二电泳缓冲液、染料和凝胶加样液配置方案
二.电泳缓冲液、染料和凝胶加样液
电泳缓冲液
染料
1％溴酚蓝（bromophenol blue）
加1g水溶性钠型溴酚蓝于100ml水中，搅拌或涡旋混合直到完全溶解。
1％二甲苯青FF（xylene cyanole FF）
溶解1g二甲苯青FF于足量水中，定容到100ml。
10mg/ml的溴化乙锭（ethidium bromide）
小心称取1g溴化乙锭，转移到广口瓶中，加100ml水，用磁力搅拌器搅拌直到完全溶解。用铝箔包裹装液管，于4℃贮存。
凝胶上样液（gel loading solutions）
琼脂糖凝胶电泳及其影响因素
琼脂糖凝胶电泳及其影响因素 琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的标准方法。该技术操作简便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度离心法）所无法分离的DNA片段。当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)染色,在紫外光下至少可以检出1-10ng的DNA条带,从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。此外,还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带,用于以后的克隆操作。 琼脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各种形状、大小和孔隙度。琼脂糖凝胶分离DNA片度大小范围较广,不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA片段。琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。聚丙烯酰胺分离小片段DNA(5-500bp)效果较好,其分辩力极高,甚至相差1bp的DNA片段就能分开。聚丙烯酰胺凝胶电泳很快,可容纳相对大量的DNA,但制备和操作比琼脂糖凝胶困难。聚丙烯酰胺凝胶采用垂直装置进行电泳。目前,一般实验室多用琼脂糖水平平板凝胶电泳装置进行DNA电泳。 琼脂糖主要在DNA制备电泳中作为一种固体支持基质,其密度取决于琼脂糖的浓度。在电场中,在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移,其迁移速率由下列多种因素决定: 1、 DNA的分子大小: 线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移得越慢。 2、琼脂糖浓度 一个给定大小的线状DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。分离小于0.5kb的DNA片段所需胶浓度是1.2-1.5%,分离大于10kb的DNA分子所需胶浓度为0.3-0.7%, DNA片段大小间于两者之间则所需胶浓度为0.8-1.0%。 3、 DNA分子的构象 当DNA分子处于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和分子量有关,还和它本身构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的,超螺旋DNA移动最快,而线状双链DNA 移动最慢。如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条DNA带难以确定是质粒DNA不同构象引起还是因为含有其他DNA引起时,可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收,用同一种限制性内切酶分别水解,然后电泳,如在凝胶上出现相同的DNA图谱,则为同一种DNA。 4、电源电压 在低电压时,线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长,片段越大,因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大,因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大,所加电压不得超过5v/cm。 5、嵌入染料的存在 荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的DNA,染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA，使其刚性更强,还会使线状DNA迁移率降低15％。 6、离子强度影响 电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。在没有离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶),电导率最小,DNA几乎不移动,在高离子强度的缓冲液中(如误加10×电泳缓冲液),则电导很高并明显产热,严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。
生物实验常用缓冲液和酶的配制
实验室常用技术参数资料 一、核酸及蛋白质常用数据 1．核苷三磷酸的物理常数 2．常用核酸的长度与分子量
3．常用核酸蛋白换算数据（1）重量换算 1μg=10-6g1pg=10-12g 1ng=10-9g 1fg=10-15g （2）分光光度换算： 1A260双链DNA=50μg/ml 1A260单链DNA=30μg/ml 1A260单链RNA=40μg/ml （3）DNA摩尔换算： 1μg 100bp DNA=1.52pmol=3.03pmol末端 1μg pBR322 DNA=0.36pmol 1pmol 1000bp DNA=0.66μg 1pmol pBR322=2.8μg 1kb双链DNA（钠盐）=6.6×105道尔顿 1kb单链DNA（钠盐）=3.3×105道尔顿 1kb单链RNA（钠盐）=3.4×105道尔顿 （4）蛋白摩尔换算： 100pmol分子量100，000蛋白质=10μg 100pmol分子量50，000蛋白质=5μg
100pmol分子量10，000蛋白质=1μg 氨基酸的平均分子量=126.7道尔顿 （5）蛋白质/DNA换算： 1kb DNA=333 个氨基酸编码容量=3.7×104MW蛋白质 10，000MW蛋白质=270bp DNA 30，000MW蛋白质=810bp DNA 50，000MW蛋白质=1.35kb 100，000MW蛋白质=2.7kb DNA 4．常用蛋白质分子量标准参照物
5．常用DNA分子量标准参照物 续上表
二、常用缓冲液 1．分子克隆常用缓冲液 2．磷酸缓冲液 （1）25℃下0.1mol/L磷酸钾缓冲液的配制※
琼脂糖凝胶电泳标准操作流程
琼脂糖凝胶电泳操作标准流程 一、实验目的 琼脂糖凝胶电泳是常用的检测核酸的方法，具有操作方便、经济快速等优点。本铜人阵学习DNA 琼脂糖凝胶电泳的使用技术，此关为能力考核，通关成功后，代表具备操作琼脂糖电泳的能力。 二、实验原理 琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定DNA 、RNA 分子混合物的方法，这种电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA 分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。DNA 分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下，DNA 分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA 分子的迁移速度与其相对分子量成反比。不同构型的DNA 分子的迁移速度不同。如环形DNA 分子样品，其中有三种构型的分子：共价闭合环状的超螺旋分子（cccDNA ）、开环分子（ocDNA）、和线形DNA分子（IDNA）。这三种不同构型分子进行电泳时的迁移速度大小顺序为：cccDNA > IDNA >ocDNA 影响核酸分子泳动率的因素主要还是：1、DNA 分子大小；2、琼脂糖浓度； 3、DNA 构想； 4、所用的电压； 5、琼脂糖种类； 6、电泳缓冲液 核酸电泳中常用的染色剂是溴化乙锭（ethidium bromide EB ）。溴化乙锭是一种扁平分子，可以嵌入核酸双链的配对碱基之间。在紫外线照射BE-DNA 复合物时，出现不同的效应。254nm的紫外线照射时，灵敏度最高，但对DNA损伤严重；360nm紫外线照射时，虽然灵敏度较低，但对DNA损伤小，所以适合对DNA样品的观察和回收等操作。300nm紫外线照射的灵敏度较高，且对DNA 损伤不是很大，所以也比较适用。 三、材料、试剂及器具 1、材料 不同大小的基因组片段； 2、试剂 Hind III digest DNA Marker （分子量标准）（TaKaRa）；D2000（TianGen）；
5.缓冲液离子强度对电泳速度的影响
缓冲液离子强度对电泳速度的影响 目标：⒈阐述电泳的基本原理及注意事项。 ⒉初步掌握电泳技术（以血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳为例）。 ⒊观察并比较不同缓冲液离子强度对电泳速度的影响。 实验用品：电泳仪，电泳槽，醋酸纤维薄膜（2×8cm），点样器（X胶片），滤纸，无齿小镊子，pH8.6（I0.06和0.03）的巴比妥缓冲液等。 试剂：1、I0.06pH8.6的巴比妥缓冲液： 巴比妥钠12.76g 巴比妥 1.66g 蒸馏水1000ml 2、I0.03pH8.6的巴比妥缓冲液： 巴比妥钠 6.38 巴比妥0.83 蒸馏水1000ml 或用I0.06pH8.6的巴比妥缓冲液加蒸馏水稀释一倍即成。 3、氨基黑10B染色液： 氨基黑10B0.5g 冰醋酸10ml 乙醇50ml 蒸馏水40ml 4、漂洗液： 乙醇45ml 冰醋酸 5.0ml 蒸馏水50ml 实验原理： 由于血清中各种蛋白质等电点（pI）不同，所以在同一PH8.6缓冲液中电离程度不同，因而带电荷的多少不同。再则不同蛋白质其分子大小、形状等差异，把它放入同一电场中其电泳的迁移率（是指带电颗粒在单位电场强度下的电泳速度）不同而分离。蛋白质分子大而带电荷少的移动速度慢，如此将血清蛋白从正极到负极依次分为A、α1、α2、β、γ五个区带，经染色、漂洗、脱色，然后计算各蛋白质区带的迁移率，得出电泳缓冲液离子强度对电泳速度是如何影响的。 操作步骤： 1.一般电泳装置：示教 2.电泳操作： ①酸纤维薄膜的准备：在距一端1.5cm处用铅笔画一条细线，然后浸泡于I0.06PH8.6的巴比
妥缓冲液或I0.03PH8.6的巴比妥缓冲液中约20min。 ②取出，用滤纸吸走多余的缓冲液。 ③用点样器蘸取血样点于薄膜上。 ④将点好样的薄膜置于电泳槽上，点样面朝下，点样端置电场中的负极。 ⑤电泳：电压110~160V、时间35~40分钟。 ⑥染色：氨基黑10B或丽春红S染液染色2~3分钟。 ⑦漂洗：3~4次，背景变白，图象清晰。 结果观察与分析： 1.比较用I=0.03和I=0.06的缓冲液进行电泳时的结果，观察图形，判断用哪种离子强度好。 2.利用所记录的电泳电压（V），支持物有效长度（CM），电泳时间（S）和清蛋白移动距离（CM），分别计算用离子强度0.03和0.06的清蛋白迁移率，判断离子强度对电泳速度的影响。 ※迁移率（μ）是指带电颗粒在单位电场强度下的电泳速度（V）。 即：μ=V/E，∵V=d/t （cm/S）（t—时间d—移动距离cm） E=U/L(V/cm) (U—电压L—支持物有效长度) ∴μ=V/E=（d/t）/(U/L)=dL/Ut (cm2/vs) 结论：
琼脂糖凝胶电泳 配方与步骤
?RNA琼脂糖凝胶电泳： 配制： 1.0.5M EDTA（pH=8.0）： 100ml：称取18.61g Na2EDTA·2H2O（分子量372.24），加80ml ddH2O剧烈搅拌， 用NaOH调节PH值至8.0（约需2g NaOH）.高压灭菌，室温保存。 2.50×TAE loading buffer:（Tris acetate-EDTA buffer）电泳缓冲液 组分：2M Tris-乙酸；100mM EDTA（pH=8.0） 500mL:称121.1g Trisbase（分子量121.14），加800ml ddH2O溶解，加57.1ml 乙酸和50ml0.5M EDTA溶液（pH=8.0），搅拌，ddH2O定容至500mL.室温保存。 3.1×TAE loading buffer: 取20ml50×TAE，ddH2O定容至1L.室温保存。 4.100×Sybergreen： 500ul：取495ul1×TAE于1.5ml离心管，加入5ul Sybergreen原液混匀，4℃锡纸 避光保存。 注意：Sybergreen原液需稀释10000倍； 6×DNA loading buffer上样缓冲液需稀释六倍，最终稀释倍数应不小于1×。 步骤： 1.制备1%琼脂糖凝胶(大胶用70ml,小胶用50ml，我们用30ml): 称0.3g琼脂糖置于100ml锥形瓶中，加入30ml1×TAE，瓶口倒扣小烧杯。 微波炉加热煮沸3次，至琼脂糖全部融化，摇匀，即成1.0%琼脂糖凝胶液。 2.胶板制备: 取电泳槽内的有机玻璃内槽(制胶槽)洗干净,晾干,放入制胶玻璃板.取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好,形成模子.将内槽置于水平位置,并放好梳子. 将冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻璃板上,使胶液缓慢展开,直到整个玻璃板表面形成均匀胶层.室温下静置直至凝胶完全凝固,垂直轻拔梳子,取下胶带,将凝胶及内槽放入电泳槽中.添加1×TAE电泳缓冲液至没过胶板为止. 3.加样: 样品制备：（10ul体系/样品槽）于0.25ml离心管中 样品RNA（最后加）:2ul/3ul/5ul 6×DNA loading buffer:10/6=1.7ul 100×Sybergreen：0.1ul DEPC水：至10ul (注意:加样前要先记下加样的顺序).分别将样品加入胶板的样品小槽内,每加完一个样品,应更换一个枪头,以防污染,加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面. 4.电泳: 加样后的凝胶板立即通电进行电泳,电压60-100V,样品由负极(黑色)向正极(红色)方向移动.电压升高,琼脂糖凝胶的有效分离范围降低.当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时,停止电泳. 5.电泳完毕后,取出凝胶,利用科212凝胶成像系统,在紫外灯（trans UV）下观察拍照 保存.DNA存在则显示出红色荧光条带.RNA完美提出应该是三条带：28，18,5.8。 28和18比较亮,而且28是18亮度的2倍,5.8基本很模糊，可有可无
常见缓冲液的配方
一.常用贮液与溶液 1mol/L亚精胺（Spermidine）: 溶解2.55g亚精胺于足量的水中，使终体积为10ml。分装成小份贮存于-20℃。 1mol/L精胺（Spermine）：溶解3.48g精胺于足量的水中，使终体积为10ml。分装成小份贮存于-20℃。 10mol/L乙酸胺（ammonium acetate）：将77.1g乙酸胺溶解于水中，加水定容至1L后，用0.22um孔径的滤膜过滤除菌。 10mg/ml牛血清蛋白(BSA）：加100mg的牛血清蛋白（组分V或分子生物学试剂级，无DNA酶）于9.5ml水中（为减少变性， 须将蛋白加入水中，而不是将水加入蛋白），盖好盖后，轻轻摇动，直至牛血清蛋白完全溶解为止。不要涡旋混合。加水定容到10ml，然后分装成小份贮存于-20℃。 1mol/L二硫苏糖醇（DTT）：在二硫苏糖醇5g的原装瓶中加32.4ml水，分成小份贮存于-20℃。或转移100mg的二硫苏糖醇至微量离心管，加0.65ml的水配制成1mol/L二硫苏糖醇溶液。 8mol/L乙酸钾（potassium acetate）：溶解78.5g乙酸钾于足量的水中，加水定容到100ml。 1mol/L氯化钾（KCl）：溶解7.46g氯化钾于足量的水中，加水定容到100ml。3mol/L乙酸钠（sodium acetate）：溶解40.8g的三水乙酸钠于约90ml水中，用冰乙酸调溶液的pH至5.2，再加水定容到100ml。 0.5mol/L EDTA:配制等摩尔的Na2EDTA和NaOH溶液（0.5mol/L），混合后形成EDTA的三钠盐。或称取186.1g的Na2EDTA?2H2O和20g的NaOH，
PCR扩增技术与琼脂糖凝胶电泳检测
实验五 PCR扩增技术与琼脂糖凝胶电泳检测 一、实验目的 1. 掌握PCR扩增技术的基本原理 2. 掌握PCR的常规操作 3. 熟悉PCR反应体系中几种主要成分的作用 4. 了解PCR技术的应用 5. 掌握琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的方法 6. 熟悉DNA在电泳过程中迁移率的决定因素 二、实验原理 1. PCR基本原理 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于在体外快速扩增DNA，类似DNA的细胞内复制过程:由一对引物介导，通过温度的调节，使双链DNA变性为单链DNA、单链DNA能与引物复性（退火）成为引物-DNA单链复合物、以及在dNTPs存在下DNA聚合酶能使引物沿单链模板延伸成为双链DNA（引物的延伸）；这种热变性-复性-延伸的过程，就是一个PCR循环；一般通过20-30个循环之后，就可获得大量（106倍）的要扩增的DNA片段。 PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成： ①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； ②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； ③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。 重复循环“变性—退火—延伸”三个过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 2. PCR反应体系 3. 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳是分离、纯化、鉴定DNA片断的典型方法，其特点为简便、快速。DNA 片断琼脂糖凝胶电泳的原理与蛋白质的电泳原理基本相同，DNA分子在高于其等电点的pH 溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。DNA分子在电场中通过介质而泳动，除电荷效应外，凝胶介质还有分子筛效应，与分子大小及构想有关。对于线形DNA分子，其电场中的迁移率与其分子量的对数值成反比。在凝胶中加入少量溴化乙锭（有毒！），其分子可插入DNA的碱基之间，形成一种光络合物，在254~365nm波长紫外光照射下，呈现桔红色的
生物化学常用缓冲液
生物化学常用缓冲液 （一）基本概念 ⑴ Bronsted-Lowry酸碱理论（酸碱质子理论）: 1923年由丹麦化学家J.N.Brφnsted和英国化学家T.M.Lowry同时提出了酸碱质子学说，认为凡能释放质子的分子或离子（如：H2O，HCl，NH4+，HSO4- 等）称为酸，凡能接受质子的分子或离子（如：H2O，NH3，Cl-等）称为碱。因此，一种酸释放质子后即成为碱，称为该酸的共轭碱，同样一种碱与质子结合后，形成对应的酸，称为该碱的共轭酸。 如盐酸在水中的解离： HCl Cl- ＋H+ HCl是酸，Cl-是它的共轭碱。 pH = pKa+log{[质子受体]/[质子供体]} ⑵缓冲体系的设计： 1960年，N.E.Good和他的同事们提出，适合生命科学研究使用的缓冲体系应具有以下特性： ① pKa值在6-8之间； ②在水中的溶解度高； ③不易穿透生物膜； ④盐效应小； ⑤离子浓度、溶液组成和温度对解离的影响小； ⑥不与金属离子生成复合物或沉淀； ⑦该缓冲剂化学稳定； ⑧紫外和可见光波长范围内光吸收小； ⑨易制得高纯度的盐。 （二）生物化学常用缓冲液 ⑴磷酸盐缓冲液： 磷酸盐是生物化学研究中使用最广泛的一种缓冲剂，由於它们是二级
解离，有二个pKa值，所以用它们配制的缓冲液，pH范围最宽： NaH2PO4： pKa1＝2.12， pKa2＝7.21 Na2HPO4： pKa1＝7.21， pKa2＝12.32 配酸性缓冲液：用NaH2PO4，pH＝1-4， 配中性缓冲液：用混合的两种磷酸盐，pH＝6-8， 配碱性缓冲液：用Na2HPO4，pH＝10-12。 用钾盐比钠盐好，因为低温时钠盐难溶，钾盐易溶，但若配制SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的缓冲液时，只能用磷酸钠而不能用磷酸钾，因为SDS（十二烷基硫酸钠）会与钾盐生成难溶的十二烷基硫酸钾。 磷酸盐缓冲液的优点为： ①容易配制成各种浓度的缓冲液； ②适用的pH范围宽； ③pH受温度的影响小； ④缓冲液稀释后pH变化小，如稀释十倍后pH的变化小于0.1。 其缺点为： ①易与常见的钙Ca++离子、镁Mg++离子以及重金属离子缔合生成沉淀； ②会抑制某些生物化学过程，如对某些酶的催化作用会产生某种程度的抑制作用。 ⑵ Tris（三羟甲基氨基甲烷）缓冲液： Tris缓冲液在生物化学研究中使用的越来越多，有超过磷酸盐缓冲液的趋势，如在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中已都使用Tris缓冲液，而很少再用磷酸盐。 Tris缓冲液的常用有效pH范围是在“中性”范围，例如： Tris-HCl缓冲液： pH＝7.5-8.5 Tris-磷酸盐缓冲液： pH＝5.0-9.0 Tris-HCl缓冲液的优点是： ①因为Tris的碱性较强，所以可以只用这一种缓冲体系配制pH范围由
DNA电泳相关试剂及缓冲液的配制
DNA 电泳相关试剂及缓冲液的配制
1. 0.5M EDTA(pH=8.0):在800ml 蒸馏水中加入186.1g 二水乙二胺四乙酸钠（EDTA-Na 2·2H 2O),充分搅拌，这时溶液为乳白色，加NaOH 调解pH 值至8.0，这时溶液颜色逐渐变为澄清。最后 定容至1L 。高压灭菌。 2. 5 X TBE:Tris 碱54g;硼酸27.5g;20ml0.5M EDTA(pH=8.0),加蒸馏水定容至1L 。高压灭菌。（不过我在实验中没有灭菌，实验结果影响不大）。1 X TBE:5 X TBE 缓冲液与蒸馏水按 1: 4 稀释就OK 。 配置方法方法1：1%的溴酚蓝 将托盘天平上称取1g 溴酚蓝定溶于100ml 无水乙醇中，转移入 滴瓶中，贴标签备用。 方法2：0.05% 的溴酚蓝 配western blot 用的2*SDS 上样缓冲液需要用到0.1% 的溴酚蓝，
2-DE中溴酚蓝一般也是配成0.1%母液。实际上，溴酚蓝在水中的溶解度不高，直接将0.1g溴酚蓝溶于100ml水是有困难的。下面是其较合适的配制方法： 0.05%的溴酚蓝配制方法：取溴酚蓝0.1g，加0.05mol/L氢氧化钠溶液3.0ml使溶解，再加水稀释至200ml，即得。变色范围pH2.8～4.6（黄→蓝绿）。只是不知道加入NaOH会不会影响2-DE实验。估计影响不大，因为指示剂用量毕竟很少。 方法3：1％溴酚蓝 加1g水溶性钠型溴酚蓝于100ml水中，搅拌或涡旋混合直到完全溶解。溴酚蓝其钠盐易溶解在水里。 相关词条 甲醇、乙醇、苯、有机化学、氢氧化钠 Western上样缓冲液配制整理
琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳 1.原理 琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。其分析原理与其他支持物电泳最主要区别是：它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。 琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。但由于其孔径相当大，对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道，现广泛应用于核酸的研究中。 蛋白质和核酸会根据pH不同带有不同电荷，在电场中受力大小不同，因此跑的速度不同，根据这个原理可将其分开。电泳缓冲液的pH在6~9之间，离子强度0.02~0.05为最适。常用1%的琼脂糖作为电泳支持物。琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段，其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离范围广。普通琼脂糖凝胶分离DNA的范围为0.2-20kb，利用脉冲电泳，可分离高达10^7bp的DNA片段。 DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速率向正极方向移动。 2操作流程 准备干净的配胶板和电泳槽 琼脂糖凝胶电泳：水平电泳 注意DNA酶污染的仪器可能会降解DNA，造成条带信号弱、模糊甚至缺失的现象。 (1)电泳方法
一般的核酸检测只需要琼脂糖凝胶电泳就可以；如果需要分辨率高的电泳，特别是只有几个bp的差别应该选择聚丙烯酰胺凝胶电泳；用普通电泳不合适的巨大DNA链应该使用脉冲凝胶电泳。注意巨大的DNA链用普通电泳可能跑不出胶孔导致缺带。 (2)凝胶浓度 对于琼脂糖凝胶电泳，浓度通常在0.5～2%之间，低浓度的用来进行大片段核酸的电泳，高浓度的用来进行小片段分析。低浓度胶易碎，小心操作和使用质量好的琼脂糖是解决办法。注意高浓度的胶可能使分子大小相近的DNA带不易分辨，造成条带缺失现象。 (3)缓冲液 常用的缓冲液有TAE和TBE，而TBE比TAE有着更好的缓冲能力。电泳时使用新制的缓冲液可以明显提高电泳效果。注意电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲性能下降，可能使DNA电泳产生条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。 三羟甲基氨基甲烷（Tris(hydroxymethyl)aminomethane，一般简称为Tris）是一种有机化合物，其分子式为(HOCH2)3CNH2。Tris被广泛应用于生物化学和分子生物学实验中的缓冲液的制备。例如，在生物化学实验中常用的TAE和TBE 缓冲液（用于核酸的溶解）都需要用到Tris。 (4)电压和温度 电泳时电压不应该超过20V/cm，电泳温度应该低于30℃，对于巨大的DNA 电泳，温度应该低于15℃。注意如果电泳时电压和温度过高，可能导致出现条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。特别是电压太大可能导致小片段跑出胶而出现缺带现象 (5)DNA样品的纯度和状态 注意样品中含盐量太高和含杂质蛋白均可以产生条带模糊和条带缺失的现象。乙醇沉淀可以去除多余的盐，用酚可以去除蛋白。注意变性的DNA样品可能导致条带模糊和缺失，也可能出现不规则的DNA条带迁移。在上样前不要对DNA样品加热，用20mM NaCl缓冲液稀释可以防止DNA变性。 (6)DNA的上样
琼脂糖凝胶电泳的操作步骤
琼脂糖凝胶电泳的操作步骤如下： 1. 制备1%琼脂糖凝胶(大胶用70ml,小胶用50ml):称取0.7 g(0.5 g)琼脂糖置于锥形瓶中,加入70 ml(50ml)1×TAE,瓶口倒扣小烧杯.微波炉加热煮沸3次至琼脂糖全部融化,摇匀,即成1.0%琼脂糖凝胶液. 2. 胶板制备:取电泳槽内的有机玻璃内槽(制胶槽)洗干净,晾干,放入制胶玻璃板.取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好,形成模子.将内槽置于水平位置,并在 固定位置放好梳子.将冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻 璃板上,使胶液缓慢展开,直到整个玻璃板表面形成均匀胶层.室温下静置直至凝 胶完全凝固,垂直轻拔梳子,取下胶带,将凝胶及内槽放入电泳槽中.添加 1×TAE电泳缓冲液至没过胶板为止. 3. 加样:在点样板或parafilm上混合DNA样品和上样缓冲液,上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1X.用10 ul微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内, 每加完一个样品,应更换一个加样头,以防污染,加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面.(注意:加样前要先记下加样的顺序). 4. 电泳:加样后的凝胶板立即通电进行电泳,电压60-100V,样品由负极(黑色)向正极(红色)方向移动.电压升高,琼脂糖凝胶的有效分离范围降低.当溴酚蓝移动 到距离胶板下沿约1cm处时,停止电泳. (5)电泳完毕后,取出凝胶,用含有0.5 ug/ml的溴化乙锭1×TAE溶液染色约20 min,再用清水漂洗10 min. (6)观察照相:在紫外灯下观察,DNA存在则显示出红色荧光条带,采用凝胶成像系统拍照保存 实验原理 闭合环状质粒、线性质粒和开环质粒DNA由于构形不同，在加溴化乙锭的琼脂糖凝胶电泳上呈现不同的迁移率，因而在紫外灯下观察，能区别闭合环状质粒DNA（cccDNA）、线性质粒DNA（L-DNA）和开环质粒DNA（ocDNA）。 实验材料和试剂 （一）实验样品 质粒pUC118 （二）试剂 1．l DNA/HindIII分子量标准 2．溴酚蓝指示剂点样缓冲液 0.2% 溴酚蓝 50% 蔗糖 3．1mg/ml溴化乙锭溶液 4．电泳缓冲液（TAE） 40 mmol/L Tris-乙酸 1 mol/L EDTA (配制方法：24.2克Tris碱，5.71ml冰乙酸，10ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)，定容至5000ml） 5．0.7% 琼脂糖凝胶
缓冲液的配制方法
核酸电泳相关试剂、缓冲液的配制方法 50×TAE Buffer (pH8.5) 组份浓度 2 M Tris-醋酸，100 mM EDTA 配制量 1 L 配制方法 3.加入57.1 ml的乙酸，充分搅拌。 4.加去离子水将溶液定容至l L后，室温保存。 10×TBE Buffer (pH8.3) 组份浓度 890 mM Tris-硼酸，20 mM EDTA 配制量 1 L 配制方法 3.加去离子水将溶液定容至l L后，室温保存。 10×MOPS(3-吗啉基丙磺酸)Buffer 组份浓度 200 rnM MOPS，20 mM NaOAc，10 mM EDTA 配制量 1 L 配制方法 1.称41.8 g MOPS，置于1 L烧杯中。 2.加约700 ml DEPC处理水，搅拌溶解。 3.使用2 N NaOH调节pH值至7.0。 6.用0.45 m滤膜过滤除去杂质。 7.室温避光保存。 注：溶液见光或高温灭菌后会变黄。变黄时也可使用，但变黑时不要使用。 溴乙锭 (10 mg/ml) 组份浓度 10 mg/ml溴乙锭 配制量 100 ml 配制方法 1.称量1 g溴乙锭，加入到100 ml容器中。 2.加入去离子水100 ml，充分搅拌数h完全溶解溴乙锭。 3.将溶液转移至棕色瓶中，室温避光保存。 4.溴乙锭的工作浓度为0.5 g/ml。
注意：溴乙锭是一种致癌物质，必须小心操作。 Agarose凝胶 配制方法 1.配制适量的电泳及制胶用的缓冲液(通常是0.5×TBE或1×TAE)。 2.根椐制胶量及凝胶浓度，准确称量琼脂糖粉，加入适当的锥形瓶中。 3.加入一定量的电泳缓冲液(总液体量不宜超过锥形瓶的50%容量)。 注：用于电泳的缓冲液和用于制胶的缓冲液必须统一。 4.在锥形瓶的瓶封上保鲜膜，并在膜上扎些小孔，然后在微波炉中 加热熔化琼脂糖。加热过程中，当溶液沸腾后，请戴上防热手套。 小心摇动锥形瓶。使琼脂糖充分均匀熔化。此操作重复数次，直 至琼脂糖完全熔化。必须注意，在微波炉中加热时间不宜过长， 每次当溶液起泡沸腾时停止加热，否则会引起溶液过热暴沸，造 成琼脂糖凝胶浓度不准，也会损坏微波炉。熔化琼脂糖时，必须 保证琼脂糖充分完全熔化，否则，会造成电泳图像模糊不清。 5.使溶液冷却至60℃左右，如需要可在此时加入溴乙锭溶液(终浓 度0.5 μg/ml)。并充分混匀。 注：溴乙锭是一种致癌物质。使用含有溴乙锭的溶液时，请戴好手套。 6.将琼脂糖溶液倒入制胶模中，然后在适当位置处插上梳子。凝胶 厚度一般在3~5 min之间。 7.在室温下使胶凝固(大约30 min~1 h)，然后放置于电泳槽中进行电泳。 注：凝胶不立即使用时，请用保鲜膜将凝胶包好后在4℃下保存， 一般可保存2~5天。 琼脂糖凝胶浓度与线形DNA的最佳分辨范围 6× Loading Buffer(DNA电泳用) 组份浓度
琼脂糖凝胶电泳技术
电泳检测技术是指利用带电颗粒在电场中能向异性电极泳动这一现象来分离、纯化或分析检测供试品的一种生物化学技术。 原理：许多生物分子都带有电荷，在电场作用下可发生移动，由于混合物中各组分所带电荷性质、数量以及相对分子质量各不相同，使在同一电场作用下，各组分的泳动方向和速率也各有差异，所以在一定时间内，它们移动距离不同，从而可达到分离鉴定的目的。 DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，包括电荷效应和分子筛效应。 琼脂糖是由天然的琼脂加工制得，是一种直链杂聚多糖，溶于热水，形成溶胶，冷却后成为孔径范围从50nm到大于200nm的大网孔径凝胶。由于孔径较大，对一般蛋白质不起分子筛作用，该电泳技术是目前分离、分析DNA片段的标准方法。 DNA琼脂糖凝胶电泳的原理 DNA 分子是两性电解质，在高于其等电点的溶液（pH8.0~pH8.3 DNA分子本身的大小和构型、凝胶浓度决定了DNA分子的迁移速度。）中，碱基几乎不解离，磷酸基团全部解离，DNA 分子带负电荷，在电场中向正极移动。 DNA分子大小对迁移速率的影响：相对分子质量大，迁移慢；相对分子质量小，迁移快。DNA分子构型对迁移速率的影响：迁移速度：闭环﹥直链DNA﹥开环DNA。 琼脂糖凝胶浓度的影响：同样大小的线性DNA片段，在不同浓度的琼脂糖凝胶中的迁移速度不同，浓度越大，迁移的越慢 常用的电泳上样缓冲液含溴酚蓝，有的还含有二甲苯青，这些指示剂可以指示电泳的速度。溴化乙淀（EB）是核酸的染色剂，能插入DNA分子中形成荧光结合物，EB在紫外线照射下的发射荧光。荧光的强度与DNA的含量成正比，从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置及估计出待测样品的浓度。 EB是强致癌剂。 电泳操作步骤(整个过程要求带一次性手套 1、胶槽准备 ①将凝胶托盘放入制胶盒中; ②将加样梳垂直插入到制胶盒的小凹槽内，梳齿底端和凝胶托盘有1mm的间隙; ③将制胶盒放在调整好的水平台上。 2、凝胶准备用1×TAE配制1％琼脂糖凝胶。 ①称0.15g琼脂糖置三角瓶中，加15ml 1×TAE; ②微波炉加热大约1分钟，熔化琼脂糖; ③熔化的琼脂糖自然冷却到60～70℃时，加入DNA染料，并轻轻混匀。 3、倒胶：将冷却致60℃的凝胶倒入准备好的制胶盒内，凝胶厚度3～5mm,室温下静置半小时左右冷却，凝胶固化。 4、轻轻拔出固定在凝胶中的加样梳。将带凝胶的凝胶托盘置于电泳槽中，并使样品孔位于电场负极，向电泳槽中加入1×TAE电泳缓冲液，越过凝胶表面即可,出去样品孔的气泡。 6、样品准备：向核酸样品中加入约为样品体积1/10的上样缓冲液，用加样器轻轻混匀。 7、上样：用加样器吸取样品，轻轻的加入到凝胶的样品孔中。加样量一般5-7μl。 8、盖上电泳槽，接通电源，开始电泳。 开始电泳前，再次确认凝胶样品孔处于电场的负极。 电泳条件：5v/cm；时间20-30分钟左右 9、电泳结束后，切断电源，取出凝胶。
生物化学常用缓冲液
生物化学常用缓冲液 ⑴ 磷酸盐缓冲液 磷酸盐是生物化学研究中使用最广泛的一种缓冲剂，由於它们是二级解离，有二个pK a 值，所以用它们配制的缓冲液，pH范围最宽： NaH 2PO 4 ： pK a1 ＝2.12， pK a2 ＝7.21 Na 2HPO 4 ： pK a1 ＝7.21， pK a2 ＝12.32 配酸性缓冲液：用 NaH 2PO 4 ，pH＝1～4， 配中性缓冲液：用混合的两种磷酸盐，pH＝6～8， 配碱性缓冲液：用 Na 2HPO 4 ，pH＝10～12。 用钾盐比钠盐好，因为低温时钠盐难溶，钾盐易溶，但若配制SDS-聚丙烯 酰胺凝胶电泳的缓冲液时，只能用磷酸钠而不能用磷酸钾，因为SDS（十二烷基硫酸钠）会与钾盐生成难溶的十二烷基硫酸钾。 磷酸盐缓冲液的优点为：①容易配制成各种浓度的缓冲液；②适用的pH范围宽；③pH受温度的影响小；④缓冲液稀释后pH变化小，如稀释十倍后pH的 变化小于0.1。 其缺点为：①易与常见的钙Ca++离子、镁Mg++离子以及重金属离子缔合生成沉淀；②会抑制某些生物化学过程，如对某些酶的催化作用会产生某种程度的抑制作用。 ⑵Tris（三羟甲基氨基甲烷，N-Tris(hydroxymethyl)aminomethane）缓冲 液 Tris缓冲液在生物化学研究中使用的越来越多，有超过磷酸盐缓冲液的趋势，如在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中已都使用Tris缓冲液，而很少再用磷酸盐。 Tris缓冲液的常用有效pH范围是在“中性”范围，例如： Tris-HCl缓冲液： pH＝7.5～8.5 Tris-磷酸盐缓冲液： pH＝5.0～9.0 配制常用的缓冲液的方法有两种：①按书后附录中所列该缓冲液表中的方法，分别配制0.05mol/L Tris和0.05mol/L HCl溶液，然后按表中所列体积混合。由于标准浓度的稀盐酸不易配制，所以常用另一种方法；②若配1L 0.1mol/L 的Tris-HCl缓冲液：先称12.11g Tris碱溶于950mL～970mL 无离子水中，边 搅拌边滴加4N HCl，用pH计测定溶液pH值至所需的pH值，然后再加水补足到1L。 Tris-HCl缓冲液的优点是：①因为Tris碱的碱性较强，所以可以只用这 一种缓冲体系配制pH范围由酸性到碱性的大范围pH值的缓冲液；②对生物化学过程干扰很小，不与钙、镁离子及重金属离子发生沉淀。 其缺点是：①缓冲液的pH值受溶液浓度影响较大，缓冲液稀释十倍，pH值的变化大于0.1；②温度效应大，温度变化对缓冲液pH值的影响很大，即： △pK a ／℃＝－0.031 ，例如：4℃时缓冲液的pH＝8.4，则37℃时的pH＝7.4，所以一定要在使用温度下进行配制，室温下配制的Tris-HCl缓冲液不能用于 0℃～4℃。③易吸收空气中的CO 2 ，所以配制的缓冲液要盖严密封。④此缓冲液对某些pH电极发生一定的干扰作用，所以要使用与Tris溶液具有兼容性的电极。
凝胶电泳缓冲液的配制
2．测序凝胶加样缓冲液 98%去离子甲酰胺 10mol/L EDTA(pH8.0) 0.025%二甲苯青FF 0.025%溴酚蓝 甲酰胺：许多批号的试剂级甲酰胺，其纯度符合使用要求，无须再进行处理。不过，一旦略呈黄色，则应用在磁力搅拌器上将甲酰胺与Dowex XG8混合床树脂共同搅拌1小时进行去离子处理，并用Whatman 1号滤纸过滤2次，去离子甲酰胺分装成小份，充氮存于-70℃。 3．常用的电泳缓冲液
说明： ①TBE溶液长时间存放后会形成沉淀物，为避免这一问题，可在室温下用玻璃瓶保存5×溶液，出现沉淀后则予以废弃。 以片都以1×TBE作为使用液（即1：5稀释浓贮液）进行琼脂糖凝胶电泳。但0.5×的使用液已具备足够的缓冲容量。目前几乎所有的琼脂糖胶电泳都以1：10稀释的贮存液作为使用液。 进行聚丙烯酰胺凝胶垂直槽的缓冲液槽较小，故通过缓冲液的电流量通常较大，需要使用1×TBE以提供足够的缓冲容量。 ②碱性电泳缓冲液应现用现配。 ③Tris-甘氨酸缓冲液用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。 4．2×SDS凝胶加样缓冲液 100mmol/L Tris·HCl(6.8) 200mmol/L二硫苏糖醇（DTT） 4%SDS（电泳级） 0.2%溴酚蓝 20%甘油 不含DTT的2×SDS凝胶加样缓冲液可保存于室温，应在临用前取1mol/L 贮存液现加于上述缓冲液中。 5．凝胶加样缓冲液
使用以上凝胶加样缓冲液的目的有三：增大样品密度；以确保DNA均匀进入样品孔内；使样品呈现颜色，从而使加样操作更为便利，含有在电块中能以可预知速率向阳极泳动的染料。溴酚蓝在琼脂糖中移动的速率约为二甲苯青FF的2. 2倍，而与琼脂糖浓度无关。以0.5×TBF作电泳液时，溴酚蓝在琼脂糖中的泳动速率约与长300bp的双链线状DNA相同，而二甲苯青FF的泳动则与长4kb的双链线状DNA相同。在琼脂糖浓度为0.5%～1.4%的范围内，这些对应关系受凝胶浓度变化的影响并不显著。 选用哪一种加样染料纯属个人喜恶。但是，对于碱性凝胶应当使用溴甲酚绿作为示踪染料，因为在碱性pH条件下其显色较溴酚更蓝为鲜明。
琼脂糖凝胶电泳注意事项及操作流程1
琼脂糖凝胶电泳注意事项及操作流程 凝胶电泳操作注意事项： 1.缓冲系统：在没有离子存在时，电导率最小，DNA不迁移，或迁移极慢，在高离子强度的缓冲液中，电导很高并产热，可能导致DNA变性，因此应注意缓冲液的使用是否正确。长时间高压电泳时，常更新缓冲液或在两槽间进行缓冲液的循环是可取的。 2.琼脂糖：不同厂家、不同批号的琼脂糖，其杂质含量不同，影响DNA的迁移及荧光背景的强度，应有选择地使用。 3.凝胶的制备：凝胶中所加缓冲液应与电泳槽中的相一致，溶解的凝胶应及时倒入板中，避免倒入前凝固结块。倒入板中的凝胶应避免出现气泡，影响电泳结果。 4.样品加入量：一般情况下，0.5cm宽的梳子可加0.5ug的DNA量，加样量的多少依据加样孔的大小及DNA中片段的数量和大小而定，过多的量会造成加样孔超载，从而导致拖尾和弥散，对于较大的DNA此现象更明显。 5.电泳系统的变化会影响DNA的迁移，加入DNA标准参照物进行判定是必要的。 6.DNA样品中盐浓度会影响DNA的迁移率，平行对照样品应使用同样的缓冲条件以消除这种影响。 7.DNA迁移率取决于琼脂糖凝胶的浓度，迁移分子的形状及大小。采用不同浓度的凝胶有可能分辨范围广泛的DNA分子，制备琼脂糖凝胶可根据DNA分子的范围来决定凝胶的浓度。小片段的DNA电泳应采用聚丙烯酰胺凝胶电泳以提高分辨率。
琼脂糖加样时候注意事项： 1、用移液抢将样品加至点样孔。每孔点样的体积一般少于25ul，因此吸取每一个样品时，操作要稳当且细心。 2、常加一定量的蔗糖来增加样品的浓度，以使每个样品停留在各自的点样孔中。 3、在样品中加入水溶性的阴离子追踪染料（如溴酚蓝），用以看出样品移动的距离。 4、在一个或几个孔中加入标准分子质量样品，电泳结束后，根据已知分子质量的带的相应位置可用来做出标准曲线。 5、电泳一般是在追踪染料泳动到胶的80%部位时停止。注意电泳期间，电泳槽盖要安全盖好，以防止液体蒸发，又可以降低电击的可能性。 6、电泳结束后，将胶浸没在1mg/L的溴化乙锭（EB）中，5min后即可看到DNA 带，EB通过插入在双螺旋的配对核苷酸之间同NDA结合。另一种方法是电泳时，在胶中加入EB。 7、在紫外灯下，由于EB发出强烈的橘红色的荧光，所以可以看到DNA带。利用这种方法检测的界限是每条带约10ng DNA。带上塑料安全眼镜可防止紫外光对眼睛的伤害。可用尺子来测量每条带至点样孔的距离。同样，利用特制的照相机和调焦器，也可以对凝胶拍照。 8、如果要对某一条带（如质粒）进一步分析，可用小刀将含该带的凝胶切割下来，从带中回收DNA。
琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA片段
实验十四琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA片段 一、原理 DNA分子在碱性环境中(PH8.3缓冲液)带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。不同的DNA片段由于其电荷、分子质量及构型的不同在电泳时泳动的速率就不同，从而可以分出不同的区带。电泳后经gelview染色，在波长254nm紫外光照射下，单链DNA显红色荧光，双链DNA显绿色荧光。也可染RNA。 二、试剂： 1.琼脂糖 2.TBE缓冲液：0.89M Tris—0.89M H3BO3(硼酸)—0.02M EDTA，pH8.3；称取10.880 g Tris，5.520 g硼酸，0.740g EDTA·Na2·2H2O，溶于无离子水中，定容至200ml，用时稀释10倍。 3.溴乙啶贮存液：5g/L，纯水配制，不需消毒。贮棕色瓶于4℃保存。 4.DNA样品液：实验所提取的DNA或前面PCR产物 5.上样缓冲液：40%蔗糖，0.25%溴酚蓝；或Loading buffer 6.无离子水 三、仪器： 微波炉，封口膜(胶)，电泳仪及槽，加样器、头(20ul)，紫外分析仪或凝胶成像仪 四、操作 1.制备琼脂糖溶液： 称取0.18克琼脂糖溶于30ml TBE缓冲液中，沸水浴或微波炉煮沸至琼脂糖完全溶解。将溶液冷却到60℃，加入gelview染料3ul(终浓度0.5μg/ml)。 2.制备凝胶板 用封口膜(胶)将凝胶槽缺口封住，置水平玻板或工作台面上，将梳子安放在槽的凹槽内，梳子底边须离开电泳架表面1mm左右。将琼脂糖溶液倒入电泳支架上，胶厚约3mm，冷却30分钟。待胶凝聚后小心地取出梳子，将凝胶放入装有TBE缓冲液的电泳槽中，TBE缓冲液要浸没过凝胶面2mm-3mm。 3.加样 将样品(样品液∶上样缓冲液=5∶1)小心加入胶板的加样孔内，加样量不宜
电泳缓冲液的作用
电泳缓冲液的作用 缓冲液在电泳过程中的一个作用是维持合适的pH。电泳时正极与负极都会发生电解反应，正极发生的是氧化反应（4OH--4e->2H2O+O2)，负极发生的是还原反应（4H++4e->2H2)，长时间的电泳将使正极变酸，负极变碱。一个好的缓冲系统应有较强的缓冲能力，是溶液两极的pH保持基本不变。电泳缓冲液的另一个作用是使溶液具有一定的导电性，以利于DNA 分子的迁移，例如，一般电泳缓冲液中应含有0.01-0.04mol/L的Na+离子，Na+离子的浓度太低时电泳速度变慢；太高时就会造成过大的电流使胶发热甚至熔化。电泳缓冲液还有一个组分是EDTA，加入浓度为1-2mmol/L，目的是螯合Mg2+ 等离子，防止电泳时激活DNA 酶，此外还可防止Mg2+离子与核酸生成沉淀。 TAE是使用最广泛的缓冲系统。其特点是超螺旋在其中电泳时更符合实际相对分子质量（TBE中电泳时测出的相对分子质量会大于实际分子质量），且双链线状DNA在其中的迁移率较其他两种缓冲液快约10%，电泳大于13kb的片段时用TAE缓冲液将取得更好的分离效果，此外，回收DNA片段时也易用TAE缓冲系统进行电泳。TAE的缺点是缓冲容量小，长时间电泳（如过夜）不可选用，除非有循环装置使两极的缓冲液得到交换。 TBE的特点是缓冲能力强，长时间电泳时可选用TBE，并且当用于电泳小于1kb的片段时分离效果更好。TBE用于琼脂糖凝胶时易造成高电渗作用，并且因与琼脂糖相互作用生成非共价结合的四羟基硼酸盐复合物而使DNA片段的回收率降低，所以不宜在回收电泳中使用。TPE的缓冲能力也较强，但由于磷酸盐易在乙醇沉淀过程中析出，所以也不宜在回收DNA片段的电泳中使用。