致整个研究结论得错误。 ２根据已知探针克隆基因 这也就是基因克隆得一种较直接得方法。首先将探针作放射性或非放射性标记,再将其与用不同内切酶处理得基因组DNＡ杂交,最后将所识别得片段从胶中切下来，克隆到特定得载体（质粒、噬菌体或病毒)中作序列测定或功能分析。这种方法不但可以将基因克隆出来,还能同时观察该基因在基因组中得拷贝数。
基因工程的基本操作程序教案
一、教材分析 《基因工程的基本操作程序》是专题1《基因工程》的第二节，也是《基因工程》的核心，上承《DNA重组技术的基本工具》，下接《基因工程的应用》。本节课主要介绍了基因工程的基本操作程序的四个步骤，教学内容多，难点多，最好化整为零、各个击破。 二、教学目标 1．知识目标： 简述基因工程原理及基本操作程序。 2．能力目标： 尝试设计某一转基因生物的研制过程。 3．情感、态度和价值观目标： （1）关注基因工程的发展。 （2）认同基因工程的诞生和发展离不开理论研究和技术创新。 三、教学重点和难点 1、教学重点 基因工程基本操作程序的四个步骤。 2、教学难点 （1）从基因文库中获取目的基因 （2）利用PCR技术扩增目的基因 四、学情分析 本节课内容较多，难点较多，学生学习起来有一定困难，所以之前应该要求学生做好预习，尽量采用化整为零、各个击破的教学策略。 五、教学方法 1、学案导学：见学案。 2、新授课教学基本环节：预习检查、总结疑惑→情境导入、展示目标→合作探究、精讲点拨→反思总结、当堂检测→发导学案、布置预习 六、课前准备 1．学生的学习准备：预习《基因工程的基本操作程序》，初步把握基因工程原理及基本操作程序。 2．教师的教学准备：多媒体课件制作，课前预习学案，课内探究学案，课后延伸拓展学案。 七、课时安排：2课时 八、教学过程 （一）预习检查、总结疑惑 检查学生落实预习的情况并了解学生的疑惑，使教学具有针对性。 （二）情境导入、展示目标 教师首先提问： （1）什么是基因工程？（基因工程的概念） （2）DNA重组技术的基本工具有哪些？（限制酶、DNA连接酶、载体） （3）运载体需要具备哪些条件？（有一个或多个限制酶切割位点；有标记基因；能在受体细胞中稳定存在并自我复制或者整合到受体细胞染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制） 上节课我们学习了DNA重组技术的基本工具，本节课我们将继续学习《基因工程》的核心内容——基因工程的基本操作程序。我们来看本节课的学习目标。（多媒体展示学习目标，强调重难点） （三）合作探究、精讲点拨
基因克隆的几种常见方法
基因克隆的几种常见方法 基因(gene)是遗传物质的最基本单位,也是所有生命活动的基础。不论要揭示某个基因的功能,还是要改变某个基因的功能,都必须首先将所要研究的基因克隆出来。特定基因的克隆是整个基因工程或分子生物学的起点。本文就基因克隆的几种常用方法介绍如下。 1 根据已知序列克隆基因 对已知序列的基因克隆是基因克隆方法中最为简便的一种。获取基因序列多从文献中查取,即将别人报道的基因序列直接作为自己克隆的依据。现在国际上公开发行的杂志一般都不登载整个基因序列,而要求作者在投稿之前将文章中所涉及的基因序列在基因库中注册,拟发表的文章中仅提供该基因在基因库中的注册号(accession number),以便别人参考和查询。目前,世界上主要的基因库有1)EMBL,为设在欧洲分子生物学实验室的基因库,其网上地址为 https://www.360docs.net/doc/0f2735668.html,/ebi-home.html;(2)Genbank,为设在美国国家卫生研究院(NIH)的基因库,其网上地址为 https://www.360docs.net/doc/0f2735668.html,/web/search/index.html;(3)Swissport和TREMBL,Swissport是一蛋白质序列库,其所含序列的准确度比较高,而TREMBL只含有从EMBL库中翻译过来的序列。目前,以Genbank的应用最频繁。这些基因库是相互联系的,在Genbank注册的基因序列,也可能在Swissport注册。要克隆某个基因可首先通过Internet查询一下该基因或相关基因是否已经在基因库中注存。查询所有基因文库都是免费的,因而极易将所感兴趣的基因从库中拿出来,根据整个基因序列设计特异的引物,通过PCR从基因组中克隆该基因，也可以通过RT-PCR克隆cDNA。值得注意的是,由于物种和分离株之间的差异,为了保证PCR 扩增的准确性,有必要采用两步扩增法,即nested PCR。 根据蛋白质序列也可以将编码该蛋白质的基因扩增出来。在基因文库中注册的蛋白质序列都可以找到相应的DNA或cDNA序列。如蛋白质序列是自己测定的,那么需要设计至少1对简并引物(degenerated primer),从cDNA文库中克隆该基因。以这种方法克隆的基因必须做序列测定才能鉴别所扩增产物的特异性。 另外,在基因克隆之后,如还要进一步做表达研究,所使用的PCR酶最好不用Taq DNA聚合酶,而采用其他有自我检测(reading proof)功能的酶,如pfu。这样可以避免由于扩增过程中出现的点突变或终止密码子而导致整个研究结论的错误。 2 根据已知探针克隆基因 这也是基因克隆的一种较直接的方法。首先将探针作放射性或非放射性标记,再将其与用不同内切酶处理的基因组DNA杂交,最后将所识别的片段从胶中切下来，克隆到特定的载体(质粒、噬菌体或病毒)中作序列测定或功能分析。这种方法不但可以将基因克隆出来,还能同时观察该基因在基因组中的拷贝数。但在探
7-3 基因工程与克隆技术
专题三基因工程与克隆技术 (时间：30分钟) 考点一基因工程 1．(2014·福建质检)为探究SHH基因与角化囊肿发生的相关性，科研人员利用SHH基因的非模板链转录合成RNA作为探针，进行分子杂交实验，以检测SHH基因在角化囊肿中的表达情况。其基本流程如下图：(Amp表示氨苄青霉素抗性基因；LacZ 基因被SHH基因插入后不表达) 请回答： (1)重组载体中SHH基因转录合成RNA探针时，______(需要/不需要)启动子。 (2)步骤②中，用Ca2＋处理大肠杆菌，使之成为______细胞，然后导入重组载体。 实验中，用添加氨苄青霉素的培养基培养大肠杆菌，未导入质粒的细菌将会死亡，原因是这些细菌不含有______基因。 (3)能表达LacZ基因的大肠杆菌在含有IPTG和X－gal的培养基上会形成蓝色菌落， 易于识别。根据上述原理可以初步判断______(蓝色/白色)菌落中的大肠杆菌为重组菌。 (4)将制备的探针加入角化囊肿切片中，探针将与__________________形成杂交带， 进而判断SHH基因的转录情况。 解析(1)由图可知，SHH基因插入在LacZ基因中，LacZ基因被SHH基因插入后不表达，所以要使SHH基因表达就需要启动子。 (2)大肠杆菌细胞用Ca2＋处理后就称为感受态细胞；要在添加氨苄青霉素的培养基 上生存，一定要含有抗氨苄青霉素基因才可以，没有抗氨苄青霉素基因将会死亡。
(3)能表达LacZ基因的大肠杆菌在含有IPTG和X－gal的培养基上会形成蓝色菌落， 重组菌中LacZ基因被SHH基因插入后不表达，含有IPTG和X－gal的培养基上会形成白色菌落。 (4)判断SHH基因的转录情况，也就是判断SHH基因是否转录出mRNA。 答案(1)需要 (2)感受态Amp(或氨苄青霉素抗性或抗性) (3)白色 (4)SHH转录的mRNA(只写mRNA不可) 2．(2014·山东潍坊一模)下图表示转基因烟草的培育过程。请据图回答： (1)图示过程将外源基因导入受体细胞的方法是______________，若将外源基因导入 动物细胞，目前采用最多、最有效的是__________技术。 (2)为便于鉴别受体细胞中是否含有外源基因，携带外源基因的质粒上应有 __________，还应有__________，以利于外源基因的表达。 (3)该过程中用到的植物细胞工程技术是____________，这项技术应在________条件 下进行，依据的生物学原理是__________________。 (4)外源基因的检测首先要采用DNA分子杂交技术检测________________，其次采 用分子杂交技术检测_____________，最后通过抗原—抗体杂交检测__________________。 答案(1)农杆菌转化法显微注射