土壤微生物量测定方法

土壤微生物量测定方法

一、土壤微生物生物量碳（氯仿熏蒸－K2SO4提取-碳分析仪器法）

1、试剂

（1）去乙醇氯仿制备：在通风橱中，将分析纯氯仿与蒸馏水按1 ? 2（v : v）加入分液漏斗中，充分摇动1 min，慢慢放出底层氯仿于烧杯中，如此洗涤3次。得到的无乙醇氯仿中加入无水氯化钙，以除去氯仿中的水分。纯化后的氯仿置于试剂瓶中，在低温（4℃）、黑暗状态下保存。

（2）氢氧化钠溶液[c（NaOH）= 1 mol L-1]：通常分析纯固体氢氧化钠中含有碳酸钠，与酸作用时生成二氧化碳，从而影响滴定终点判断和测定的准确度。配制时应先除去碳酸钠，根据碳酸钠不溶于浓碱，可先将氢氧化钠配成50%（w : v）的浓氧溶液，密闭放置3～4 d。待碳酸钠沉降后，取56 ml 50%氢氧化钠上清液（约19 mol L-1），用新煮沸冷却的除去二氧化碳的蒸馏水释稀到1 L，即为浓度1 mol L-1 NaOH溶液，用橡皮塞密闭保存。

（3）硫酸钾提取剂[c（K2SO4）= mol L-1]：取1742.5 g分析纯硫酸钾，用研钵磨成粉末状，倒于25 L塑料桶中，加蒸馏水至20 L，盖紧螺旋盖置于摇床（150 r min-1）上溶解24 h 即可。

（4）六偏磷酸钠溶液[ρ（Na）= 5 g 100 ml-1，pH ]：称取50.0 g分析纯六偏磷酸钠溶于800 ml高纯度去离子水中，用分析纯浓磷酸调节至pH ，用高纯度去离子水定容至1 L。要注意的是六偏磷酸钠溶解速度很慢应提前配制；由于其易粘于烧杯底部，若加热常因受热不均使烧杯破裂。

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（5）过硫酸钾溶液[ρ（K2S2O8）= 2 g 100 ml-1]：称取20.0 g分析纯过硫酸钾，溶于高纯度去离子水中，定容至1 L。值得注意过硫酸钾溶液易被氧化，应避光存放且最多使用7 d。

（6）磷酸溶液[ρ（H3PO4）= 21 g 100 ml-1]：量取37 ml 分析纯浓磷酸（85%），慢慢加入到188 ml高纯度去离子水中即可。

（7）邻苯二甲酸氢钾标准溶液[ρ（）= 1000 mg C L-1]）：取2.1254 g经105℃烘2～3 h的分析纯邻苯二甲酸氢钾，溶于高纯度去离子水，定容至1 L。

2、仪器设备

碳–自动分析仪（Phoenix 8000）、容量瓶（100 ml）、振荡器（300 r min-1）、可调加液器（50 ml）、可调移液器（5 ml）、烧杯（盛滤液用）（50~100 ml）、聚乙烯提取瓶（100，150 ml），聚乙烯塑料桶（20 L，带螺旋盖），三角瓶（150 ml）、其它常规仪器。

3、操作步骤

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（1）土样前处理

新鲜土壤应立即处理或保存于4℃冰箱中，测定前先仔细除去土样中可见植物残体（如根、茎和叶）及土壤动物（如蚯蚓等），过筛（孔径< 2 mm），彻底混匀。如果土壤过湿，应在室内适当风干，以手感湿润疏松但不结块为宜（约为饱和持水量的40%）。如果土壤过于干燥，用蒸馏水调节至饱和持水量的40%。将土壤置于密封的大塑料桶内在25℃条件下预培养7～15 d，桶内有适量水以保持相对湿度为100%，并在桶内放一小杯1 mol L-1 NaOH 溶液以吸收土壤呼吸产生的CO2。经过预培养的土壤应立即分析。如需保留，应放置于4℃

的冷藏箱中，下次使用前需要在上述条件下至少培养24 h。这些过程是为了消除土壤水分限制对微生物的影响，以及植物残体对测定的干扰。

土壤饱和持水量按Shaw（1958）的方法测定：在圆型漏斗下端装一带夹子的橡皮管，漏斗内塞玻璃纤维。取50 g土壤于漏斗中，夹紧橡皮管，加入50 ml水保持30 min。然后打开夹子，测定30 min内流出的水量。加入的水量减去流出的水量，再加上原来土壤中含有的水量，即为该土壤的饱和持水量，以烘干土壤质量百分数表示。

（2）熏蒸

称取经前处理后相当于20.0 g烘干基重的新鲜土壤(25.0g)3份于50 ml烧杯中。将烧杯放入真空干燥器中，同时放入盛有去乙醇氯仿（约2/3烧杯）的烧杯2～3个，烧杯内放入少量经浓硫酸处理洗涤后烘干的瓷片（0.5 mm大小，防瀑沸），干燥器底部加入少量水以保持湿度。用土壤熏蒸抽真空装置抽真空，在– MPa真空度下使氯仿剧烈沸腾3～5 min。关闭真空干燥器阀门，移置25℃黑暗条件下熏蒸24 h。将熏蒸过的土壤转移到另一个干净的真空干燥器中，反复抽真空（– MPa）6次，每次3 min，彻底除去土壤中的氯仿，直到无氯仿味为止。否则，残留在土壤中的氯仿将影响分析结果。熏蒸的同时，另称取等量的土壤3份，置于另一干燥器中，除不加入去乙醇氯仿进行熏蒸外，其他操作与熏蒸土壤一样，作为“对照”土壤。

（3）提取

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将熏蒸土壤无损地转移到125 ml聚乙烯提取瓶中，加入80 ml mol L-1K2SO4，土水比为1 : 4（w : v），振荡（25℃，300 r min-1）浸提30 min，用中速定量滤纸过滤于125 ml塑料瓶中。在熏蒸开始的同时，另称取等量的3份不熏蒸土壤于125 ml聚乙烯提取瓶中，加入80 ml mol L-1K2SO4同上浸提。同时做3个不加土壤的试剂空白。浸提液应立即分析，或在–18℃下保存。

要注意的是低温（–18℃）下保存的土壤浸提液解冻后会出现一些白色沉淀，据推测为CaSO4和K2SO4，对浸提液中有机碳测定没有影响，可不必除去这些白色沉淀（Brookes等，1985），但解冻后也应立即测定，且在取样前应将浸提液彻底混匀。

（4）测定

取10 ml土壤提取液于40 ml样品瓶中（注意解冻的浸提液在取样前应彻底混匀），加入10 ml六偏磷酸钠溶液（pH ），使提取液中的沉淀（CaSO4和K2SO4）全部溶解。采用Phoenix 8000碳–自动分析仪测定样液中的有机碳含量。先采用2 mm细管向样液中通入高纯度氮气5～10 min，先除去溶解在样液中的部分CO2，样液再进入无机碳排除管进一步排除残留的CO2。再进入紫外氧化室，在过硫酸钾溶液和磷酸溶液作用下样液中的有机碳全部氧化为CO2，产生的CO2经纯化后再通过红外检测器测定。详细操作步骤参见仪器使用说明。

标准碳工作曲线：分别吸取0、、、、、ml浓度为1000 mg C L-1邻苯二甲酸氢钾标准溶液于100 ml容量瓶中，用高纯度去离子水定容。即得到0、20、40、60、80、100 mg C L-1系列标准碳溶液。分别吸取上述不同浓度度的标准碳溶液10 ml于40 ml样品瓶中，按上述相同方法测定。

（5）结果计算：

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土壤微生物量碳：B C = E C / k EC

式中：E C = 熏蒸土壤提取的有机碳–不熏蒸土壤提取的有机碳

k EC为转换系数，取值。

二、土壤微生物生物量氮（氯仿熏蒸－K2SO4提取-流动注射氮分析仪器法）

1、试剂

（1）去乙醇氯仿制备：同上

（2）硫酸钾提取剂[c（K2SO4）= mol L-1]：同上

（3）硫酸铬钾还原剂：称取50.0 g分析纯硫酸铬钾[KGr?SO4?2]，溶于200 ml分析纯浓硫酸，用蒸馏水稀释到1 L。

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（4）硫酸铜溶液[c（CuSO4）= mol L-1]：称取30.324 g分析纯硫酸铜（CuSO4）溶于蒸馏水并定容至1 L。

（5）氢氧化钠溶液[c（NaOH）= 10 mol L-1]：称取400 g分析纯氢氧化钠溶于蒸馏水并定容至1 L。

（6）氢氧化钠溶液[c（NaOH）= 4 mol L-1]：称取160 g分析纯氢氧化钠溶于双蒸水并定容至1 L，使用前用真空抽滤瓶（膜孔径μm）过滤。

（7）氢氧化钠溶液[c（NaOH）= mol L-1]：取ml 4 mol L-1 NaOH用去离子水稀释至1 L。（8）硼酸溶液（ρ（H3BO4）= 2 g 100 ml-1）：称取20.0 g分析纯硼酸（H3BO4）溶于蒸馏水定容至1 L。

（9）硫酸溶液[c（H2SO4）= mol L-1]：取ml分析纯浓硫酸（H2SO4，ρ= 1.84 g ml-1）用蒸馏水稀释到1 L，此溶液H2SO4浓度为mol L-1，将该溶液稀释10倍即可得到mol L-1硫酸溶液。再用mol L-1标准硼砂溶液标定其准确浓度。

（10）标准硼砂溶液[c（Na2B4O7?10H2O）= mol L-1]：先将分析纯硼砂（Na2B4O7 ?10H2O）在55℃蒸馏水中重结晶，过滤后得到的结晶放入装有食糖和氯化钠饱和溶液烧杯的干燥器中（相对湿度70%）干燥。准确称取经重结晶和干燥的硼砂38.13672 g，溶解于蒸馏水并定容至1 L。

（11）指示剂贮存液：称取1.0 g氨混合指示剂溶解于10 ml mol L-1 NaOH和10 ml 95%乙醇混合液中，用去离子水定容至200 ml。该贮存液可存放1个月。

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（12）指示剂溶液：取10 ml指示剂贮存液用去离子水稀释并定容至500 ml，用真空抽滤瓶（膜孔径μm）过滤。注意：此溶液应使用前一天配制，最多可使用1周。

（13）标准氯化铵贮存液[ρ（NH4Cl）= 1000 μg N ml-1]：称取经105℃烘2～3小时的分析纯氯化铵3.8190 g溶于去离子水中并定容至1 L。此贮存液可稳定保存数月。

（14）标准氯化铵溶液[ρ（NH4Cl）= 50 μg N ml-1]：取10 ml 1000 μg N ml-1氯化铵用去离子水稀释至200 ml。此溶液最多保存7 d。

2、仪器设备

流动注射氮分析仪（FIAStar 5000，丹麦福斯公司）、真空抽滤瓶（膜孔径μm）、容量瓶（100 ml）、其他仪器设备同上。

3、操作步骤

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（1）土壤前处理、熏蒸、提取同上。

（2）提取液中硝态氮还原：吸取ml熏蒸与不熏蒸土壤mol L-1 K2SO4浸提液于250 ml消化管中，加入10 ml硫酸铬钾还原剂和300 mg锌粉，至少放置2 h后再消化。研究结果表明熏蒸与不熏蒸土壤提取液中硝态氮含量差异很小，在测定土壤MB-N时，可以不包括硝态氮，即省略提取液中硝态氮还原过程。

（3）消化：方法Ⅰ：吸取ml熏蒸与不熏蒸土壤mol L-1 K2SO4浸提液（或经还原反应后的浸提液）于250 ml消化管中，加入ml mol L-1 CuSO4溶液、5 ml分析纯浓硫酸、及少量防瀑沸的颗粒物（如经浓硫酸处理并洗涤后烘干的瓷片，0.5 cm大小），混合液消化变清后再回流3 h。

（4）消化液中氮测定：消化液冷却后，用去离子水洗涤转移到100 ml容量瓶中，至体积大约为70 ml，待再冷却后慢慢加入10 ml 10 mol L-1NaOH溶液中和部分H2SO4，边加边充分混匀（以免因局部碱浓度过高而引起消化液中NH4+的损失），再用去离子水定容至100 ml。溶液中NH4+含量采用流动注射氮分析仪（FIAStar 5000型）测定。采用40 μl样品圈，KTN 扩散膜（耐强酸和强碱），载液为去离子水，试剂Ⅰ为4 mol L-1 NaOH溶液，试剂Ⅱ为指示剂溶液。

校正曲线溶液制备：分别取0、、、、、、ml 50 μg N ml-1标准氯化铵溶液于100 ml容量瓶中，分别用去离子水洗涤转移1个空白消化液于容量瓶中，其余操作步骤同样品，用去离子水定容至100 ml，即得浓度分别为0、、、、、、μg N ml-1系列标准氯化铵溶液，采用测定KTN 方法模块测定和制备工作曲线，校正曲线溶液最少应每个月制备一次。其他具体操作参见仪器使用说明。

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（5）计算：

土壤MB-N= E N / k EN

式中：E N = 熏蒸土壤提取的全氮–不熏蒸土壤提取的全氮；k EN为转换系数，取值。

三、土壤微生物生物量磷（氯仿熏蒸- NaHCO3提取–P i测定–外加P i校正法）

1. 试剂

（1）磷酸二氢钾溶液[ρ（KH2PO4）= 250 μg P ml-1]：称取1.0984 g经105℃烘2～3 h的分析纯KH2PO4，溶于蒸馏水并定容至1 L。

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（2）碳酸氢钠浸提液[c（NaHCO3）= mol L-1，pH ]：称取42.0 g分析纯碳酸氢钠溶于800 ml蒸馏水，用1 mol L-1 NaOH调节溶液pH至，再蒸馏水定容至1 L。该浸提液不能放置过久，否则因释放CO2使溶液pH值升高。

（3）硫酸溶液[c（H2SO4）= mol L-1]：量取ml分析纯浓硫酸（H2SO4，ρ= 1.84 g ml-1），用蒸馏水稀释定容至500 ml即可。

（4）钼酸铵溶液[ρ?NH4?6Mo7O24 = 4 g 100 ml-1]：称取20.0 g分析纯钼酸铵溶于蒸馏水，定容至500 ml，保存于耐热玻璃瓶中。

（5）抗坏血酸溶液[c（C6H8O6）= mol L-1]：称取1.32 g抗坏血酸溶于75 ml蒸馏水即可。由于抗坏血酸极易氧化，因此必须在使用当天配制。

（6）酒石酸锑钾溶液[ρ（Sb）= 1 mg ml-1]：称取0.2743 g分析纯酒石酸锑钾溶于蒸馏水，

定容到100 ml。

（7）混合显色液配制：取上述125 ml硫酸溶液与ml钼酸铵溶液彻底混合，再加入75 ml 抗坏血酸溶液和ml酒石酸锑钾溶液，混匀。此溶液保存时间不宜超过24 h。

（8）标准磷酸二氢钾溶液[ρ（KH2PO4）= 4 μg P ml-1]：称取经105℃烘2～3 h的分析纯磷酸二氢钾0.1757 g，溶于蒸馏水，加入少量硫酸，用蒸馏水定容至1 L。得到浓度为40 μg P ml-1标准磷贮存液，置4℃条件下保存。取50 ml贮存液稀释至500 ml，即得到浓度为4 μg P ml-1标准磷溶液，此溶液不宜久存。

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2. 仪器设备

分光光度计（UV8500Ⅱ型）、离心机、塑料浸提瓶（125 ml）、容量瓶（25 ml）、烧杯（25 ml）、熏蒸、培养、提取等设备同上。

3. 操作步骤

（1）土壤前处理：同上。

（2）熏蒸和浸提：称取相当于4.0 g烘干基重经前处理的新鲜土壤(5.0g)3份，分别置于25 ml烧杯中，用去乙醇氯仿熏蒸24 h，除去氯仿。将土壤无损转入125 ml塑料提取瓶中，加入80 ml mol L-1 NaHCO3浸提液（土水比1 : 20），置于往复式振荡器中振荡浸提30 min （300 r min-1）。用慢速定量滤纸过滤。如果滤液浑浊，可采用双层滤纸过滤，或先离心8 min （3500 r min-1）后再过滤。在熏蒸的同时，另称取等量的土壤6份于浸提瓶中。其中3份作为不熏蒸“对照”，直接浸提剂进行浸提，浸提方法同上。另3份用于测定外加正磷酸盐态无机磷（P i）的回收率，具体操作是分别加入ml 250 μg P ml-1 KH2PO4溶液（外加无机磷的量相当于25 μg P g-1土），再加入80 ml mol L-1 NaHCO3浸提液进行浸提，浸提方法同上。过滤后的浸提液应立即进行测定，或者在4℃下保存。

（3）测定：吸取适量的浸提液（～5 ml）5ml于25 ml容量瓶中，加入混合显色剂前，先加入适量的1 mol L-1 HCl溶液进行中和，HCl溶液的加入量通常为浸提液体积的1/2，摇动以排除CO2。然后加蒸馏水至约20 ml，再加入4 ml混合显色液，加蒸馏水定容，在25℃下显色30 min，用分光光度计（UV8500Ⅱ型）在882 nm波长处比色。

同时分别吸取0、、、、、ml浓度为4 μg P ml-1标准磷溶液于25 ml容量瓶中。加入与样液等量的NaHCO3浸提剂，同样加适量1 mol L-1HCl进行中和，按上述相同方法进行显色和比色，得到浓度为0、、、、、μg P ml-1标准磷工作曲线。

（4）计算：

土壤MB-P= E Pi /（k P ? R Pi）

式中：E Pi = 熏蒸土壤提取的P i –不熏蒸土壤提取的P i；

R Pi = [（加P i的土壤提取的P i–未熏蒸土壤提取的P i）/ 25 ] × 100 %；

k P为转换系数，取值。