烟草愈伤组织的诱导及细胞悬浮培养体系的建立
基金项目:河南省科技厅“烟草细胞和发状根培养中茄尼
醇的合成研究”
(524420033)项目和郑州大学青年骨干教师资助项目“烟草中萜烯类次生代谢物的合成研究”资助。
作者简介:岳彩鹏(1974-),女,博士,郑州大学讲师,主要从事烟草生理研究。E 2mail:yuecai peng@zzu .edu .cn 收稿日期:2007-05-21
责任编辑:董志坚 E 2mail:yckj2256@yahoo https://www.360docs.net/doc/1316577702.html, 电话:0371267672650
烟草愈伤组织的诱导及细胞悬浮培养体系的建立
岳彩鹏,李 品,黄象男,朱大恒
郑州大学生物工程系,郑州市科学大道100号 450001
关键词:烟草;愈伤组织;悬浮培养;白肋烟;鄂烟1号
摘要:以鄂烟1号无菌苗的叶为材料进行愈伤组织的诱导,筛选出生长培养基的最佳激素配比,初步建立了烟草细胞悬浮培养体系。结果表明,愈伤组织诱导的最优基本培养基为MS 培养基,以MS +NAA 110mg /L +6-BA 0.5mg/L 为最佳配方;愈伤组织最佳生长培养基为MS +2,4-D 011mg/L +NAA 115mg/L +6-BA 013mg/L,愈伤组织培养第6天进入对数生长期,第14天干重增至最初干重的12.536倍,并以此配方建立了烟草细胞悬浮培养体系。中图分类号:S572.01 文献标识码:B 文章编号:1002-0861(2007)10-0056-04Tobacco Ca llus I nducti on and Est ablish m en t of Cell Suspen si on Culture Syste m Y UE CA I 2PENG,L I P I N ,HUANG X I A NG 2NAN,and Z HU DA 2HENG B i oengineering Depart m ent,Zhengzhou University,Zhengzhou 450001,China Keywords:T obacco;Callus;Sus pensi on culture;Burley t obacco;E ’yan 1
Abstract:The callus inducti on was carried out with the leaves of asep tic seedling of t obacco E ’yan 1,and the op ti m al hor mone p r oporti on in culture medium was screened out,and the syste m of t obacco cell sus pensi on culture was established p reli m inarily .The results showed thatMS was the op ti m al basic mediu m for callus inducti on,and the op ti m al f or mula was MS +NAA 1.0mg/L +62BA 0.5mg/L;while the op ti m al f or mula for culture mediu m of callus wasMS +2,42D 0.1mg/L +NAA 1.5mg/L +62BA 0.3mg/L.On the 6th day of callus culturing,the l ogarith m gr owth peri od started;and on the 14th day,the dry weight increased t o 12.536ti m es of its initial dry weight .The syste m of t obacco cell sus pensi on culture was established based on this f or mula .
组织培养不仅是一种植物快速繁殖的手段,同时也是植物改良、种质保存和次生物质生产的
理想途径[1]
。有关烟草组织和细胞培养已有不
少报道[225]
,近年来在抗性研究、基因转化和次生
物质生产等方面也取得一些进展[629]
。有研究表
明
[10]
,以植物悬浮培养细胞为材料生产次生代谢
物具有培养周期短、材料均一、重复性好等优点。烟草中含有大量次生代谢物,因此,建立稳定而具
有高活力的烟草悬浮培养细胞体系对次生代谢物的生产有重要意义。到目前在白肋烟的愈伤组织培养和细胞悬浮培养方面的研究报道较少。本试验以白肋烟鄂烟1号的叶为材料进行了愈伤组织的诱导,确定获得脆散性愈伤组织的最佳激素配比,并以此为基础建立起烟草细胞悬浮培养体系,旨在为烟草中次生物质的生物开发利用提供依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
鄂烟1号烟草种子,由郑州烟草研究院提供。
1.2 试验方法
1.2.1 无菌苗的获得
将烟草种子用70%酒精浸泡1m in,10% NaCl O消毒10m in,经无菌水漂洗后接种于无激素的MS固体培养基,28℃下暗培养,之后将未污染的发芽种子转接到MS
固体培养基上,于28℃下光照培养16h,得无菌种子幼苗。
1.2.2 初始愈伤组织诱导和基本生长培养基的筛选
取无菌苗叶片外植体,切成5mm×5mm的小块,接种在加有激素的3种基本培养基上,各处理见表1。28℃下暗培养,15d后得到初始愈伤组织。
1.2.3 愈伤组织的继代和最佳生长培养基激素配比的筛选
在基本培养基筛选的基础上,筛选出最优基本培养基为MS培养基,其对激素配比做进一步的调整细化,见表2,选取长势较好的愈伤组织继代培养,筛选最佳生长培养基。
1.2.4 脆散性愈伤组织的获得
按已确定的生长培养基配方配制固体生长培养基,选择长势较好、黄白色的愈伤组织进行继
代,28℃下暗培养,第4代后获得脆散性愈伤组织。
1.2.5 愈伤组织的鲜重、干重生长倍增曲线的绘制
按已确定的最优生长培养基配方配制固体培养基,灭菌分装于三角瓶中。将切好的脆散性愈伤组织称重后接种于编号的三角瓶中,记录m
1
;于28℃下暗培养,每2d取样1次,每次取样3
瓶,称取愈伤组织鲜重,记录m
2
;将愈伤组织烘干
至恒重,称重记录m
3
。每次取样的愈伤组织鲜重与干重倍增值的计算方法:
愈伤组织鲜重倍增值F=m
2
/m1
愈伤组织干重倍增值D=m
3
/(m1?115%)
式中:115%为接种愈伤组织的生物干重百分率。
依据愈伤组织鲜重与干重倍增值的平均值绘制生长曲线。
1.2.6 烟草细胞悬浮培养体系的建立
按已确定的生长培养基配方配制液体生长培养基,将疏松愈伤组织用玻璃棒碾碎,每瓶加入一定量的愈伤组织,pH值为5.7～518,28℃下摇床暗培养,摇床转速110r pm。
表1 诱导培养基的激素配比
激素(mg/L)
M S①B5②NT③
MS1M S2MS3MS4B51B52B53B54NT1NT2NT3NT4NT5NT6NT7
2,4-D④3.01.0——1.0———2.01.02.0————KT⑤0.20.5——0.5———0.20.50.5————NAA⑥——1.00.5—0.51.00.5———0.51.02.00.5 6-BA⑦——0.51.0—0.50.51.0———0.50.50.51.0
注:①M urashige-Skoog培养基;②Ga mborg培养基;③Nagata-Takebe培养基;④2,4-二氯苯氧乙酸;⑤激动素;⑥萘
乙酸;⑦6-苄基氨基嘌呤。
表2 生长培养基的激素配比
编号2,4-D
(mg/L)
KT
(mg/L)
NAA
(mg/L)
6-BA
(mg/L)
MS5——0.50.3 MS6——0.50.5 MS4——0.51.0 MS7——0.750.5 MS8——0.750.75 MS9——1.00.3 MS3——1.00.5 M S10——1.00.75 M S11——1.50.3 M S12——2.00.3 M S130.10.02——M S140.10.05——M S150.10.1——编号
2,4-D
(mg/L)
KT
(mg/L)
NAA
(mg/L)
6-BA
(mg/L) MS160.10.2——MS170.10.3——MS180.50.1——MS190.50.2——MS200.50.3——MS210.30.02——MS221.00.2——MS232.00.2——MS240.1—0.50.5 MS250.1—0.50.3 MS260.1—1.50.3 MS270.3—1.50.3 MS280.1—2.00.3
2 结果与讨论
2.1 烟草愈伤组织的诱导和基本培养基的筛选
将烟草外植体接种到基本培养基上,28℃下
暗培养15d,观察外植体生长分化的情况,获得一系列不同分化程度的烟草愈伤组织,见表3。
由表3可见,3种基本培养基中激素组合NAA+6-BA的烟草愈伤组织诱导率优于2,4-D+KT,NT基本培养基上烟草愈伤组织的诱导率很低。MS培养基的各种处理诱导出愈伤组织最快,约6～8d;B
5
基本培养基约为10～12d;在NT 基本培养基上的诱导时间较长,约35～40d,而且
外植体的死亡率也比MS和B
5
基本培养基高。因此NT培养基不适合本实验材料愈伤组织的诱
导。在MS培养基和B
5
培养基上,加2,4-D激素虽然有抑制芽分化的作用,但是浓度高于1.0 mg/L时会使愈伤组织变黑,对细胞生长不利。MS培养基上,MS3(NAA1.0mg/L+6-BA0.5mg/L)的效果最好,烟草胚性愈伤组织的诱导率较高,没有褐化,MS4(NAA0.5mg/L+6-BA 1.0mg/L)次之,MS1(2,4-D3.0mg/L+KT0.2 mg/L)褐化严重;B5基本培养基上,B53(NAA 1.0mg/L+6-BA0.5mg/L)的效果最好,B54 (NAA0.5mg/L+6-BA1.0mg/L)次之。可见, 3种培养基中MS基本培养基适合本实验材料外植体的诱导。
2.2 最佳生长培养基激素配比的筛选和脆散性愈伤组织的获得
在基本培养基中选择烟草细胞脱分化程度高、生长快的培养基配方MS+NAA1.0mg/L+6 -BA0.5mg/L、MS+NAA0.5mg/L+6-BA 1.0mg/L和MS+2,4-D1.0mg/L+KT0.5mg/ L,以此为基础对激素配比作进一步的调整(表2),选择长势较好,淡黄色的愈伤组织切成小块,接种到新鲜的培养基上。28℃下暗培养15d,观察结果见表4。
表3 不同基本培养基烟草外植体愈伤组织的诱导
项目
MS B5NT
MS1MS2M S3MS4B51B52B53B54NT1NT2NT3NT4NT5NT6NT7
外植体数(个)2319141418991412161413141218愈伤组织数(个)231614141789120204120颜色发褐数(个)23801238010000000诱导率(%)10084.210010094.488.910085.7012.5030.87.116.70
表4 M S培养基上愈伤组织的生长状况
编号褐化程度①分化程度②愈伤组织体积大小
MS5+++++ MS6+++++ MS4+++++++++ MS7++++ MS8++++++ MS9++++ MS3+++++ M S10+++++ M S11++++ M S12++ M S13++++ M S14+++++ M S15+++++编号褐化程度①分化程度②
愈伤组织
体积大小MS16++++++ MS17+++++++ MS18++++ MS19+++ MS20++++++ MS21++++ MS22++++
MS23++++++ MS24+++++ MS25+++++ MS26+++++ MS27++++ MS28+++
注:①“+”表示程度的高低。愈伤组织体积大小是以愈伤块直径大小为依据,+:直径≤0.5c m;“++”:0.5c m<直径≤1cm;②+++:1c m<直径≤2c m;“++++”:2c m<直径≤4c m。②分化程度是以分化率(长根长芽数与愈伤总数的比例)为依据,“+”:0<分化率≤20%;“++”:20%<分化率≤40%;“+++”:40%<分化率≤60%;“+++ +”:60%<分化率≤80%;“+++++”:80%<分化率≤100%。颜色发褐程度是以黄白色为基准,“+”:浅褐色;“+ +”:褐色;“+++”:深褐色;“++++”:黑色。
由表4可以看出:2,4-D 和KT 组合中,KT 浓度一定时,2,4-D 比例越大,愈伤组织褐化有加重的趋势;2,4-D 一定时,KT 比例越大,愈伤组织分化程度越高。并且该组合愈伤组织生长较慢,体积较小。NAA 和6-BA 组合中,愈伤组织褐化不明显,在一定浓度范围内,NAA 有利于愈伤组织的生长,可一定程度地抑制愈伤组织分化;在一定的NAA 浓度下,6-BA 比例增大,愈伤组织分化程度加重。总体来看,培养基配方中以MS26即MS +2,4-D 0.1mg/L +NAA 1.5mg/L +6-BA 0.3mg/L 的配比最佳,在该培养基上的愈伤组织生长快、疏松程度较好、脱分化程度较高。该培养基可作为建立细胞悬浮系的生长培养
基。这与刘卫群[11]
报导的MS +2,4-D 2mg/L +6-BA 0.5mg/L 烟草愈伤组织诱导效果最好和MS +NAA 1.5mg/L +6-BA 0.5mg/L 、MS +NAA 2.0mg/L +6-BA 0.5mg/L 愈伤组织生长最快不一致,可能是由于烟草品种和培养条件的不同所致。2.3 愈伤组织生长倍增曲线的绘制
以MS +2,4-D 0.1mg/L +NAA 1.5mg/L +6-BA 0.3mg/L 配方配制固体培养基,选择长势较好、淡黄色的愈伤组织切成小块接种培养,每2d 取样1次,称鲜重和干重。以愈伤组织鲜重、干重生长倍增值的平均值为纵坐标,取样时间为横坐标绘图(图1)。由图1可见,在MS24(MS +2,4-D 0.1mg/L +NAA 1.5mg/L +6-BA 0.3mg/L )培养基上愈伤组织生长快,第6d 起开始快速生长,14d 时鲜重增至接种时鲜重的131269倍,干重增重121536倍,达到最高,16d 时有所下降,需要更换培养基再次继代。该培养基可作为建立细胞悬浮系的生长培养基。2.4 烟草细胞悬浮培养体系的建立
按已确定的最优配方即MS +2,4-D 0.1
mg/L +NAA 1.5mg/L +6-BA 0.3mg/L 制备液体生长培养基,在接种量10%、蔗糖浓度3%、水
图1 烟草愈伤组织增长倍数曲线
解酪蛋白浓度0.1%、pH5.8、摇床转速110r pm 、28℃下暗培养,培养瓶中的悬浮系能够迅速生
长。每15d 继代1次,每次继代时,将培养瓶静
置几分钟后,倒掉2/3原培养液,然后更换新培养瓶,加入新的培养液。连续继代4代后,愈伤组织建立的细胞悬浮系生长迅速,颜色淡黄、分散性和均一性均较好,且能够较长期保存,可作为次生代谢物生产的培养体系。3 小结
白肋烟鄂烟1号愈伤组织诱导的3种基本培养基中,MS 培养基优于B 5培养基,而NT 培养基不适合鄂烟1号愈伤组织的诱导。MS +2,4-D 011mg/L +NAA 1.5mg/L +6-BA 0.3mg/L 为愈伤组织生长的最优配方,该配方愈伤组织脱分化程度高、颜色黄白、疏松、生长快,第6d 进入对数快速生长期,14d 重量达到最高。以此配方进行细胞悬浮培养,继代4代后,建立了生长迅速、颜色淡黄、分散性和均一性均较好的细胞悬浮系。
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烟草植物组织培养
烟草植物组织培养实验实验目的一学习和掌握植物组织培养技术，理解植 物细胞的全能性。实验原理二年代初期发展起来的一项生物技术。由于其拥有占地世纪30植物组织培养是从20少、繁殖系数大等特点，现以在全世界的园林植物尤其是花卉的种苗繁育上得到广泛应用。本文着重介绍组织培养技术的理论原理、操作过程、生产技术以及经济核算等方面的内容，使大家对组织培养在园林植物尤其是花卉的种苗繁育的应用有所了解，为以后的实际操作提供依据。在植物组织培养中，主要目标是诱导愈伤组织形成和形态发生，使一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化形成愈伤组织，并由愈伤组织再分化形成植物体。从一块外植体形成典型的愈伤组织，大致要经历三个时期：起动期、分裂期和形成期。①起动期是指细胞准备进行分裂的时期。用于接种的外植体的细胞，通常都是成熟细胞，处在静止状态。起动期是通过一些刺激因素（如机械损伤、改变光照强度、增加氧等）和激素的诱导作用，使外植体细胞的合成代谢活动加强，迅速进行蛋白质和核酸的合成。机械损伤能诱导植物体细胞开始分裂，如伤口上会出现愈伤组织。在植物组织培养中沿用了愈伤组织这一名词，但是植物组织培养中诱导外植体细胞分裂形成的愈伤组织，大都不是损伤的结果。外源的生长素类物质对诱导细胞开始分裂效果很好，因此生长素类物、萘乙4-D4-二氯苯氧乙酸2，，质在植物组织培养中得到广泛应用，常用的有生长素（2）细胞分裂素IBA、吲哚丙酸IPA和吲哚丁酸NAA酸、萘乙酰胺NAD和吲哚乙酸IAA））等。分裂期是，KT-30CPPU糠氨基嘌呤（KT）氯吡苯脲（6-（苄氨基嘌呤6-BA、6-指外植体细胞经过诱导以后脱分化，不断分裂、增生子细胞的过程。处于分裂期的愈伤组织的特点是：细胞分裂快，结构疏松，颜色浅而透明。外植体的脱分化因植物种类、器官来源及其生理状况的不同而有很大差别。例如，烟草、胡萝卜等植物的脱分化比较容易，禾本科植物的脱分化比较难；花的脱分化比较容易，茎、叶的脱分化比较难；幼嫩组织的脱分化比较容易，成熟的老组织脱分化比较难。分化期是指在分裂期的末期，细胞内开始出现一系列形态和生理上的变化，从而使愈伤组织内产生不同形态和功能的细胞。这些细胞类型有薄壁细胞、分生细胞、色素细胞、纤维细胞，等等。外植体的细胞经过起动、分裂和分化等一系列变化，形成了无序结构的愈伤组织。如果在原来的培养基上继续培养愈伤组织，会由于培养基中营养不足或有毒代谢物的积累，导致愈伤组织停止生长，甚至老化变黑、死亡。如果要让愈伤组织继续生长增殖，必须定期地（如2～4周）将它们分成小块，接种到新鲜的培养基上，这样愈伤组织就可以长期保持旺盛的生长。愈伤组织的形态发生方式经过起动、分裂和分化期产生的愈伤组织，其中虽然发生了细胞分化，但是并没有器官发生。只有满足某些条件，愈伤组织的细胞才会发生再分化，产生芽和根，进而发育成完整植株。愈伤组织的形态发生方式主要有不定芽方式（器官发生型）和胚状体方式两种。不定芽方式是在某些条件下，愈伤组织中的分生细胞发生分化，形成不同的器官原基，再逐渐形成芽和根。胚状体方式是由愈伤组织细胞诱导分化出具有胚芽、胚根、胚轴的胚状结构，进而长成完整植株。这种由愈伤组织中的薄壁细胞不经过有性生殖过程，直接产生类似于胚的结构，叫做胚状体。在植物组织培养中，不定芽方式和胚状体方式是愈伤组织形态发生的两种最常见和最重要的方式。胚状体方式比不定芽方式有更多的优点，如胚状体产生的数量比不定芽多，胚状体可以制成人工种子，等等。 培养基的主要指标为营养的组分，植物生长物质的浓度，特别是后者对外植体的分化1 / 5 矿质营养。矿质营养又叫无机营起着极其重要的作用。培养基的组织成分主要包括： 1. 、养，是指植物在生长发育的过程中所需要的各种化学元素，其中包括大量的元素如N、P 2. Mn、Zn、Cu等，其对植物的生长发育中有着重要的生理作用。FeK和微量元素如、B、维生素。维生素能够以辅酶的形式参与多种酶系的反映，直接影响到蛋白质、糖、脂肪等植物生长物质。其
粉蕉愈伤组织的诱导
粉蕉愈伤组织的诱导1 朱军，黄惠琴，方哲，鲍时翔 中国热带农业科学院热带生物技术研究所，海南海口 (571101) E-mail：bsxhhq@https://www.360docs.net/doc/1316577702.html, 摘要：香蕉是一种重要的热带水果。本文就影响粉蕉愈伤组织诱导的因素（外植体来源、生长调节剂种类、浓度等）进行了研究。其诱导的最佳条件是：以未成熟雄花花序或球茎为外植体，MS＋2,4-D 4 mg/L＋IAA 1 mg/L＋NAA 1 mg/L，28℃下暗培养。以球茎所诱导的愈伤组织诱导率可达89.1%。 关键词：香蕉，愈伤组织，诱导 中图分类号：S668 1. 引言 近年来，利用植物生产人类疫苗和其他药用蛋白越来越受到人们的重视。作为世界上重要的热带水果和粮食作物的香蕉（Musa spp.），因其果实营养丰富、生产周期短、可鲜食等特点而成为理想的植物生物反应器，因此香蕉转基因技术研究尤其显得重要。由于利用愈伤组织作为转化受体并诱导胚状体而再生的转基因香蕉可降低嵌合体发生[1]，且胚性愈伤组织可大量增殖、保存时间长，因此愈伤组织作为香蕉转基因受体受到越来越多研究者的重视。但香蕉是一种愈伤诱导率极低的作物，且品种间差异极大[1～5]。这极大的限制了香蕉转基因技术的研究。本文就粉蕉愈伤组织诱导进行了探讨，希望为我国香蕉转基因技术的研究提供参考。 2. 材料与方法 2.1 材料 选取香蕉品种粉蕉(Musa spp., ABB)为试验材料。 2.2 方法 2.2.1 外植体表面消毒 剥去未成熟雄花花序的苞叶，直至4 cm左右；在70%(体积分数)的酒精中浸泡1 min；再用1 g/L升汞(HgCl)浸泡10 min；取出，用无菌水彻底冲洗汞。假茎、球茎、幼叶取自试管苗，故无须消毒。 2.2.2 不同外植体的处理 选取粉蕉未成熟雄花花序、假茎、球茎、幼叶为外植体。分别将香蕉未成熟雄花花序剥去苞叶直至1.5 cm左右，沿轴线纵切成4块，再横切成厚约1 mm的薄片；假茎切成厚约1 mm左右的薄片；球茎切成小块；幼叶切成10 mm×10 mm方块接入愈伤组织诱导培养基中培养。 1本课题得到高等学校博士学科点专项科研基金资助课题(No.20050565004) 的资助。
烟草植物组织培养
烟草植物组织培养实验 一实验目的学习和掌握植物组织培养技术。深刻理解植物细胞的全能性。 二实验原理 植物组织培养是从20世纪30年代初期发展起来的一项生物技术。由于其拥有占地少、繁殖系数大等特点，现以在全世界的园林植物尤其是花卉的种苗繁育上得到广泛应用。本文着重介绍组织培养技术的理论原理、操作过程、生产技术以及经济核算等方面的内容，使大家对组织培养在园林植物尤其是花卉的种苗繁育的应用有所了解，为以后的实际操作提供依据。 在植物组织培养中，主要目标是诱导愈伤组织形成和形态发生，使一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化形成愈伤组织，并由愈伤组织再分化形成植物体。从一块外植体形成典型的愈伤组织，大致要经历三个时期：起动期、分裂期和形成期。①起动期是指细胞准备进行分裂的时期。用于接种的外植体的细胞，通常都是成熟细胞，处在静止状态。起动期是通过一些刺激因素（如机械损伤、改变光照强度、增加氧等）和激素的诱导作用，使外植体细胞的合成代谢活动加强，迅速进行蛋白质和核酸的合成。机械损伤能诱导植物体细胞开始分裂，如伤口上会出现愈伤组织。在植物组织培养中沿用了愈伤组织这一名词，但是植物组织培养中诱导外植体细胞分裂形成的愈伤组织，大都不是损伤的结果。外源的生长素类物质对诱导细胞开始分裂效果很好，因此生长素类物质在植物组织培养中得到广泛应用，常用的有生长素（2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D、萘乙酸NAA、萘乙酰胺NAD和吲哚乙酸IAA、吲哚丙酸IPA和吲哚丁酸IBA）细胞分裂素（6-苄氨基嘌呤6-BA、6-糠氨基嘌呤（KT）氯吡苯脲（KT-30，CPPU））等。分裂期是指外植体细胞经过诱导以后脱分化，不断分裂、增生子细胞的过程。处于分裂期的愈伤组织的特点是：细胞分裂快，结构疏松，颜色浅而透明。外植体的脱分化因植物种类、器官来源及其生理状况的不同而有很大差别。例如，烟草、胡萝卜等植物的脱分化比较容易，禾本科植物的脱分化比较难；花的脱分化比较容易，茎、叶的脱分化比较难；幼嫩组织的脱分化比较容易，成熟的老组织脱分化比较难。分化期是指在分裂期的末期，细胞内开始出现一系列形态和生理上的变化，从而使愈伤组织内产生不同形态和功能的细胞。这些细胞类型有薄壁细胞、分生细胞、色素细胞、纤维细胞，等等。外植体的细胞经过起动、分裂和分化等一系列变化，形成了无序结构的愈伤组织。如果在原来的培养基上继续培养愈伤组织，会由于培养基中营养不足或有毒代谢物的积累，导致愈伤组织停止生长，甚至老化变黑、死亡。如果要让愈伤组织继续生长增殖，必须定期地（如2～4周）将它们分成小块，接种到新鲜的培养基上，这样愈伤组织就可以长期保持旺盛的生长。愈伤组织的形态发生方式经过起动、分裂和分化期产生的愈伤组织，其中虽然发生了细胞分化，但是并没有器官发生。只有满足某些条件，愈伤组织的细胞才会发生再分化，产生芽和根，进而发育成完整植株。愈伤组织的形态发生方式主要有不定芽方式（器官发生型）和胚状体方式两种。不定芽方式是在某些条件下，愈伤组织中的分生细胞发生分化，形成不同的器官原基，再逐渐形成芽和根。胚状体方式是由愈伤组织细胞诱导分化出具有胚芽、胚根、胚轴的胚状结构，进而长成完整植株。这种由愈伤组织中的薄壁细胞不经过有性生殖过程，直接产生类似于胚的结构，叫做胚状体。在植物组织培养中，不定芽方式和胚状体方式是愈伤组织形态发生的两种最常见和最重要的方式。胚状体方式比不定芽方式有更多的优点，如胚状体产生的数量比不定芽多，胚状体可以制成人工种子，等等。 培养基的主要指标为营养的组分，植物生长物质的浓度，特别是后者对外植体的分化起着极其重要的作用。培养基的组织成分主要包括：1. 矿质营养。矿质营养又叫无机营养，
愈伤组织诱导及观察
实验二愈伤组织诱导及观察 一.实验目的 通过愈伤组织诱导的操作，使同学们了解进行植物组织培养时的一些关键操作技术和方法，如外植体的选择、培养基母液配制、使用液配制、分装灭菌、外植体表面消毒、接种、培养、愈伤组织诱导原理和方法以及接种后污染率，愈伤组织诱导率的统计与观察。使同学们能够亲身体会、了解激素对外植体的作用，还使同学们了解无菌培养的无菌操作，清楚植物体的带菌部位等。 二.实验内容 （一）、实验原理 植物组织培养是指在无菌条件下，对离体植物组织（器官或细胞）分离并在培养基中培养，使其能够继续生长，甚至分化发育成一完整的植株的一门实验技术。组织培养的理论依据是植物细胞的全能性，即植物体的每个细胞携带着一套完整的基因组，因此具有发育成完整植株的潜在能力。植物组织当中原本已经分化的细胞，一旦脱离原有的机体环境，成为离体状态，在适宜的营养和外界条件下，就会表现出全能性，从已经分化定型的细胞，脱分化，成为恢复分裂能力的细胞，并能重新生长发育成完整的植株。愈伤组织就是指一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化不断分裂、增生子细胞，这些细胞分裂快，结构疏松，颜色浅而透明，逐渐形成了无序结构的一团细胞。在植物组织培养中，主要目标是诱导愈伤组织形成和形态发生，使一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化形成愈伤组织，并由愈伤组织再分化形成植物体。 愈伤组织的形成 从一块外植体形成典型的愈伤组织，大致要经历三个时期：起动期、分裂期和形成期。 起动期是指细胞准备进行分裂的时期。用于接种的外植体的细胞，通常都是成熟细胞，处在静止状态。起动期是通过一些刺激因素(如机械损伤、改变光照
烟草组培苗实验步骤
烟草叶片的组织培养 一、实验原理与实验步骤 在植物组织培养中，主要目标是诱导愈伤组织形成和形态发生，使一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化形成愈伤组织，并由愈伤组织再分化形成植物体。从一块外植体形成典型的愈伤组织，大致要经历三个时期：起动期、分裂期和形成期。 植物材料：烟草植株 药品：（2,4-D、NAA、6-BA浓度均可）、1mol/L NaOH、1mol/L HCL 蒸馏水、70%酒精0.01%升汞 仪器：玻璃杯、玻璃棒、pH试纸(5.5-9.0) 、1瓶无菌水、1个无菌烧杯、1包无菌滤纸、 1个无菌白瓷板、培养瓶若干移液器、微波炉、灭菌器、超净工作台、酒精灯、解剖刀、镊子 二、实验方法与步骤
注意： 1、大量元素按照使用时高10倍的数值称取，分别将各种化合物称量后，除CaCl2·2H2O单独配制外，其余化合物混合在500ml烧杯中加适量蒸馏水溶解，用玻璃棒搅拌促溶，倒入1000ml容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，置小口瓶中保存，贴上标签注明化合物名称（或编号），浓缩倍数，配制日期和配制者姓名，CaCl2·2H2O配制同上置于另一小口瓶中。 2、微量元素母液的配制 按要求浓缩100倍的数值称取，分别将各种化合物称量除铁盐（FeSO4·7H2O 和Na2-EDTA.2H2O）作为一组单独配制外，其余化合物可混合置于烧杯内加少量蒸馏水溶解后，定容在1000ml容量瓶中，置小口瓶中保存，贴上标签 3、铁盐配制将FeSO4·7H2O和Na2-EDTA.2H2O分别溶于450ml蒸馏水中，加热，（很重要）不断搅拌，溶解后，两液混合，调PH至5.5加水定容至1000ml，置于小口瓶中，贴上标签。 4、有机物母液配制，按母液要求浓缩50倍，除蔗糖按3%单独临时称量外，其余分别称量后，溶解，定容在500ml容量瓶中，置于小口瓶中保存，贴上标签。5．母液最好在2~4℃的冰箱中贮存，特别是有机类物质，贮存时间不宜过长，无机盐母液最好在一个月内用完，如发现有霉菌和沉淀产生，就不能再使用。（1）制备母液和营养培养基时，所用蒸馏水或无离子水必须符合标准要求，化学药品必须是高纯度的（分析纯）。 （2）称量药物采用高灵敏度的天平，每种药品专用一药匙。 生长调节剂母液配制： 为了操作方便，节约时间，生长调节剂也可如同配制母液一样，先配成原液，这样配制培养基时只要稍加计算，按需要量取即可。 不同药品在配制时若不溶于水，可用少量不同的溶剂先溶解，萘乙酸（NAA），吲哚乙酸（IAA）,赤霉素（GA3），2，4-D等生长素和玉米素（ZT）可先用少量95%酒精溶解，然后加水，如溶解不完全再加热。激动素（KT）和6-苄基嘌呤（BA）可溶于少量1mol/L的盐酸中，叶酸需用少量稀氨水溶解。 称取50mg生长调节物质，溶解后，在100ml的容量瓶中定容，配制的母液每毫升则含有生长调节物质0.5mg，配制后一般要求在低温（0~4℃）保存，配制培养基时如每升（1000ml）需添加的生长调节剂物质为0.5mg时，则取1ml母液即可。 三、培养基配制和灭菌 本次实验使用 （1）愈伤组织诱导及其幼芽分化培养基:MS+2,4-D 0.5 mg/L +6-BA 1.0 mg/L；（2）幼芽增殖培养基：MS+6-BA 1.0 mg/L +NAA 0.2 mg/L； （3）生根培养基：MS+NAA 0.2 mg/L。 注意事项：上述培养基均在MS固体培养基溶化后降低到50左右后，加入相应激素所得， MS固体培养基的配置过程在此不作过多赘述
小麦愈伤组织的诱导
小麦愈伤组织诱导与其再生培养体系的建立 前言：小麦属于禾本科植物，麦粒在植物学上称为颖果，在种子学上则称为种子，通常称为小麦。麦粒皮色有红白之分，红皮的叫红麦，白皮的叫白麦。由于品种和受环境影响不同，红皮小麦又有深红色和红褐色；白皮小麦又有白色、乳白色或黄白色之分。 一：目的及意义 我国小麦目前的状况有以下几点：1 我国是农业大国，小麦面积4亿亩、产量9000万吨左右，分别占世界总量的 12%和18%，均居世界第一位。2 我国春小麦主要分布在东北、西北及华北北部。据中国粮油信息中心的数据显示，预计中国 03/04市场年度（7月至次年6月）春小麦播种面积仅为190万公顷，较上年度减少5％，这是多年来中国春小麦种植面积首次低于200万公顷；预计03/04年度春小麦产量为580万吨，较02/03年度下降7.48%。我国的小麦种植面积不断的减小，总产量也在不断减少。由于我国目前存在的状况，农业大国，主产小麦，但小麦的产量的质量都不是很好，种植面积又在减少，本研究主要是提高小麦的产量和质量。 二：综述国内外对小麦的研究状况 2.1 小麦愈伤组织诱导及原生质体的分离与纯化张小红，闵东红，邵景侠（西北农林科技大学，陕西杨凌712100） 试验方法：以普通小麦的幼穗和幼胚为外植体进行了愈伤组织诱导，及由幼胚愈伤组织进行了原生质体分离和纯化试验，研究了幼穗和幼胚外植体及低温预处理等因素对愈伤组织诱导的影响，在原生质体分离中研究了酶浓度和配比、酶解时间及蔗糖浓度等因素对幼胚愈伤组织原生质体游离和纯化的影响。结果表明：小麦幼穗离体培养时，以1.0~1.5 cm长度的幼穗有利于愈伤组织的诱导；小麦幼穗和幼胚外植体采后低温储藏时不易超过3 天，时间太长会影响愈伤组织诱导；2.0%纤维素酶＋0.5%果胶酶+0.6 M甘露醇分离原生质体较好，最佳酶解时间为 4~6 h，原生质体产量和活力较高。 2.2 小麦愈伤组织诱导及其植株再生研究进展王廷璞，陈荃，崔爱明，刘瑞媛，马伟超 （天水师范学院生命科学与化学学院，甘肃天水741001） 试验方法：小麦组织培养体系的建立与完善是应用植物基因工程改良小麦品质的重要基础和保证，综述了近年来小麦愈伤组织诱导及植株再生的研究情况。研究资料表明：小麦组织培养中，不同来源和不同生理状态的小麦外植体（幼胚、幼穗、花药、成熟胚、叶、根等），在愈伤组织诱导和获得再生植株的能力方面均显示了优点和不足。不足之处是在生产过程中，不断受到生物、非生物等因素的胁迫，严重影响其产量及品质。 2.3小麦愈伤组织诱导及其再生能力影响因素的研究贾海燕, 王洪刚 ( 山东 农业大学农学院, 山东泰安 271018) 试验方法：以农艺性状较好的24 份小麦品种( 系) 为材料, 筛选出了愈伤组织诱导率高且植株再生能力强的基因型材料山农995604 和F281- 10, 在此基础上对影响愈伤组织的分化能力以及较长时间保持分化能力的因素进行了研究。结果表明, 在愈伤组织的继代过程中, 保持较高浓度的2, 4- D, 或对愈伤组织进行交替继代培养有利于较长时间保持其再生能力。最佳取材时间在开花后15d 左右,
烟草的组织培养技术
烟草的组织培养技术 一、目的与要求 1.验证“植物细胞全能性”理论。 2.学习用生长调节剂对植物器官发生的诱导方法。 二、实验原理 植物组织培养是指在无菌条件下，分离、并在培养基中培养离体植物组织（器官或细胞）的技术。植物组织培养的理论依据是植物细胞的全能性，即植物体的每个活细胞都有相同的遗传组成，在适当条件下具有繁殖出完整植株的能力。植物组织当中原本已经分化的细胞，组织、器官一旦脱离原有的机体环境，成为离体状态，在适宜的营养和外界条件下，就会表现出细胞的全能性，从已经分化的细胞通过脱分化，成为重新具有分裂能力的胚性细胞，并能再分化重新生长发育成完整的植株。 愈伤组织：是指一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化不断分裂、增生子细胞，这些细胞分裂快，结构疏松，颜色浅而透明，逐渐形成了无序结构的细胞团。 脱分化：已经分化的细胞，发生生理、生化的改变，退回到胚性细胞的过程。 再分化：经过脱分化的细胞或组织再次获得分化成不同功能的细胞、组织、器官或完整植物体。 三、材料和用具 1.材料：无菌烟草叶盘（已经诱导成芽），拟南芥。 2.用具：超净工作台、高压灭菌锅、培养箱、电子天平、移液器、手术解 剖刀、大、小镊子、30ml烧杯、500ml烧杯、药勺、玻璃棒、培养 瓶、平皿、试纸（PH5.4-7），报纸等。 3.试剂：MS培养基、0.5mol/LNaOH、1mol/L HCl。 四、操作步骤 （一）诱导培养基配制（见表1）
1.加MS储液（储液配置见附表） 大量元素和微量元素的母液都是高浓度的，为防止混合后发生沉淀，建议加完大量元素后先加水（约总体积3/4），再加各微量元素和有机成分。 铁盐也是微量元素，因为易发生沉淀，所以与其它微量元素分开配。储液中的铁盐存于棕色瓶中。配好的储液应当4℃保存。表1是4瓶培养基（1组）的配置方案。 表1 诱导培养基配制表 成分实际称取量 蒸馏水120 ml MS母液15 mL 蔗糖 4.5 g 用蒸馏水粗略定容至100ml pH值 5.8 琼脂 1.2 g 2.加蔗糖（3%）（m/v）。蔗糖是碳源，同时起到维持渗透压的作用。 3.调pH=5.8。pH过低，高温处里时间过长，都可能会使培养基不凝。 4.加琼脂（0.7-0.8%）（m/v）琼脂粉是固化剂、支持物。 （二）灭菌 1.培养基、解剖刀、镊子、平皿需在高压灭菌锅120℃，灭菌15min。 2.接种前打开无菌间和超净台紫外灯照射30min。 3.用肥皂洗手和手腕。进入无菌间，先用70%酒精或新洁尔灭喷手。关掉 无菌间棚顶紫外灯，打开超净台风机，关掉超净工作台上的紫外灯。（三）接种 1.坐在超净工作台前，用70%酒精棉球擦拭双手、培养瓶和超净台面。 2.待手上的酒精干了，点燃酒精灯。 3.将培养瓶的盖子旋松，但不要打开，放到无菌风道侧面备用。 将镊子、解剖刀在酒精灯外焰上灼烧，待其冷却后，放到培养皿上备用。 4.用镊子和解剖刀取出一块叶盘，放到平皿上，切取烟草叶芽1-2块，插 入培养基。
愈伤组织的诱导和培养
班级：植物092 姓名：徐炜佳学号：0901080223 愈伤组织的诱导和培养 一、实验目的及意义 植物愈伤组织的诱导和培养在植物科学的基础研究和应用研究中都有重要的意义。通过本次实验，可以初步掌握植物外植体材料消毒、接种的无菌操作技术，愈伤组织的诱导方法和愈伤组织继代培养的方法。 二、实验原理 植物组织与细胞培养是应用无菌操作的方法培养离体的植物器官、组织或细胞的过程。如果组织培养使用的植物材料是带菌的，在接种前就必须选择适当的消毒剂对植物外植体进行表面消毒，获得无菌材料进行组织培养，这是取得植物组织培养，成功的基本前提和重要保证。由于植物细胞具有全能性，外植体在合适的培养基上通过脱分化，形成一种能迅速增殖的无特定结构和功能的细胞团——愈伤组织（callus）。植物生长调节剂如2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）等是诱导外植体形成遇上组织的重要因素。 三、实验仪器与药品 超净工作台，酒精灯，镊子，剪刀，解剖刀，75%乙醇，酒精消毒棉 材料：烟草无菌苗，甘薯无菌苗 四、实验步骤 1.按下表分别配制培养基
将配置的四种培养基分别分装入20个培养瓶，高温灭菌后水平放置凝固 2.接种前，将实验所需器具放入超净工作台，打开紫外灯灭菌20~30min，关闭紫外灯，开启通风开关。洗手后用酒精喷洒消毒手、手臂、实验材料及培养基外部等进入超净工作台的部分。进入超净工作台，用酒精棉擦拭台面（手勿伸出工作台），台面完全风干后点燃酒精灯。 3.接种开始时，将镊子及手术刀在酒精中浸泡，并在酒精灯外焰上烧炽片刻，充分冷却。取幼嫩的烟草（甘薯）叶片，用手术刀切割成小片，再用镊子将其接种至相应的培养基上，每瓶接种3~5片，封口后取出超净工作台，标注姓名、日期、培养基和接种材料。 4.将上述培养材料常温暗培养，每隔7天观察一次，并记录培养情况 五、实验结果
2,4- D和6-BA对烟草组织培养的影响
2,4- D和6-BA对烟草组织培养的影响刘璐华南师范大学生命科学学院 08生物科学一班 20082501055 摘要：以烟草为实验材料，在不同配方的培养基（①MS + 6-BA0.5 mg/L + 2,4- D0.5mg/L ②MS + 2,4-D0.5mg/L ③MS + 6-BA2.0mg/L + 2,4-D0.5mg/L）中进行组织培养， 观察其愈伤组织的形成及分化。通过实验，我们得出，6-BA与2,4- D配合使用， 可以更有效地诱导愈伤组织的形成。单独使用2,4- D可促进愈伤组织根的分化，而 6-BA则可以有效地诱导愈伤组织芽的分化，且6-BA浓度为2.0mg/L时的效果比浓 度为0.5 mg/L时要好。 关键词：烟草组织培养2,4- D 6-BA 烟草(Nicotiana tabacum L.) ，属茄科烟草属，是植物组织培养的模式植物。生长调节物质是植物组织培养中不可缺少的一类物质，虽然用量极少，但它们对外植体愈伤组织诱导起着重要的调节作用，其中以生长素类和细胞分裂素最为常用。常用的生长素类有2,4- D、NAA、IAA、IBA，而细胞分裂素类主要有KT、6-BA、ZT、2-iP、4-PU和TDZ。 本研究以烟草叶片为材料，结合本小组和其他两组的实验结果，探讨2,4-D对愈伤组织形成与分化的作用，以及它和不同浓度6-BA共同使用的效果。 1 材料与方法 1.1材料 烟草（Nicotiana tabacum L.） 1.2方法 1.2.1配制MS培养基母液和植物生长调节物质母液。[1] 1.2.2配制培养基和灭菌。[1]培养基的配方为①MS + 6-BA0.5 mg/L + 2,4- D0.5mg/L（我们第2实验小组所做）②MS + 2,4-D0.5mg/L（由第1实验小组所做）③MS + 6-BA2.0mg/L + 2,4-D0.5mg/L（由第7实验小组所做） 1.2.3外植体（烟草叶片）的消毒与接种。[1]观察记录各组的愈伤组织生长情况以及污染情况。 1.2.4愈伤组织的继代培养。将愈伤组织转入配方为MS + 6-BA1.0mg/L + NAA0.5mg/L的培养基上进行继代培养，观察记录生长情况。 2 结果分析 2.1愈伤组织的形成 培养开始的3天内，外植体在形态上并无明显变化，只是其体积比接种时稍微大了一些。5天后，外植体从切口处开始膨大并出现黄色小颗粒，形成愈伤组织，外植体隆起且边缘有卷曲现象。而污染方面，我们第2组一共接种16瓶培养基，有5瓶出现了霉菌污染，污染率为31.25% 。 对比三个实验组的愈伤组织，可以发现，我们第2实验小组的愈伤组织生长情况与第7
细胞悬浮培养
细胞悬浮培养 摘要： 悬浮培养是非贴壁依赖性细胞的一种培养方式，是一种十分有用的实验体系，在液体状态下便于细胞和营养物质的充分接触和交流，细胞状态可以相对保持一致，因此有利于在细胞水平上进行各种遗传操作和生理生化活动的研究，同时为植物细胞的大规模培养提供前期技术基础。但该技术目前在国内尚未得到广泛应用，生物制品生产仍主要采用病毒产率低、生产成本高、劳动强度大的转瓶细胞培养方式。随着现代生物技术发展，利用细胞悬浮培养技术进行生物制品生产是生物制药行业发展的必然趋势。 关键词：单个细胞细胞悬浮培养愈伤组织同步化
1．细胞悬浮培养的定义 定义1：细胞悬浮培养（cell suspension culture）是指将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增殖的技术[1]。 应用学科：细胞生物学（一级学科）；细胞培养与细胞工程（二级学科） 定义2：在流动的液体培养基中培养非贴壁的悬浮细胞或小细胞团的细胞或组织的培养方法。细胞附着在微运载体上的培养也是一种悬浮培养。 应用学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；方法与技术（二级学科）2．单细胞制备的方法 2.1 机械法 早期用机械法分离叶组织单细胞。Ball和joshi（1965）、joshi和noggle（1967），以及joshi和Ball（1968）曾先后用小解剖刀从花生成熟叶片中刮离体细胞，这些离体细胞可直接在液体培养基中培养，很多游离细胞都能成活，并持续地进行分裂。随后，人们用机械法相继从菠菜、大豆和石刁柏等多种植物中分离得到叶肉细胞，并能够分裂和形成愈伤组织。Rossini（1972）指出，只有在薄壁组织排列松散、细胞间接触点很少时，用机械法分离叶肉细胞才能取得成功[2]。 2.2 酶解法 酶解法分离单细胞主要是利用果胶酶将细胞之间的中胶层解离，获得分散的细胞。人们最早用果胶酶处理烟草叶片，分离到大量有代谢活性的叶肉细胞，将这种方法用到了18种其它草木植物上也获得成功。由于果胶酶不仅能降解细胞之间的中胶层，而且还能软化细胞壁，因此在用酶解法分离细胞的时候必须对细胞给予渗透压保护，即在酶液中加入一定浓度的渗透压稳定剂。 酶解法一般利用叶片作为分离细胞的材料，但此法不能分离单子叶作物如小麦、大麦和玉米的叶肉细胞[3]。 2.3 愈伤组织诱导法 以愈伤组织作为细胞悬浮培养的细胞来源，首先必须诱导出适宜的愈伤组织。用于建立悬浮系的愈伤组织必须有较好的松散行，使之在悬浮培养的起始阶段细胞容易打散。同时，愈伤组织还必须具备较强的增殖和再生能力。诱导符合这些要求的愈伤组织，首先，必须选择适宜的植物外植体材料。其次，培养基的附加成分对建立疏松易散的愈伤组织具有较大的影响。
水稻愈伤组织的诱导实验报告
水稻愈伤组织的诱导实验 报告 This model paper was revised by the Standardization Office on December 10, 2020
水稻愈伤组织的诱导 一、实验目的 1、掌握外植体的消毒方法和接种技术； 2、了解愈伤组织诱导的过程。 二、实验原理 以植物器官、组织、细胞等作外植体进行离体培养时，在一定的诱导培养条件下都能诱导形成愈伤组织。愈伤再经分化培养，通过器官发生途径或体细胞胚胎发生途径可再生成植株。 外植体源自自然环境均为带菌状态，在接种前都必须进行消毒。对于难消毒的材料，有时要几种消毒剂配合使用；对于多茸毛表面粗糙不平的材料，要加展着剂（吐温20）以增强消毒效果。 三、实验材料与用具 1、材料：水稻成熟种子（用于诱导愈伤组织）； 2、试剂：75%酒精，2% NaCLO，无菌水(每组1瓶400mL)； 3、培养基：诱导培养基：NB+2,4-D 2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L（）； 4、仪器设备：培养室、超净工作台、培养皿（￠9cm）2个、枪形镊、量筒（100mL）2个、三角瓶（50mL、无菌）2个、废液缸、保鲜膜、标签纸。 四、实验步骤
1、接种室、培养基及用具表面消毒 用75%酒精棉球试擦超净工作台、镊子，将培养基及用具放工作台，打开紫外灯，照射20分钟以表面消毒。之后关紫外灯，打开工作台风机，通风30分钟后可进行无菌操作。 2、种子去壳 选取饱满、无霉变、成熟的水稻种子，手工脱去谷壳（注意保持胚完整），每人准备30粒去壳种子，并按照分组放到三角瓶中。 3、操作者双手的清洗与消毒 在进入无菌室之前，各操作者先用自来水清洗干净双手并晾干，然后进入无菌室，坐在超净台前位子上后，用含75%酒精的酒精喷壶喷洒双手对双手进行消毒，在超净台风口待双手酒精风干后进入超净工作台。（注意：酒精喷壶喷洒双手时切记不要把酒精喷到超净台的有机玻璃板上！） 4、超净台面的表面消毒（以下工作在超净工作台内进行） 用枪形镊子从含75%酒精棉球的容器中取一团棉球，仔细把整个超净台面擦试一遍，尽量降低超净台面的带菌量，并将废棉球丢到废液缸中，然后点亮超净台里面放置的酒精灯。 5、外植体消毒（分组操作，每组由一位代表操作完成外植体的消毒工作） 将脱谷壳米粒转到一50mL无菌三角瓶→加适量无菌水洗一次（以没过种子为准，下同）→弃水，倒入75%酒精适量，摇动搅拌，放置30秒（过程中适当轻摇动混匀）→弃酒精→加适量无菌水洗一次→弃水→倒入适量2% NaCLO，不时摇动搅拌，共处理30分
植物细胞悬浮培养技术
植物细胞悬浮培养技术 一、基本原理 利用固体琼脂培养基对植物的离体组织进行培养的方法在某些方面还存在一些缺点，比如在培养过程中，植物的愈伤组织在生长过程中的营养成分、植物组织产生的代谢物质呈现一个梯度分布，而且琼脂本身也有一些不明的物质成分可能对培养物产生影响，从而导致植物组织生长发育过程中代谢的改变而利用液体培养基则可以克服这一缺点，当植物的组织在液体培养基中生长时，我们可以通过薄层震荡培养或向培养基中通气用以改善培养基中氧气的供应。植物细胞的悬浮培养是指将植物细胞或较小的细胞团悬浮在液体培养基中进行培养，在培养过程中能够保持良好的分散状态。这些小的细胞聚合体通常来自植物的愈伤组织。 一般的操作过程是把未分化的愈伤组织转移到液体培养基中进行培养。在培养过程中不断进行旋转震荡，一般可用100～12Or/min 的速度进行。由于液体培养基的旋转和震荡，使得愈伤组织上分裂的细胞不断游离下来。在液体培养基中的培养物是混杂的，既有游离的单个细胞，也有较大的细胞团块，还有接种物的死细胞残渣。 在液体悬浮培养过程中应注意及时进行细胞继代培养，因为当培养物生长到一定时期将进入分裂的静止期。对于多数悬浮培养物来说，细胞在培养到第18～25d 时达到最大的密度，此时应进行第一次继代培养。在继代培养时，应将较大的细胞团块和接种物残渣除去。若从植物器官或组织开始建立细胞悬浮培养体系，就包括愈伤组织的诱导、继代培养、单细胞分离和悬浮培养。目前这项技术已经广泛应用于细胞的形态、生理、遗传、凋亡等研究工作，特别是为基因工程在植物细胞水平上的操作提供了理想的材料和途径。经过转化的植物细胞再经过诱导分化形成植株，即可获得携带有目标基因的个体。 二、器材 超净工作台、高压蒸汽灭菌器、恒温培养箱、磁力搅拌器、恒温空气摇床、镊子、锥形瓶、水稻种子 三、操作步骤 1．配制培养基 按照培养基配方取各种药品，最后用蒸馏水定容到所需体积。所配制的培养基经高压蒸汽灭菌后备用，固体琼脂培养基分装在250mL 的锥形瓶内，每瓶约分装30mL。 2．水稻种子的消毒 （1）将种子置于无菌的培养皿内，以体积分数95％的酒精消毒1～2min。 （2）取出后用无菌水冲洗2～3 遍。 （3）将种子放入25.0g/L 的次氯酸钠溶液中轻轻摇动后，浸泡60min 。 （4）取出后用无菌水冲洗，将次氯酸钠溶液充分洗净。 3. 接种 在超净工作台内，将灭菌后的水稻种子接到诱导愈伤组织的固体培养基上，每个培养瓶接5～10 粒种子。接种完毕后用封口膜将培养瓶封好，放在26℃的恒温培养箱中进行黑暗培养。 4．悬浮培养的开始： 当得到愈伤组织后，将其转人到AA 液体培养基中。注意愈伤组织块应小于3mm . 若组织块较大可用无菌解剖刀将其分割成小块。液体培养基分装在250mL 的锥形瓶内．接种完毕后将瓶口用封口膜封好，把培养瓶放到恒温摇床上进行震荡培养。调整摇床的旋转速度，使之为120r/min。培养温度为26℃，在黑暗中培养。 5．悬浮培养物的保持 进行悬浮培养后要不断进行观察，由于培养物的继代培养与培养瓶内培养物的密度及细胞
悬浮细胞培养技术课件
悬浮细胞传代及细胞计数 一、细胞传代 实验目的：掌握悬浮细胞传代技术。进一步掌握细胞培养的操作技术。 实验原理： 培养细胞生长一定时间后，需分离再培养，否则细胞因生存空间不够，细胞密度过大，致营养不足而引起细胞衰老、停止生长甚至死亡。为了维持细胞的存活和生长，必须进行再培养，即将原培养瓶内细胞分离、稀释、接种到新培养瓶内继续扩大培养。 实验用品： （一）仪器 净化工作台、离心机、恒温水浴箱、冰箱（4℃、-20℃、-70℃）、倒置相差显微镜、培养箱； （二）玻璃器皿 吸管（弯头、直头）、培养瓶、废液缸、 （三）塑料器皿 吸头、枪头、胶塞、移液管、15ml离心管、离心管架 （四）其他物品 微量加样枪、计数板、记号笔、移液枪 （五）试剂 1640培养液、PBS 操作步骤： 1.准备： 打开培养液，PBS； 取出离心管，拧开管盖，管盖倒放。从吸管筒中依次取出吸管，装上吸 头，插入离心管备用。 2.从培养箱内取出细胞，放在显微镜下观察其生长状态、密度。 3.首先观察培养板孔中培养液量。用吸管分别吸出两个孔中的细胞连同培养液， 转入离心管中。再另取一只吸管吸取PBS，放入培养板孔中，轻轻吹打孔壁，
吸出转入离心管。 4.离心，设置离心机1000转/分，4-5分钟。 5.取出离心管，轻轻吸出上清，倒入废液缸。吸取培养液约7ML放入离心管， 轻轻吹打细胞，使之均匀悬浮。 6.吸取1ML细胞悬液1ML转入EP管中，备计数用。 7.其余的细胞分别放入六个孔中，每孔约1ML。 8.吸取培养液加入板孔中至1/3孔容量。 9.镜下观察细胞是否分布均匀，放入培养箱培养。 二、细胞计数及生长曲线测定 培养细胞生长过程：潜伏期→指数增生期→停滞期 潜伏期(latent phase) 细胞接种后,先经过一个在培养液中呈悬浮状态的悬浮期.此时,细胞质回缩, 胞体呈圆球形.然后细胞贴附于载体表面,称贴壁,悬浮期结束. 细胞贴壁速度与细胞种类, 培养基成分,载体的理化性质等密切相关。一般情况下，原代培养细胞贴壁速度慢,可达10-24 小时或更多, 而传代细胞系贴壁速度快, 通常10-30 分钟即可贴壁。细胞贴壁后还需经过一个潜伏阶段，才进入生长和增殖期.原代培养细胞潜伏期长，约24-96 小时或更长, 连续细胞系和肿瘤细胞潜伏期短，仅需6-24 小时。 (2) 指数增生期(logarithmic growth phase) 这是细胞增殖最旺盛的阶段，分裂相细胞增多。指数增生期细胞分裂相数量可作为判定细胞生长是否旺盛的一个重要标志。通常以细胞分裂相指数（Mitotic index, MI）表示，即细胞群中每1000 个细胞中的分裂相数。一般细胞的分裂指数介于0.1%-0.5%，原代细胞分裂指数较低，而连续细胞和肿瘤细胞分裂相指数可高达3％－5％。指数增生期的细胞活力最好时期，是进行各种实验最佳时期，也是冻存细胞的最好时机。在接种细胞数量适宜情况下，指数增生期持续3－5 天后，随着细胞数量不断增多、生长空间减少，最后细胞相互接触汇合成片。正常细胞相互接触后能抑制细胞运动，这种现象称接触抑制现象(contact
高中生物实验11植物的组织培养辅导教案 浙科版
辅导教案 导学诱思DAOXUEYOUSI 一、植物组织培养 1．生殖类型：______、______、________都是植物无性繁殖的方法。 2．植物组织培养的概念：取一部分植物组织，如叶、____、茎、根、______或______等，在______的条件下接种在三角瓶中的________上，给予一定的______和______，使之产生________，或进而生根发芽。 3．激素在植物组织培养过程中的作用： (1)培养基中加入的植物激素是____素和____素。 (2)两者的________决定组织是生根还是生芽。细胞分裂素/生长素的比例____时，诱导芽的生成；细胞分裂素/生长素的比例________时，愈伤组织继续生长而不分化；细胞分裂素/生长素的比例____时，会趋于生根。 4．实验设计的思路： (1)材料：菊花 (2)过程： 答案：1.扦插嫁接组织培养 2．芽花瓣花粉无菌琼脂培养基温度光照 愈伤组织 3．(1)生长细胞分裂(2)摩尔比浓度高基本相等 低 4．细胞分裂生长分株生长根草炭土蛭石
二、菊花的组织培养实验 1．实验药品材料：____培养基、______酸、发芽培养基、生根培养基。 2．实验步骤： (1)放置组织培养材料： 在________中，取出一瓶已进行过________的菊花幼苗，在无菌培养皿上用无菌镊子和无菌解剖刀切成几段，每段上至少有________。 (2)培养成丛状苗： 在________旁，将每段放入1瓶__________中，使茎的一部分__________，盖上______。每瓶也可放入2～3段幼菌切段。在________下保持______℃的温度培养，每天的光照不少于____h。2～3周后长成健壮的丛状苗。 (3)生根培养： 将健壮的丛状苗在无菌条件下一个个转入生根培养基中，在上述条件下继续培养。 (4)瓶外培养： 将生根的苗移至草炭土或蛭石中，用________或________保持80%以上的湿度，2～3天后打开玻璃罩逐渐________________，直到将罩全部打开处于自然湿度下为止。 (5)移至土中培养。 答案：1.MS 萘乙 2．(1)超净台无菌培养1张叶片(2)酒精灯生芽培养基插入培养基内封口膜日光灯18～25 14.5 (4)玻璃罩塑料布降低湿度进行锻炼 三、实验补充部分 若材料为自然生长的茎，则与上述过程有以下不同： 需要在实验前对自然生长的茎进行处理如下：先在________中浸泡10 min，再放入________溶液中浸泡 5 min，然后用______________溶液浸泡 5 min，最后在超净台中用________清洗，再将茎的切段培养在______培养基中。 答案：70%乙醇5%次氯酸钠另一5%次氯酸钠无菌水生芽 核心解读HEXINJIEDU 1．植物组织培养所依据的原理是什么？ 植物组织培养所依据的原理是：细胞的全能性(植物细胞的全能性)。 (1)细胞的全能性：一个细胞具有发育成完整个体的潜能。 (2)细胞具有全能性的原因： 生物体细胞一般都是由受精卵经有丝分裂形成的，因而都含有生物一整套遗传物质，都
植物愈伤组织诱导培养基的配制
中 国 海 洋 大 学 实 验 报 告 姓名： 马宁 专业年级： 生命基地班2009级 学号： 040212009020 课程： 植物生理学实验 题目： 植物愈伤组织诱导培养基的配制 一 .实验目的 1、掌握植物组织培养基母液配制的原则。 2、掌握植物MS 培养基的配制方法。 3、学会使用高压灭菌锅。学会植物组织含水量、自由水和束缚水含量的测定 二 .实验原理 概念： 1.植物组织培养： 将植物的器官组织以至单个细胞，应用无菌操作方法，使其在人工条件下，能够分裂、增殖、分化发育成一完整植株的过程。 2.愈伤组织及脱分化、再分化： 植物的组织在人工培养条件下，原来已经分化停止生长的细胞，可以重新分裂，形成没有组织结构的细胞团，即愈伤组织，这一过程称为“脱分化作用”。而已经“脱分化”的愈伤组织，在一定条件下，又能重新分化形成输导系统以及根和芽等组织和器官，这一过程称为“再分化作用”。植物激素在“再分化”过程中起着重要作用，生长素和细胞分裂素的比例，决定了根和芽的分化。 培养基配置见下表 化合物 含量 mg/L 母 液 吸取母 液量 ml/L 编号 浓度 mg/ml 称量 mg 配制量 ml NH 4NO 3 1650 1 33 16500 500 25 KNO 3 1900 38 19000 KH 2PO 4 170 3.4 1700 MgSO 4.7H 2O 370 7.4 3700 CaCl 2.2H 2O 440 2 8.8 4400 500 25
三 .主要仪器试剂 三蒸水、蔗糖、琼脂、用分析纯试剂：NH4NO3、KNO3、KH2PO4、MgSO4?7H2O 、CaCl2?2H2O 、 ZnSO4?7H2O 、MnSO4?4H2O 、H3BO3预先配制好的不同组分的培养基母液、2-4D 溶液、烧杯、移液管、铁缸子、玻璃棒、手套、加热器等。 四.实验操作步骤 1、母液的配制（教师配好） 1）配制母液的好处和原则 （1）好处 a.可减少每次配制称量药品的麻烦. b.减少极微量药品在每次称量时造成的误差。 母液配成10~100倍，2－4℃冰箱中保存，用时按比例稀释。 （2）原则：按照药品的种类和性质（相似）分别配制，避免形成沉淀。 2）实验中用到的各母液 ZnSO 4.7H 2O 8.6 3 0.86 430 500 5 MnSO 4.4H 2O 22.3 2.23 1115 H 3BO 3 6.2 0.62 310 NaMoO 4.2H 2O 0.25 4 0.25 125 500 0.5 CuSO 4.5H 2O 0.025 0.025 12.5 CoCl 2.6H 2O 0.025 0.025 12.5 KI 0.83 5 0.083 41.5 500 5 Na-EDTA 37.3 6 7.46 3730 500 2.5 FeSO 4.7H 2O 27.8 5.56 2780 盐酸硫胺素 0.1 7 1 25 25 0.05 盐酸吡多醇 0.5 8 1 25 25 0.25 肌醇 100 9 20 1000 50 2.5 甘氨酸 2 10 1 50 50 1 烟酸 0.5 11 1 25 25 0.25