SOD酶活性测定方法
SOD酶活性测定
所需药品：
（1）0.1mol/l pH7.8的磷酸钠缓冲液：
A液：0.1mol/l磷酸氢二钠液
B液：0.1mol/l磷酸二氢钠液
1毫升B+10.76毫升A
（2）0.026mol/l蛋氨酸液（Met）：现用现配
称取0.3879克蛋氨酸，用1号液定容至100毫升。
（3）75*10-5mol/l氯化硝基四氮唑蓝（NBT）液：现用现配
称取0.1533克NBT，先用少量蒸馏水溶解，然后定容至250毫升。
（4）1umol/lEDTA-2钠和2*10-5mol/l核黄素混合液
（5）0.05mol/l pH7.8的磷酸钠缓冲液
（6）石英砂
实验步骤：
1.酶液制备：称取0.5克鲜叶，放入研钵中，加入3毫升5号液和少量石英砂，于冰浴中研成匀浆。然后用5号液定容至8毫升，于0～4℃、13000g时离心15分钟，上清液即为酶提取液。酶液可在低于0℃下的环境中保存。
2.按下表加入试剂：
试剂摇匀后，迅速遮光处理1号杯，其余杯在25℃、光强为4000勒克司的条件下照光处理15分钟，然后立即遮光。接着在560nm下，以1号杯作为空白测定其余杯中溶液的光密度。假定2、3号杯中溶液抑制NBT光还原的相对百分率为100%，然后按下式分别计算其余杯中溶液抑制NBT光还原的相对百分率。
M/N=100/X
M——2、3号杯中溶液的光密度的平均值
N——其余杯中溶液的光密度值
X——其余杯中溶液抑制NBT光还原的相对百分率
然后以酶液量为横坐标，以其余杯中溶液抑制NBT光还原的相对百分率（X）为纵坐标制作曲线，根据线性好的曲线所得出的函数关系计算抑制NBT光还原的相对百分率为50%时所加入的酶液量，以该酶液量作为1个酶活单位。
结果计算：SOD活力按下式计算：
A=V*1000*60/（B*W*T）
A——酶活力（酶活力单位·g-1·FW·h-1）V——酶提取液体积（毫升）
B——一个酶活力单位的酶液量（微升）W——样品鲜重（克）
T——反应时间（分）
因测定样品数量多时也可用下列简式计算：A=（D1-D2）*V*1000*60/（D1*B*W*T*50%）D1——2、3号杯光密度的平均值
D2——测定样品的光密度值
SOD酶活性测定方法
SOD酶活性测定 所需药品： （1）0.1mol/l pH7.8的磷酸钠缓冲液： A液：0.1mol/l磷酸氢二钠液 B液：0.1mol/l磷酸二氢钠液 1毫升B+10.76毫升A （2）0.026mol/l蛋氨酸液（Met）：现用现配 称取0.3879克蛋氨酸，用1号液定容至100毫升。 （3）75*10-5mol/l氯化硝基四氮唑蓝（NBT）液：现用现配 称取0.1533克NBT，先用少量蒸馏水溶解，然后定容至250毫升。 （4）1umol/lEDTA-2钠和2*10-5mol/l核黄素混合液 （5）0.05mol/l pH7.8的磷酸钠缓冲液 （6）石英砂 实验步骤： 1.酶液制备：称取0.5克鲜叶，放入研钵中，加入3毫升5号液和少量石英砂，于冰浴中研成匀浆。然后用5号液定容至8毫升，于0～4℃、13000g时离心15分钟，上清液即为酶提取液。酶液可在低于0℃下的环境中保存。 2.按下表加入试剂： 试剂摇匀后，迅速遮光处理1号杯，其余杯在25℃、光强为4000勒克司的条件下照光处理15分钟，然后立即遮光。接着在560nm下，以1号杯作为空白测定其余杯中溶液的光密度。假定2、3号杯中溶液抑制NBT光还原的相对百分率为100%，然后按下式分别计算其余杯中溶液抑制NBT光还原的相对百分率。 M/N=100/X M——2、3号杯中溶液的光密度的平均值 N——其余杯中溶液的光密度值 X——其余杯中溶液抑制NBT光还原的相对百分率 然后以酶液量为横坐标，以其余杯中溶液抑制NBT光还原的相对百分率（X）为纵坐标制作曲线，根据线性好的曲线所得出的函数关系计算抑制NBT光还原的相对百分率为50%时所加入的酶液量，以该酶液量作为1个酶活单位。 结果计算：SOD活力按下式计算： A=V*1000*60/（B*W*T）
SOD(超氧化物歧化酶)活性测定
SOD(超氧化物歧化酶)活性测定 氮蓝四唑法 一、原理 超氧化物歧化酶(superoxide dismutase ，SOD)普遍存在动、植物的体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶，它催化下面的反应： o 2.-+H O 2 22+O H ＋ 反应产物H 2O 2可由过氧化氢酶进一步分解或被过氧化物酶利用。超氧化物歧化酶抑制氮蓝四唑(NBT)在光下的还原作用来确定酶活性的大小。在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易被氧化而产生超氧阴离子，超氧阴离子可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm 处有最大吸收。而SOD 可清除超氧阴离子，从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶的活性愈低，反之酶的活性俞高。据此可计算出酶活性的大小。 二、材料、仪器设备及试剂 (一)材料 植物器官(花瓣、叶片等) (二)仪器设备 冰箱、低温高速离心机、微量加样器 (1mL 、20μL 、100μL)、移液管、精密电子天平、UV-752型紫外分光光度计、试管、研钵、剪刀、镊子、荧光灯(反应试管处照度为4000Lux 或Lx) (三)试剂 (1) 0.05mol/L 磷酸缓冲液(PH7.8)。 (2) 130mmol/L 甲硫氨酸(Met)溶液：称1.9399gMet 用磷酸缓冲液定溶至100mL 。 (3)750μmol/L 氮蓝四唑溶液：称取0.06133gNBT 用磷酸缓冲液定溶至100mL ，避光保存。 (4)100μmol/LEDTA -Na 2溶液：称取0.03721g EDTA-Na 2，用磷酸缓冲液定溶1000mL 。 (5)20μmol/L 核黄素溶液：称取0.0753g 核黄素用蒸馏水定溶到1000mL ，避光保存。 三、试验步骤 (一)酶液的提取 (1)称取植物材料(去叶脉)0.2g ，加1ml 预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加缓冲
土壤纤维素酶测定方法
纤维素酶 一、试剂： 1）醋酸缓冲液（pH 5.5）：164.08 g无水醋酸钠（C2H3O2Na）溶于700 ml去离子水，用醋酸（C2H4O2）调节pH至5.5，用去离子水稀释至1 L。 2）CMC溶液（0.7%，w:v）：7 g羧甲基纤维素钠盐溶于1 L醋酸缓冲液，45℃下搅拌2 h，此溶液在4℃下可存放7天。 3）还原糖试剂： 试剂A：16 g无水碳酸钠（Na2CO3）和0.9 g氰化钾（KCN）溶于去离子水并稀释至1 L。试剂B：0.5 g六氰铁钾（K4Fe（CN）6）溶于去离子水并稀释至1 L，贮于棕色瓶中。 试剂C：1.5 g 硫酸铁铵（NH4SO4Fe2(SO4)2·H2O）、1 g十二烷基硫酸钠（C12H25O4SNa）和4.2 ml浓硫酸溶于50℃去离子水，冷却后稀释至1 L。 4）水合葡萄糖溶液：28 mg水合葡萄糖溶于少量去离子水中，并定容至1 L。 二、仪器设备 恒温培养箱，水浴锅，分光光度计，搅拌器，三角瓶 三、操作步骤 取10.00 g（耕地）或5.00 g（林地）新鲜土壤（＜2 mm）于100 ml三角瓶中，加15 ml 醋酸缓冲液和15 ml CMC溶液，盖上塞子，于50℃下培养24 h，过滤。同时做空白对照，但在培养结束时才加入15 ml CMC溶液，并迅速过滤。 取2.00 ml滤液于50 ml容量瓶中，并用去离子水定容至刻度。吸取2.00 ml稀释液于20 ml试管中，加2.00 ml还原糖试剂A和2.00 ml还原糖试剂B，盖紧混匀，在100℃水浴中加热15 min 后，立即至于20℃水中冷却5 min。加10.00 ml还原糖试剂C，混匀，20℃下静置显色60 min，于690 nm波长处比色测定（要求在30 min内完成）。 标准曲线：吸取0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0 ml水合葡萄糖溶液，用去离子水稀释至2 ml，同上加入还原糖试剂A、B、C后，比色测定还原糖含量。c) 空白： 无土空白：不加土样，其余操作与样品试验相同，整个试验设置一个，重复一次。 无基质空白：以等体积水代替基质，每个土样设置一个。 四、结果计算 土壤纤维素酶活性（μg·g-1·(24 h)-1）＝(C*V*f)/ dwt 式中C为样品的葡萄糖含量（μg·ml-1）；V为土壤溶液体积（30 ml）；f为稀释倍数（25）；
邻苯三酚自氧化法简易操作图解-测量SOD活性方法
连苯三酚自氧化法测定·O2-自由基的清除能力简介（适用于：SOD及各种抗氧化剂） 文献来源 [1] Xican Li. Improved Pyrogallol Autoxidation Method: A Reliable and Cheap Superoxide-scavenging Assay Suitable for All Antioxidants. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2012, 60:6418-6424. 操作图解 具体方法 1 溶液配制 1.1 Tris溶液（0.1mol/L）：1.21 gTris（三羟甲基氨基甲烷，M.W. 121.1）+100 mL蒸馏水。 1.2 HCl溶液（0.1mol/L）：取0.1 mL浓盐酸，加蒸馏水稀释到6 mL。 1.3 Tris-HCl缓冲液（0.05mol/L，pH7.4，含1mmol/L Na2EDTA） 40 mL0.1 mol/L Tris溶液+ x mL0.1 mol/L HCl溶液+15.2 mg Na2EDTA，混合，稀释到80 mL。用pH 计测量，pH应为7.4。用棕色瓶保存在冰箱内(最多保存三天) 。（以上为一个样品的用量）用前稍热至室温，再测pH值，符合要求即可。 1.4 60 mmol/L连苯三酚溶液（溶于1 mmol/L盐酸中） 取0.1mol/L HCl溶液（见1.2项）20μL，用蒸馏水稀释到2 mL，得1 mmol/L盐酸溶液（用pH计测量，pH＝2.5-3.0）。再往里加连苯三酚14.6 mg (M。W.126.1 )，即得。（当天有效,以上为1个样品的用量）。 2 测试液 2.1连苯三酚溶液：取2950μL Tris-HCl缓冲液加入到石英比色皿中，再加约50μL连苯三酚溶液，迅速混合(颠覆式)，开始计时,每隔30秒读数一次A值（325nm），至300秒（5min）时为止。（空白参比：Tris-HCl 缓冲液） ΔA＝A325nm,300s - A325nm,30s。由于ΔA值反映了生成·O2的初始浓度，所以，对于同一批实验而言，此时的ΔA值必须相等。此时的ΔA为ΔA0。 3.2 样品溶液：取xμL样品溶液加入到大石英比色皿中，再加（2950-x）μL Tris-HCl缓冲液，再加50μL 连苯三酚溶液，迅速混合(颠覆式)，开始计时,每隔30秒读数一次（A值，325nm），至300秒时为止。（空白参比：Tris-HCl缓冲液） ΔA＝A325nm,300s - A325nm,30s。此时的ΔA为ΔA样。 3 计算公式
SOD测定方法
酶液提取:称取鲜叶样品。0.5g于预冷的研钵中，加lml0.05mol/1 pH7.0磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使终体积为5ml。将提取液于10000转/分冷冻离心20分钟，上清液用于测定SOD, POD, CAT活力测定及丙二醛含量测定。 SOD： 测定SOD活性的试剂配制及用量: ①磷酸缓冲液(PH7.8) 0.05moI/L 3.1m1，空白为3.2m1; ②EDTA-Na 2 1mg/m1 0.2mL; ③L一甲硫氨酸20mg/mL 0.2m1; ④核黄素0.1 mg/ml，吸取上清液0.2m1; ⑤NBT lmg/ml 0.2m1; ⑥提取酶液0.1ml，空白不加酶液。 反应总体积为4m1, 第1组、4000Lx光照30min，遮黑布终止反应(用光照培养箱，灯管全部打开即可)。 第2组、黑暗处理30 min。 置560nm处测定光密度。SOD活性单位以抑制NBT光化还原50%作为一个酶活性单位(u)，按以下公式计算SOD活性: 式中，Ack为照光管的吸光度值;AE为遮光管的吸光度值:V为样品液总体积((ml);Vt为测定时样品用量(ml); W为样品鲜重。 POD： 在试管中依次加入 4m1 0.3%愈创木酚(0.02mo1/1 pH6磷酸缓冲液配置)、 50ul酶液、 50 ul0.3%H 20 2， 摇匀，立即计时，1分钟后在470nm波长下比色，每1分钟记录一次吸光度值，连续记录5分钟。以每分钟内A470变化0.01为1个过氧化物酶活性单位(U)，按下式计算过氧化物酶活性:
式中:d A470为反应时间内吸光度的变化:Vt为提取液总体积(ml); W为样品鲜重(g); Vs为测定时取用酶液体积(ml); t为反应时间(min) 。 CAT 取酶提取液50 u 1， 加入3m1 0.05 mol/1 pH7.0磷酸缓冲液， 再加入0.3%H 2O 2 200 u1， 迅速摇匀，立即计时，1分钟后在UV-754分光光度计的240nm波长下比色，每1分钟记录一次吸光度值，连续记录5分钟。以每分钟内A240下降0.01为1个酶活性单位(U)，按下式计算过氧化氢酶活性: 式中:△A 240 为反应时间内吸光度的变化;Vt为提取液总体积(ml):w为样品鲜重(g); Vs为测定时取用酶液体积(ml); t为反应时间(min) MDA 取上清液1.5m1， 加入2.5m10.5%的硫代巴比妥酸(TBA)(用10%三氯乙酸配制)。 混合物于100℃沸水浴中加热20min，迅速冷却，于10000转/分离心20分钟，分别测定上清液在450, 532nm及600nm处的吸光度值。按以下公式计MDA浓度C( u mol/1)和含量(nmollgFW): C(u mol/1)=6.45 X (A532-A600)-0.56 X A450
土壤酶活性测定方法
土壤酸性磷酸酶活性的测定 1．试剂配制 (1)0.115M p-硝基苯磷酸钠溶液 取10.67g p-硝基苯磷酸二钠（6H O,分子量为371.1），溶于pH4.5通用缓冲液中并稀释至 2 250ml.4摄氏度冰箱保存。 (2)通用缓冲液（pH4.5）（缓冲液久置会有沉淀） 原液由以下成分组成: 三羟甲基氨基甲烷12.1g 顺丁烯二酸11.6g 柠檬酸14g 硼酸6.3g 溶于500ml 1N NaOH（40g定容1L）中，加蒸馏水至1L。取原液200 ml，再加入0.1N HCL 或浓HCL来调pH为4.5。最后稀释至1L，即得。 (3)甲苯 (4)0.5 mol/L Cacl2.2H2O溶液： 36.75g Cacl2.2H2O定容500ml. (无水CaCl2: 11.1g定容200ml) (5)0.5 mol/L NaOH溶液：20g NaOH定容1L. 2．测定步骤 置于50ml三角瓶中，加4ml通用缓冲液（pH4.5）、0.25ml甲苯和1ml 0.115M p-硝基苯磷酸钠溶液,摇匀后，置于37℃恒温箱中1h。 培养结束后，加入1ml 0.5 mol/L氯化钙溶液和4ml 0.5 mol/L NaOH溶液，通过致密滤纸过滤到50ml容量瓶，用蒸馏水定容后在410nm处比色. 3．计算方法 土壤酸性磷酸酶的活性用单位时间内每克土中的对硝基苯酚的毫克数表示， W（mg·g-1·h-1）=M1/（m×t） 式中：M1—标准曲线上查得样品中对硝基苯酚的质量（mg）； t —反应时间（h）；=1h m—样品土壤的重量（g） 无土壤CK: 用1ml蒸馏水代替1g土壤；每批土样做2个；无基质CK: 用1ml蒸馏水代替1ml PNPP。每个处理做1个。 标准曲线的制作： 1）对硝基苯酚标液：1g对硝基苯酚定容1L，低温保存。 2）取标液0、1、2、3、4、5ml于0-6号硬质试管中，分别加pH6.5通用缓冲液4ml，Cacl2.2H2O 溶液1ml，NaOH溶液4ml， ②混匀后，定量滤纸过滤到50ml容量瓶，定容后，再取各浓度标液1ml定容至50ml，以0号试管作为对照，在A410nm波长下测光吸收值，并记录光吸收值A410。 ③以吸光值为横坐标、对硝基苯酚的含量为纵坐标计算直线回归方程y=a+bx及相关系数R，即对硝基苯酚含量n（mg）=a+b×A410.
土壤酶活性测定方法综合
土壤酶活性测定方法 1、土壤脲酶的测定方法（苯酚钠—次氯酸钠比色法） 一、原理 脲酶存在于大多数细菌、真菌和高等植物里。它是一种酰胺酶作用是极为专性的，它仅能水解尿素，水解的最终产物是氨和二氧化碳、水。土壤脲酶活性，与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效磷含量呈正相关。根际土壤脲酶活性较高，中性土壤脲酶活性大于碱性土壤。人们常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素状况。 土壤中脲酶活性的测定是以脲素为基质经酶促反应后测定生成的氨量，也可以通过测定未水解的尿素量来求得。本方法以尿素为基质，根据酶促产物氨与苯酚—次氯酸钠作用生成蓝色的靛酚，来分析脲酶活性。 二、试剂 1）甲苯 2）10%尿素：称取10g尿素，用水溶至100ml。 3）柠檬酸盐缓冲液（）：184g柠檬酸和氢氧化钾（KOH）溶于蒸馏水。将两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至，用水稀释定容至1000ml。 4）苯酚钠溶液（L）：苯酚溶于少量乙醇，加2ml甲醇和丙酮，用乙醇稀释至100ml （A液），存于冰箱中；27gNaOH溶于100ml水（B液）。将A、B溶液保存在冰箱中。使用前将A液、B液各20ml混合，用蒸馏水稀释至100ml。
5）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂，至活性氯的浓度为%，溶液稳定。 6）氮的标准溶液：精确称取硫酸铵溶于水并稀释至1000ml，得到1ml含有氮的标准液；再将此液稀释10倍（吸取10ml标准液定容至100ml）制成氮的工作液（ml）。 三、操作步骤 称取5g土样于50ml三角瓶中，加1ml甲苯，振荡均匀，15min后加10ml10% 尿素溶液和20ml PH 柠檬酸盐缓冲溶液，摇匀后在37℃恒温箱培养24小时。培养结束后过滤，过滤后取1ml滤液加入50ml容量瓶中，再加4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液，随加随摇匀。20min后显色，定容。1h内在分光光度计与578nm波长处比色。（靛酚的蓝色在1h内保持稳定）。 标准曲线制作：在测定样品吸光值之前，分别取0、1、3、5、7、9、11、13ml 氮工作液，移于50ml容量瓶中，然后补加蒸馏水至20ml。再加入4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液，随加随摇匀。20min后显色，定容。1h内在分光光度计上于578nm波长处比色。然后以氮工作液浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。 注意事项: 1、每一个样品应该做一个无基质对照，以等体积的蒸馏水代替基质，其他操作 与样品实验相同，以排除土样中原有的氨对实验结果的影响。 2、整个实验设置一个无土对照，不加土样，其他操作与样品实验相同，以检验 试剂纯度和基质自身分解。
抗氧化酶SODPODCAT活性测定方法
抗氧化酶 S O D P O D C A T活性测 定方法 集团文件版本号：（M928-T898-M248-WU2669-I2896-DQ586-M1988）
抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法 酶液制备：取0.2g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，加入1.6ml 50mmol/L预冷的磷酸缓冲液 （pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4℃、12000g下离心20min，上清液即为酶液。 一、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（氮蓝四唑光化还原法） 1、试剂的配制 （1）0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)： A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na 2HPO 4 ·12H 2 O（分子量 358.14）71.7g； B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH 2PO 4 ·2H 2 O（分子量 156.01）31.2g。 分别用蒸馏水定容到1000ml。 0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：分别取A母液(Na 2HPO 4 ) 228.75ml，B母液(NaH 2PO 4 ) 21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。 参考文献：李合生主编：植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社，2000：267～268。 （2）130mM甲硫氨酸溶液：取1.9399g Met用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至100ml。 （3）100μM EDTA-Na 2溶液：取0.03721gEDTA-Na 2 用磷酸缓冲液定 容至1000ml。 （4）20μM核黄素溶液：取0.0753g核黄素用蒸馏水液定容至1000ml，避光保存。 （5）750uM 氮蓝四唑(NBT)溶液：取0.06133g NBT用PBS定容至100ml，避光保存。 2、酶活性测定 （1）取10ml试管（要求透明度好）
植物五种酶活性检测方法
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选择茶树不同品种，每个茶枝接种5头叶蝉，按不同的时间点 (0h/6h/12h/18h/24h/36h/48h/72h/96h)取样，每个样品重复三次，测定 PPO/POD/PAL/CAT/LOX 五种酶活。 1、多酚化酶（Polyphenoloxidase，PPO）活性的测定 适量茶鲜叶（3g）,料液比1:2，加入内含5%PVP（w/v）经遇冷的pH为7.2的柠檬酸-磷酸盐缓冲液（0.1mol/L）,冰浴研磨，隔夜浸提12h，于4℃、9000r/min离心35min，取上清液，过滤得到初酶液。 取200ml初酶液，加入0.1mol/L柠檬酸-磷酸盐缓冲液(pH5.6)200uL,混合反应液1.2ml（0.1mol/L柠檬酸-磷酸盐缓冲液：0.1脯氨酸：1%邻苯二酚 =10:2:3），反应30min（37℃恒温水浴锅），6mol尿素1.2ml终止反应， 460nm波长测吸光度。对照为不加邻苯二酚的反应混合液。 酶活性单位：本实验条件下，以邻苯二酚反应液在460nm处吸光度值每分钟增加0.01为一个活性单位。 2、苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanineammonialyase，PAL）活性的测定 称取新鲜样品0.5g于预冷研钵中，加入6ml 0.1mol/L（pH8.8）硼酸钠-硼酸缓冲液，加入适量的石英砂，冰浴研磨后转入离心管中。混匀后在4℃冰箱中浸提4h。4℃10000r/min离心20min，取上清液即为酶提取液。 取酶提取液0.2ml，加入由硼酸钠缓冲液配制的0.1mol/L L-苯丙氨酸，2.8ml蒸馏水，摇匀，在40℃水浴上反应30min，冰浴中终止反应，测定OD290值，以相同体积缓冲液代替酶液进行同样的反应为对照。PAL的酶活性以每小时在290nm处吸光度变化0.01OD为一个活力单位。 3、脂氧合酶(linoleate:oxygen oxidoreductase，LOX)活性的测定 取0.2g新鲜样品，加7ml经4℃预冷的1mol/L（pH7.6）的tris-HCL缓冲液冰浴上研磨。4℃、12000r/min离心25min,上层清液即为LOX酶提取液。 Lox酶活性单位以每分钟在234nm处吸光度变化0.01OD作为一个活力单位。 4、过氧化物酶（PDA）的活性测定（愈创木酚法）
土壤酶活性测定的实验步骤
土壤酶的测定 1．三角瓶用稀HNO 3（3-5%）或用洗衣粉浸泡24h，后刷洗，然后再用蒸馏水润洗，晾干。 2．土样研磨精细后分袋装好。土量需2g+2.5g+5g+5g=14.5g，重复一次，14.5×2=29g。 一、过氧化氢酶（容量法）（关松荫P323） 1．试剂配制： (1)0.3%过氧化氢溶液： ①（1：100 30%的H 2O 2和水） ②（0.5molH 2O 2+49.5ml蒸馏水） ③（1ml30% H 2O 2+99ml蒸馏水） (2)3N硫酸： （10ml硫酸+50ml水） (3)0.1N高锰酸钾溶液： （1.58gKMnO
4+100ml蒸馏水） 2．操作步骤： 2g风干土置100三角烧瓶→注入40ml蒸馏水和5ml 0.3%过氧化氢（现配）→在往复式振荡机上振荡20min→加入5ml3N硫酸（以稳定未分解的H 2O 2）→用慢速型滤纸过滤，→吸取25ml滤液，用0.1N高锰酸钾的滴定至淡粉红色 3．结果计算 过氧化氢酶的活性（M），以20min后1g土壤的0.1N KMnO 4的毫升数表示： M=（A－B）×T 式中： A： 空白消耗的0.1N KMnO 4毫升数 B： 滤液消耗的0.1 N KMnO 4毫升数 T： KMnO 4滴定度的校正值
以容量法测H2O2的酶活： Kappen （1913）首先介绍硫酸存在下用高锰酸钾滴定剩余的过氧化氢测定酶活。此法根据H 2O 2与土壤相互作用时，未分解的H 2O 2的数量用容量法（常用高锰酸钾滴定未分解的H 2O 2）测定H 2O 2的酶活 2 KMnO 4＋5H 2O 2＋3H 2SO 4→2MnSO 4＋K 2SO
纤维素酶活力测定方法_张瑞萍
测试与标准 纤维素酶活力测定方法 张瑞萍 南通工学院(226007) 摘 要 用DN S 为显色剂,分别以滤纸和CM C 为底物,以滤纸糖酶活性(FP A )和羧甲基纤维素酶活性(CM C a se )表征纤维素酶活力。确定酶活测定用波长为530nm,参比溶液应为失活酶、底物和DN S 等共热的反应物;比较了两种底物的酶活力测定方法。结果表明,CM C a se 比FP A 高,说明酶对水溶性底物有较高的活力,也表明吸附对酶的活性部位与纤维素分子链段的结合及催化均有很大影响;对于不同牌号的纤维素酶,织物的酶减量率与CM C 酶活力关系密切。 叙 词: 测试 纤维素酶 活度中图分类号: TS197 纤维素酶是多组分复合物,各组分的底物专一性不同。纤维素酶作用的底物比较复杂,反应产物不同,致使纤维素酶活力测定方法很多,各国的方法亦不统一。我们选择滤纸、CM C 为底物,原理系利用纤维素酶催化水解纤维素,产生纤维多糖、二糖及葡萄糖等还原糖,与显色剂反应,求出还原糖的浓度,间接求出酶的活力。由不同底物测得的酶活力分别称作FPA (滤纸糖酶活力)和CM C ase (羧甲基纤维素酶酶活力)。本文分析确定酶活力测定的主要条件,比较两种底物的酶活力测定方法的结果,探讨纤维素酶活力与织物减量率的关系,为酶在生产中的利用提供依据。 1 实验方法 1.1 化学药品、材料 纤维素酶(工业品),DNS 试剂(自配),冰醋酸,醋酸钠,葡萄糖(均为分析纯),滤纸(定性),羧甲基纤维素酶CM C (试剂级),纯棉针织物半制品(南通针织厂)。 1.2 FPA 滤纸酶活力和CMC 酶活力的测定 取适当稀释的酶液,分别以滤纸或1%的CM C 溶液为底物,于50℃恒温水解反应1h ;然后加入显色剂DNS,沸水浴中煮沸5min;再加入蒸馏水,于530nm 测定吸光度OD 值。 酶活可定义为:每毫升酶液1min 产生1mg 葡萄糖为一个单位( )。 1.3 针织物酶减量率的测定 将酶处理前后的试样在烘箱中105℃烘至恒重。减量率= 处理前织物干重-处理后织物干重 处理前织物干重 ×100% 2 结果与讨论 2.1 显色剂的选择 选用DNS ,在碱性条件下与还原糖反应,生成有色化合物,用分光光度计比色,确定低分子糖含量。 碱性条件下DNS 与还原糖共热反应如下: O 2N OH O 2N CO OH +还原糖 H 2N OH CO OH O 2N DN S(黄色) 3-氨基-5-硝基水杨酸(棕红色) 生成的棕红色氨基化合物系比色法测定基础。2.2 最大吸收波长的确定 选取490～580nm 波长对显色液进行比色。由图1可知,不同浓度的葡萄糖溶液在490～500nm 处有最大吸收,DNS 在此波长下也有较明显的吸收。为了排除DNS 的干扰,选择在波长 530nm 处进行测定,此波长下的葡萄糖吸收虽有所降低,然而符合“吸收最大、干扰最小”的原则。 图1 D NS 与葡萄糖的吸收曲线 2.3 底物及酶本身含糖量的影响 在实验过程中发现,底物特别是滤纸,也含有一定的还原糖,在碱性的DNS 试剂中也会发色。而且,试验所用的纤维素酶是一种工业级的复合酶,品种不同,其本身含糖量也不同。为了排除这类还原糖的干扰,参比溶液取失活后的酶、底物、DNS 等共热的反应物。2.4 葡萄糖标准曲线 用不同浓度的葡萄糖溶液作为标准溶液,与DNS 共热反应显色后,测出其吸光度OD 值(见图2)。标准曲线的线性相关系数R 2为0.9991(见图2),线性相当好,可以用于酶活力的测定。 38 印 染(2002No .8) www .cdfn .com .cn
脲酶的测定方法
一、脲酶测定(比色法) 脲酶是对尿素转化起关键作用的酶，它的酶促反应产物是可供植物利用的氮源，它的活性可以用来表示土壤供氮能力。 1、试剂配制： （1）pH6.7柠檬酸盐溶液：取368g柠檬酸溶于600mL蒸馏水中，另取295g 氢氧化钾溶于水，再将两种溶液合并，用1N氢氧化钠将pH调至6.7， 并用水稀释至2L。 （2）苯酚钠溶液：称取62.5g苯酚溶于少量乙醇中，加2mL甲醇和18.5mL 丙酮，后用乙醇稀释至100mL（A液），保存再冰箱中。称取27g氢 氧化钠溶于100mL水中（B液），保存于冰箱中。使用前，取A、B 两液各20mL混和，并用蒸馏水稀释至100mL备用。 （3）次氯酸钠溶液：用水稀释制剂至活性氯的浓度为0.9％，（1.9g次氯酸钠溶于1L水中）溶液稳定。 （4）10％尿素溶液：10g尿素溶于100mL水中。 （5）N的标准溶液：精确称取0.4717g硫酸铵溶于水稀释至1L，则得1mL 含0.1mgN的标液，再将此液稀释10倍制成氮工作液（0.01mg/mL）。 2、操作步骤 称取5ｇ土置于50mL容量瓶中,加1mL甲苯处理,加塞塞紧轻摇15ｍｉｎ; 往瓶中加入5mL10%尿素液和10mL的柠檬酸盐缓冲液(ｐＨ6.7),仔细混匀。在37℃恒温箱中培养24ｈ。然后用热至38℃的蒸馏水稀释至刻度(甲苯应浮在刻度以上),摇荡,将悬液过滤。取滤液1mL置于50mL容量瓶中,用蒸馏水稀释至10mL,然后加入4mL苯酚钠溶液,并立即加入3mL次氯酸钠溶液，加入每一试剂后,立 即将混合物摇匀,20ｍｉｎ后,将混合物稀释至刻度,在波长578ｎｍ处测定吸光值。脲酶活性以样品所得的吸光值减去对照样品吸光值之差,根据标准曲线求出氨态 氮量。
土壤酶活性测定
土壤酶活性测定 几种水解酶：芳基硫酸酯酶（Arylsulphatase(EC 3.1.6.1)）, 葡萄糖苷酶（β-glucosidase(EC 3.2.1.21) ）和磷酸单酯酶（phosphmonoesterase(EC 3.1.3)）测定：这三种酶的测定都是依据人工合成底物（p-nitrophenyl sulphate, p-nitrophenyl glucoside and p-nitrophenyl phosphate,respectively）裂解后释放的p-nitrophenol 的量来测定。 Arylsulphatase(EC 3.1.6.1)：称取1g土（湿重），与4ml 500mM乙酸缓冲液（acetate buffer）（pH5.8）和1ml底物（25mM）混匀。对照为4ml乙酸缓冲液加1ml灭菌蒸馏水。土壤稍作涡旋振荡，置于旋转摇床20℃，200rpm培养2h。然后，往样品中加1ml 无菌蒸馏水，往对照中加1ml底物。再加入1ml 500mM 氯化钙和4ml 500mM 氢氧化钠以终止反应。悬浮液在旋转摇床上20℃，200rpm振荡30min。9464×g离心5min，然后在400nm波长下测定上清夜中所提取的p-nitrophenol 的颜色深度。如果是在中性条件下测定，则用蒸馏水取代乙酸缓冲液。标准曲线制作：用蒸馏水配制p-nitrophenol溶液，浓度范围0-50ug/ml。 β-glucosidase(EC 3.2.1.21)：缓冲液换为改进的通用缓冲液（modified universal buffer）(pH6.0);底物浓度25mM，提取液用Tris缓冲液（pH12.0）. phosphmonoesterase(EC 3.1.3): 缓冲液换为改进的通用缓冲液（modified universal buffer）(pH4.0和9.0)（分别测定酸性和碱性磷酸酯酶），底物浓度为15mM。 脲酶Urease (EC 3.5.1.5): 称取5g土（湿土），加2.5ml脲（80mM）和20ml 75mM 硼酸缓冲液（pH10.0）。涡旋振荡，旋转摇床20℃，200rpm振荡反应4h。对照为加2.5ml灭菌蒸馏水和20ml硼酸缓冲液。4h后，处理中加2.5ml灭菌蒸馏水，对照中加2.5ml脲。然后用30ml酸化的2M氯化钾提取。悬浮液在旋转摇床20℃，200rpm振荡30min。9464×g离心5min，取1ml上清夜与9ml 蒸馏水、5ml水杨酸钠（sodium salicylate）/ 氢氧化钠溶液和2ml dichloroisocyanuric acid(Na+盐)混允，20±2℃静置1h，在690nm波长下测定溶液的颜色强度。对于中性土壤用用蒸馏水取代硼酸缓冲液。标准曲线用氯化铵标准溶液制作，浓度范围0-2.5ug/ml。 脱氢酶（Dehydrogenase）： INT（2(p-iodophenyl)-3-(p-nitrophenyl)-5-phenyl tetrazolium chloride）还原酶活性（既脱氢酶活性）采用Von Mersi 和Schinner（1991）的方法测定。1g鲜土置于带盖的玻璃瓶中，加入1.5ml 1M Tris缓冲液（pH 7.0）和2ml INT（5mg/ml，溶于2%体积比的二甲替甲酰胺（N，N-dimethylformamide）中）。对照土壤加1.5ml Tris缓冲液和2ml蒸馏水。旋转摇床20℃，200rpm培养24h。然后，往样品中加2ml蒸馏水，而往对照土样中加2ml INT。然后加10ml N，N-dimethylformamide/ 甲醇（1：1，v/v）提取液终止反应，20℃，200rpm振荡1h。9464×g离心5min，464nm波长下测定上清夜的吸光值。对于中性土壤用蒸馏水取代Tris缓冲液。用INTF（iodonitrotetrazolium chloride）（Sigma）制作标准曲线，浓度范围0-27ug/ml提取液。 荧光素二乙酸酯水解（Fluorescein diacetate hydrolysis）： 称取3g鲜土，悬浮于50ml 磷酸盐缓冲液，加入250ul FDA（2mg/ml，溶于丙酮）。对照加250ul蒸馏水。土壤悬浮液在20℃，200rpm培养4h。培养结束后，样品中加250ul 蒸馏水，而对照中加250ul FDA。悬浮液涡旋振荡，取5ml置于含5ml丙酮的试管中以终
酶活性测定方法
酶活性测定 1、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase) 试剂：0.1% p-nitrophenylphosphate disodium salt（P-硝基苯磷酸二钠） 0.2mol/L 碳酸盐/碳酸氢盐缓冲溶液(pH: 9.6)——buffer 0.2mol/L NaOH 测定步骤：(1) 加入样品之前，0.1% P-硝基苯磷酸二钠及buffer 37°C孵化30 min； (2) 1mL污泥样品+1mL0.1% P-硝基苯磷酸二钠+2mL buffer 37°C孵化30 min； (3) 加入2mL 0.2mol/L NaOH终止反应； (4) 2500g 离心，上清液在410nm测定吸光度。 计算： 每个污泥样品酶活性的测定均包含两个平行样S+一个空白样品S0。 [(S1- S0)+(S2- S0)]/2*0.704 (Eu) 2、酸性磷酸酶(Acid phosphatase) 试剂：0.1% p-nitrophenylphosphate disodium salt（P-硝基苯磷酸二钠） 0.2mol/L HAc/Ac缓冲溶液(pH: 4.8)——buffer 0.2mol/L NaOH 测定步骤：(1) 加入样品之前，0.1% P-硝基苯磷酸二钠及buffer 37°C孵化30 min； (2) 1mL污泥样品+1mL0.1% P-硝基苯磷酸二钠+2mL buffer 37°C孵化30 min； (3) 加入2mL 0.2mol/L NaOH终止反应； (4) 2500g 离心，上清液在410nm测定吸光度。 计算： 每个污泥样品酶活性的测定均包含两个平行样S+一个空白样品S0。 [(S1- S0)+(S2- S0)]/2*0.719 (Eu) 3、a-葡萄糖甘酶(a-glucosidase) 试剂：0.1% p-nitrophenyl a-D glucopyranoside（p-硝基苯-Α-D-葡吡喃糖苷） 0.2mol/L Tris-HCl (pH: 7.6) 测定步骤：(1) 加入样品之前，0.1% p-硝基苯-Α-D-葡吡喃糖苷及Tris-HCl 37°C 孵化30 min； (2) 1mL污泥样品+1mL 0.1% p-硝基苯-Α-D-葡吡喃糖苷+2mL Tris-HCl 37°C孵化
各种酶活力测定方法及注意事项
碱性蛋白酶及各种蛋白酶活力测定方法及测定有感 因长期测定碱性蛋白酶酶活力与角蛋白酶活力与胶原酶活力和弹性蛋白酶活力，碱性蛋白酶活力测定还好，因有国家标准，测定按照国标来便可大大减少误差。其余酶活力测定过程中因无统一标准且底物差异大，导致长期酶活力测定的混乱，各种酶活力测定方法与各种试剂添加，最后实际测定的酶活力只能仅作参考。 以下是各种蛋白酶活力测定方法及标曲绘制： 碱性蛋白酶测定方法 根据国标GB/T 23527-2009 附录B 蛋白酶活力测定福林法 以下是方法
碱性蛋白酶的测定方法参考 GB/T 23527-2009 附录 B 中福林酚法进行，即 1 个酶活力单位（U/mL）定义为 1 mL 酶液在 40℃、pH= 10.5 条件下反应 1 min 水解酪蛋白产生 1 μg 酪氨酸所需要的酶量，主要步骤如下。 2.2.6.1 标准曲线的绘制 （1）L-酪氨酸标准溶液：按表 2-6 配制。 表 2-6 L-酪氨酸标准溶液配置表 Table 2-6 L-Tyrosine standard solution form 管号酪氨酸标准溶液的浓度/ （μg/mL） 取 100 μg/mL 酪氨酸标准 溶液的体积/（mL） 取水的体积/ （mL）
0 0 0 10 1 10 1 9 2 20 2 8 3 30 3 7 4 40 4 6 5 50 5 5 （2）分别取上述溶液各 1.00 mL，各加 0.4 mol/L 碳酸钠溶液 5.0 mL，福林试剂使用 液 1.00 mL，置于 40 ℃±0.2 ℃水浴锅中显色 20 min，用分光光度计于波长 680 nm，10 mm 比色皿，以不含酪氨酸的反应管作为空白，分别测定其吸光度值，以吸光度值 A 为纵坐标，酪氨酸浓度 C 为横坐标，绘制 L-酪氨酸标准曲线。 图 2-1 L-酪氨酸标准曲线 Fig. 2-1 L-tyrosine standard curve 根据作图或用回归方程计算出当吸光度为 1 时的酪氨酸的量（μg），既为吸光度常数 K 值。其 K 值应在 95-100 范围内。上图所示标准曲线符合要求，可用于下一步实验。 2.2.6.2 测定方法 （1）计算方法 X = A × K × 4 / 10 × n = 2 / 5 × A × K × n 式（2-1） 式中，X —样品的酶活力，μ/g； A —样品平行实验的平均吸光度； K —吸光常数； 4 —反应试剂的总体积，mL； 10—反应时间 10 min，以 1 min 计； n —稀释倍数。 （2）测定方法 ①先将干酪素溶液放入 40 ℃±0.2 ℃恒温水浴中，预热 5 min。 ②按下列程序操作，进行测定。 于 680 nm 波长，用 10 mm 比色皿测其吸光度。
土壤酶活性测定方法
土壤酶活性测定方法 土壤脲酶的测定方法（苯酚钠—次氯酸钠比色法） 一、原理 脲酶存在于大多数细菌、真菌和高等植物里。它是一种酰胺酶作用是极为专性的，它仅能水解尿素，水解的最终产物是氨和二氧化碳、水。土壤脲酶活性，与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效磷含量呈正相关。根际土壤脲酶活性较高，中性土壤脲酶活性大于碱性土壤。人们常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素状况。 土壤中脲酶活性的测定是以脲素为基质经酶促反应后测定生成的氨量，也可以通过测定未水解的尿素量来求得。本方法以尿素为基质，根据酶促产物氨与苯酚—次氯酸钠作用生成蓝色的靛酚，来分析脲酶活性。 二、试剂 1）甲苯 2）10%尿素：称取10g尿素，用水溶至100ml。 3）柠檬酸盐缓冲液（PH6.7）：184g柠檬酸和147.5g氢氧化钾（KOH）溶于蒸馏水。将两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至6.7，用水稀释定容至1000ml。 4）苯酚钠溶液（1.35mol/L）：62.5g苯酚溶于少量乙醇，加2ml甲醇和18.5ml丙酮，用乙醇稀释至100ml（A液），存于冰箱中；27gNaOH溶于100ml水（B液）。将A、B溶液保存在冰箱中。使用前将A液、B液各20ml混合，用蒸馏水稀释至100ml。 5）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂，至活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。 6）氮的标准溶液：精确称取0.4717g硫酸铵溶于水并稀释至1000ml，得到1ml含有0.1mg 氮的标准液；再将此液稀释10倍（吸取10ml标准液定容至100ml）制成氮的工作液（0.01mg/ml）。 三、操作步骤 称取5g土样于50ml三角瓶中，加1ml甲苯，振荡均匀，15min后加10ml10%尿素溶液和20ml PH 6.7柠檬酸盐缓冲溶液，摇匀后在37℃恒温箱培养24小时。培养结束后过滤，过滤后取1ml滤液加入50ml容量瓶中，再加4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液，随加随摇匀。20min后显色，定容。1h内在分光光度计与578nm波长处比色。（靛酚的蓝色在1h 内保持稳定）。 标准曲线制作：在测定样品吸光值之前，分别取0、1、3、5、7、9、11、13ml氮工作液，移于50ml容量瓶中，然后补加蒸馏水至20ml。再加入4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液，随加随摇匀。20min后显色，定容。1h内在分光光度计上于578nm波长处比色。然后以氮工作液浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。 注意事项: 1、每一个样品应该做一个无基质对照，以等体积的蒸馏水代替基质，其他操作与样品 实验相同，以排除土样中原有的氨对实验结果的影响。 2、整个实验设置一个无土对照，不加土样，其他操作与样品实验相同，以检验试剂纯
酶活性测定方法
一、过氧化物酶（POD）活性的测定 POD测定参照李合生等（2003）的愈创木酚法方法进行测定，略加改动。 测定：称取样品0.5g，加入5mL 1／15mol／L PH=7.0的磷酸缓冲溶液，冰浴研磨成匀浆，4℃条件下12000r/min离心15min，上清液为粗酶液。然后在试管中加pH 7.0的磷酸缓冲液2 ml，愈创木酚（0.2%）0.5ml，浓度为0.15%的H2O2 0.5ml，取0.3ml的酶提取液加入到试管中，空白以缓冲液代替。在470nm下测定其吸光度，加入酶液时开始计时，每隔30s读数一次，连续记录5分钟。以每分钟每克鲜重增加0.1的酶量作为一个酶活性单位。 △470 ×V T POD活性= 0.01×t×Vs×W 式中：△470----反应时间内吸光度值的变化； V T ----提取酶液的总体积（ml） t----反应的时间（min） Vs ----测定时取用酶液体积（ml） W----样品鲜重（g） 二、多酚氧化酶（PPO）活性的测定 多酚氧化酶活性测定参照朱广廉等(1990)的方法，略加改动。 酶液制备：称取样品0.5g，加入5mL 0.1mol／L PH=6.0的磷酸缓冲溶液，冰浴研磨成浆，4℃条件下12000r/min离心15min后上清液即为粗酶液。 PPO活性测定：反应试管中分别加入0.1 mL酶液+3.9 mL磷酸缓冲液+ 1 mL 1m mol／L的邻苯二酚。混匀后于30℃保温10 min，迅速加入2 mL质量分数为20％的三氯乙酸终止反应，立即于525nm下测定其吸光度值，计算酶活。 PPO活性= O D×V T 0.01×t×0.5g×V s = O D×V T 0.005 OD——反应时间内吸光值的变化； V T ----提取酶液的总体积（ml） Vs ----测定时取用酶液体积（ml） T———反应时间(min)；
土壤纤维素酶活性测定(3,5- 二硝基水杨酸比色法)
土壤纤维素酶活性测定（3,5-二硝基水杨酸比色法） 一、原理 纤维素是植物残体进入土壤的碳水化合物的重要组分之一。在纤维素酶作用下，它的最初水解产物是纤维二糖，在纤二糖酶作用下，纤维二糖分解成葡萄糖。所以，纤维素酶是碳素循环中的一个重要的酶。纤维素酶解所生成的还原糖与?3,5-二硝基水杨酸反应而生成橙色的3-氨基-5-硝基水杨酸。颜色深度与还原糖量相关，因而可 用测定还原糖量来表示蔗糖酶的活性。 二、试剂 1）甲苯 2）1%羧甲基纤维素溶液：1g羧甲基纤维素钠，用50%的乙醇溶至100ml。 3）pH5.5醋酸盐缓冲液： 0.2mol/L醋酸溶液11.55ml95%冰醋酸溶至1L； 0.2mol/L醋酸钠溶液16.4gC2H3O2Na或27.22gC2H3O2Na.3H2O溶至1L； 取11ml0.2mol/L醋酸溶液和88ml0.2mol/L醋酸钠溶液混匀即成PH5.5醋酸盐缓冲液。4）3,5-二硝基水杨酸溶液：称1.25g二硝基水杨酸，溶于50ml2mol/LNaOH和125ml 水中，再加75g酒石酸钾钠，用水稀释至250ml（保存期不过7天）。 5）葡萄糖标准液（1mg/mL） 预先将分析纯葡萄糖置80℃烘箱内约12小时。准确称取50mg葡萄糖于烧杯中，用蒸馏水溶解后，移至50mL容量瓶中，定容，摇匀（冰箱中4℃保存期约一星期）。 若该溶液发生混浊和出现絮状物现象，则应弃之，重新配制。 三、操作步骤 葡萄糖标准曲线：分别吸1mg/mL的标准葡糖糖溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mL 于试管中，再补加蒸馏水至1mL，加DNS溶液3ml混匀，于沸腾水浴中加热5min，