植物内生菌

植物内生菌是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和

器官内部的微生物，被感染的宿主植物不表现出外在病症，可通过组织学方法或从严格表面消毒的植物组织中分离或从植物组织内直接扩增出微生物DNA的方法来证明其内生。它不仅包括互惠共利的和中性的内共生微生物，也包括那些潜伏在宿主体内的病原微生物，这些微生物有细菌、真菌、放线菌等。自1898年Vogl从黑麦草种子内分离出第一株内生真菌以来，植物内生菌作为一种新的微生物资源受到了广泛的关注，从内生菌中寻找和发现新的活性化合物已成为国内外研究的又一热点。近年来，该领域的研究已取得一定进展，发现了一些有医用、农用价值的菌株和化合物。

1. 内生真菌

从牧草中分离得到的内生真菌香柱菌，所产生的波胺碱和黑麦草碱类物质对昆虫具有杀伤作用，对牲畜等脊椎动物无毒。Strobel等从雷公藤的茎中分离得到一株内生真菌，能产生一种肽类抗生素Cryptocandin，它能抑制灰葡萄孢）等一些植物病原真菌，分离自同一内生真菌的一种新酰胺生物碱cryptocin对稻瘟病菌（及其他多种植物病原真菌有强的抑杀作用。纪丽莲等人从黄海海岸低盐药用植物芦竹中分离得到一株木霉属的内生真菌，它对黄瓜灰霉病菌有较强的抑菌活性。

2. 内生细菌

从辣椒中分离出的一株内生枯草芽孢杆菌，该菌株分泌的抗菌多肽对热稳定，在中性PH范围较稳定，并抗紫外线照射，对植物炭疽病菌和番茄青枯病菌等多种植物病原真菌和细菌有强的抑制作用。

3. 内生放线菌

链霉菌属于放线菌，它占具有生物活性的植物内生放线菌的绝大部分。澳大利亚Coombs研究小组从小麦根部分离的60多株放线菌中筛选到防治小麦全蚀病的菌株，在温室试验中可使小麦全蚀病的危害降低70%。Strobel等在蛇藤中分离到一株新的链霉菌，它能产生4种新的广谱抗生素Munumbicins A、B、C和D，这些抗生素对多种人体和植物致病霉菌、细菌及疟原虫具有广泛的抑杀活性。最近，Strobel等又从一种有叶蕨类植物中分离到一株新内生链霉菌，它能产生一种被称为kakadumycins的新型抗菌素，对炭疽芽孢杆菌和疟原虫均具有抑杀活性，其生物活性比棘霉素强。从卫矛科植物分离的内生链霉菌产生的新chloropyrrol抗生素对多种耐药性细菌和分枝杆菌有抑制活性。从杜鹃花植物中分离的链霉菌产生新的抗真菌物质fistupyrone，对植物病原真菌甘蓝黑斑交链格孢有抑制作用。李萌等从油菜和芹菜的茎和叶中分离得到215株内生菌，18株对蔬菜立枯丝核菌、直啄镰刀菌、苹果黑腐皮壳有很好的拮抗作用，其中有8株为放线菌；从油菜茎中分离出的内生放线菌CHSH19A经鉴定为一株链霉菌Streptomyces sp．，活性筛选结果证明其具有极强的抗立枯丝核菌活性。

植物内生菌是一类次生代谢产物丰富、应用前景广阔的资源微生物。近年来，植物内生菌由于能够产生丰富多样的具有农药活性的次生代谢产物，在自然界中具有重要的生态学作用，引起了人们广泛的关注并取得很大进展。从微生物中寻找发现新型先导化合物，是新农药研制的重要途径。内生菌作为微生物中的重要类群，其物种丰富，数量庞大，这为新农药的研究和开发提供了巨大的资源库。最近一个全面的研究显示，51%的从植物内生菌分离的生物活性物质是以前没有发现的化合物，而从土壤微生物发现的新物质仅为38%。由此

可见，研究植物内生菌，寻找具有农药活性的次生代谢产物，是研发新型无公害农药的重要途径，前景十分广阔。

一．样品采集及预处理

表面消毒：取健康番茄植株，剪碎，取根、茎、叶各3g，用清水洗净，分别在99%乙醇中重复3次，消毒60s、3.125%NaOH中消毒6min，99%乙醇中30s，再用灭菌生理盐水（0.9%）冲洗5次，最后用灭菌吸水纸吸干备用。

表面消毒效果：吸取最后一次洗涤生理盐水50ul涂布于NA平板上，28℃培养2d，若无菌落则消毒彻底。

二．内生放线菌分离、保存：

组织块法：已消毒植株组织，用灭菌手术刀切成0.5mm*0.5mm，接种于高氏一号培养基中，于28℃培养21d后，统计防线菌菌落并纯化。

组织匀浆法：已消毒植株组织3g，加10ml灭菌生理盐水在灭菌的研钵里研碎，静置15min，取50ul上清液，于高氏一号培养基中28℃培养2d，统计放线菌菌落并纯化。

挑取尖端菌丝转到高氏一号固体培养基中逐步纯化直至菌落形态单一稳定。纯化后的菌落再用灭好菌的接种环或牙签移入高氏一号液体培养基中培养待用。

三．菌株抑菌性能初筛：

1.琼脂块法：将被测放线菌菌株制备成悬液，稀释至适宜的浓度后涂布平板，培养2-3d 后用无菌打孔器将各小菌落琼脂块打下并移至室温中培养成熟，然后再移至敏感菌（番茄早疫病菌，番茄灰霉病菌）平板上测定各自抑菌圈大小。

2.发酵液法：将被测放线菌菌株分别接入三角瓶（装量为25ml/250ml），置28℃下震荡培养5-7d，用滤纸过滤去除菌丝体，滤液待测，即将发酵液加入牛津杯中或用6-8mm滤纸片（预先灭菌）均匀地吸足发酵液后放在含敏感菌（番茄早疫病菌，番茄灰霉病菌）的平板上，培养后测定各自抑菌圈的大小。

筛选能产生抑制圈的放线菌，接种于高氏一号培养基中，编号。

四．高抗灰霉病菌株复筛：

根据上述步骤，筛选除抑菌圈大的菌株做为高抗灰霉病菌株。

五．抑菌普测定：

1.真菌拮抗菌株筛选：抑制菌丝生长速率法。将10 mL 菌株发酵液与90 mL融化的培养基（PDA)混匀，倒入无菌培养皿中制成带毒培养基平面。培养基凝固后，在每个培养基平面放入1个供试菌菌饼(直径为4 mm)，使菌饼带菌丝的一面贴在培养基表面，28℃培养。每个处理3次重复。培养4d后，用十字交叉法测定供试菌菌落生长直径，计算抑制率。

对照菌落生长直径-处理菌落生长直径）抑制率：菌丝生长抑制率（%）=

对照菌落生长直径-菌饼直径

2.细菌拮抗菌株筛选：分别取10 mL混有植物病原细菌的牛肉膏蛋白胨培养基倒平板，凝固后将3个牛津杯放在其上，每管加发酵原液0.2ml，（蒸馏水为对照），置于恒温箱（25℃）培养。20 h后测量抑菌圈直径。

六．菌株鉴定：

1.形态学鉴定：取在高氏一号上培养7d的菌株的菌落边缘的菌块，大小5mm*5mm*2mm。置4%戊二醛中，4℃冰箱中过夜进行固定。用PH6.8的PBS缓冲液冲洗4-6次，每次30min，然后用系列丙酮脱水，每次30min；再用醋酸异戊酯置换2次；最后将样品置于CO2干燥器中进行临界点干燥，粘台，喷金后观察菌丝形态并照相。

培养基气生菌丝颜色基内菌丝颜色可溶性色素

高氏一号培养基

克氏一号培养基

蔗糖查氏培养基

葡萄糖酵母膏培养基

葡萄糖-天门冬素培养基

燕麦片琼脂培养基

无机盐-淀粉琼脂培养基

营养琼脂培养基

马铃薯琼脂培养基

2.培养特征：

生理生化特征结果生理生化特征结果

纤维素分解D-阿拉伯糖

明胶液化D-木糖

淀粉水解D-果糖

硫化氢产生D-半乳糖

黑色素产生L-鼠李糖

硝酸盐还原D-甘露糖

牛奶凝固棉籽糖

牛奶胨化蔗糖

D-葡萄糖肌醇

3.生理生化特征：

4.16SrDNA

七．稳定性测定：

1.菌株的传代稳定性：

将菌株在高氏一号培养基上每隔7d传代一次，传代10次，观察传代菌株培养特征，测定各代菌株发酵液抑菌活性。

2.菌株在不同温度条件下的稳定性：

单一菌株的菌落转接于2支大试管斜面上，分别在4℃和室温下保存，然后每隔一定时间，接种于高氏一号培养基上。用抑制菌丝生长速率法和管碟法测定抑菌活性。

3.菌株发酵液对酸碱的稳定性：

菌株发酵液，分别经1molHCL和1molNaOH调PH为2和12的溶液，静置12h，再用1molHCL和1molNaOH调至PH为6.5，测定其对病原菌的抑制率。重复三次。以无菌水和未经处理的发酵液做对照。

4.发酵液热稳定性：

发酵液，分别在60℃、70℃、80℃、90℃、100℃处理30min，用抑制菌丝生长速率法和管碟法测定抑制率。重复三次。以无菌水和未经处理的发酵液做对照。

八．活体检验分离的放线菌作用：

现在番茄植株上喷洒稀释10，20，30，40倍及未稀释的菌株发酵液，以喷清水为对照，24h后接种供试菌（番茄灰霉病菌）。每个处理3次重复，每重复三株番茄植株。7d后观察记录结果。

发酵液制备：菌种接种在高氏一号平面培养基上，28℃培养4d，将菌落转移至液体培养基，150r/min 28℃摇床上5d，过滤，即得发酵液，于4℃保存备用。

植物表面灭菌：

1.0.1%升汞（二氯化汞）浸泡10分钟，无菌水冲洗干净。取内生菌材料时不要最外边粘过升汞的地方

2.用次氯酸钠，和升汞完全相同的方法

3.无水乙醇浸泡，用火点燃酒精，直到燃烧自行熄灭。